Тема 5. Получение чистых культур. Изучение особенностей микроорганизмов с целью их идентификации (4 ч)

Идентификацию микроорганизмов проводят путем изучения морфологических, культуральных и физиологических свойств.

Морфологические свойства исследуются при микроскопировании, культуральные устанавливаются по особенностям роста на питательных средах (рис. 6), физиологические изучаются при выращивании на дифференциально-диагностических средах.

Работа 16. Получение чистой культуры бактерий

Оборудование: чашки Петри с колониями, полученными при анализе воздуха, микробиологические иглы, спиртовка, пробирки со стерильными питательными средами: МПА (СПА) прямой, МПА (СПА) косой, МПБ, МПЖ, молоко, картофельные среды.

Ход работы

Описание выбранной колонии

Описание проводят по схеме:

1. Размер колонии: точечные (Д меньше 1 мм), средние (Д – 2-4 мм), крупные (Д – 4-6 мм и более).

2. Форма (округлая, неправильная, амебовидная, ризоидная, мицелиальная).

3. Оптические свойства (прозрачная, матовая, флюоресцирующая, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая).

4. Цвет и выделение пигмента в среду.

5. Поверхность (гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая).

6. Профиль (плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный).

7. Край (ровный, волнистый, лопастной, ризоидный).

8. Структура (однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая, волнистая).

9. Консистенция (маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая).

Составив описание колонии, делают пересев в чистую культуру на твердые и жидкие среды.

Рис. 6. Характеристика колоний:

форма: а – округлая, б – неправильная, в – амебовидная, г – ризоидная, д – мицелиальная; профиль: а – плоский, б – выпуклый, в – кратерообразный, г – конусовидный; край: а – ровный, б – волнистый, в – лопастной, г – бахромчатый; структура: а – однородная, б – мелкозернистая, в – крупнозернистая, г – струйчатая, д – волнистая.

Пересев микроорганизма в чистую культуру

А. На прямой МПА (СПА) (микробиологической иглой):

1. Берут микробиологическую иглу в правую руку (рис. 7), прокаливают ее на пламени спиртовки, дают остыть, приоткрывают чашку Петри, дотрагиваются до агара (агар не должен плавиться), захватывают часть выбранной колонии.

Рис. 7. Посев культуры микроорганизмов в пробирки со средой:

а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;

в, г – взятие и посев материала; д – закрытие пробирок пробками

2. Тремя пальцами левой руки берут пробирку с агаром, мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из нее ватную пробку, обжигают края.

3. Вводят иглу в пробирку, вертикально делают укол почти до дна, вынимают иглу.

4. Обжигают горло пробирки и пробку, закрывают пробирку, этикетируют.

Б. На косой МПА (СПА) (микробиологической петлей):

1. Разогревают агар и размещают на подставке для косого наклона среды. Среда должна иметь наибольшую площадь и не должна касаться пробки.

2. Соблюдая те же правила, что и при посеве уколом, совершают посев штрихом по поверхности агара. Этикетируют.

Посев на дифференциально-диагностические среды

Из выращенной чистой культуры, соблюдая правила стерильности, производят посев на: 1 – МПБ, 2 – МПЖ, 3 – молоко, 4 – картофельную среду. В МПЖ – уколом иглой, в остальные – микробиологической петлей или шпателем Дригальского (рис. 8).

Рис. 8. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды в чашках Петри:

а – шпатель Дригальского; б – положение чашки и руки при посеве шпателем; в – рост микроорганизмов после рассева шпателем; г - рост микроорганизмов после рассева петлей

Работа 17. Окраска бактерий по Граму

Оборудование: пробирки с чистой культурой, обезжиренные предметные стекла, петли, спиртовка, кристаллизатор с подставкой, промывалка с водой, однопроцентный раствор кристаллвиолетта, раствор Люголя, 95-процентный этанол (ацетон), 0,1-процентный раствор фуксина, микроскоп с иммерсионной системой.

Ход работы

1. Тонкий мазок высушить, зафиксировать, нанести раствор кристаллвиолетта на 1-2 минуты.

2. Залить раствором Люголя на 1-2 минуты.

3. Промыть водой и этанолом (ацетоном) в течение 60 сек или в течение 10 сек.

4. Промыть водой. Докрасить фуксином 2 мин.

5. Высушить. Микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в малиновый.

Работа 18. Обнаружение капсул на негативном прижизненном

препарате

Оборудование: чистая культура, предметные стекла, карболовый фуксин Циля, черная тушь, спиртовка, петли, микроскоп.

Ход работы

1. Каплю культуры на предметном стекле окрасить фуксином в течение 2-3 минут.

2. Прибавить черную тушь, накрыть покровным стеклом.

3. Микроскопировать (рис. 9). Зарисовать в альбом.

Рис. 9. Капсулы у бактерий

Работа 19. Окраска спор

Оборудование: предметные стекла, петли, исследуемая культура, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллизатор с подставкой, промывалка с водой, однопроцентный раствор серной кислоты, пятипроцентный раствор хромовой кислоты, карболовый фуксин Циля, раствор метиленового синего (1:40), микроскоп с иммерсией.

Ход работы

1. Приготовить мазок, высушить, зафиксировать. Протравить пятипроцентным раствором хромовой кислоты в течение 5 минут.

2. Промыть водой, залить карболовым фуксином Циля. Окрашивать в течение 5 минут, нагревая над пламенем до появления паров и добавляя краситель.

3. Промыть, обесцвечивать в течение 2 минут серной кислотой.

4. Промыть, докрасить метиленовым синим в течение 10-15 минут.

5. Промыть, высушить, микроскопировать. Клетки должны быть синими, а споры - красными.

Работа 20. Обнаружение запасных включений

Оборудование: предметные и покровные стекла, петли, спиртовка, вода, пинцет, фильтровальная бумага, кристаллизатор с подставкой, микроскоп с иммерсией, метиленовый синий (1:40), раствор Люголя, судан III, 40-процентный формалин, исследуемая культура.

Ход работы