Глава 8

Возможности вакцинотерапии меланомы кожи

В.М. Моисеенко

Иммунизировать против рака так же трудно, как добиться отторжения правого уха, оставив левое W. Wogtom

Immunity to transplantable tumors // Cancer Res. - 1929. - Vol. 4. - P. 129.

«Вакцина против рака» - это термин, который a priori, с одной стороны, чрезвы­ чайно привлекателен для населения, а с другой, вызывает скептическую улыбку у про­ фессионалов. Почему?

У населения «вакцина» ассоциируется с успешным лечением и профилактикой инфекционных заболеваний и представляет старую мечту о предупреждении и излече­ нии с помощью одной инъекции. Большинство онкологов настроены пессимистично в отношении противоопухолевых вакцин в связи с тем, что в недавнем прошлом (60-70-е годы) проводились малоуспешные попытки применения в качестве вакцин целых уби­ тых опухолевых клеток у больных диссеминированными опухолями.

В отличие от вакцинаций при инфекционных заболеваниях, вакцинотерапия при раке имеет принципиально иную задачу, так как имеет целью индуцирование актив­ ного иммунного ответа против антигенов из собственных тканей. Несмотря на то, что опухолевые антигены могут присутствовать в организме на протяжении многих лет, они игнорируются иммунной системой по причинам, которые пока до конца не понятны.

Что такое вакцинотерапия рака и что происходит в мире на самом деле с этим методом в начале XXI века?

Вакцинотерапия рака имеет достаточно длительную историю, начиная с токсина Coley [21] и противоопухолевых антисывороток Hericourt и Richet (1895), неудачных попыток применения при диссеминированных опухолях аутологичных и аллогенных вакцин в 70-е годы XX века и кончая современными исследованиями с элементами генотерапии с модификацией антигенных характеристик опухолевых клеток.

По определению N. Restifo, M. Sznol (1997) «вакцинотерапия - это метод, осно­ ванный на использовании любого антигена или комплекса антигенов (с адъювантом или без него) для модуляции иммунного ответа».

Почему при злокачественном опухолевом росте нет полноценного иммунного ответа?

Возможное объяснение включает:

-низкую иммуногенность злокачественных опухолей;

-потерю антигенов некоторыми субпопуляциями опухолевых клеток;

-дефектами в механизме экспрессии главного комплекса гистосовместимости;

-местной иммунодепрессией вследствие секреции опухолевыми клетками неко торых цитокинов (интерлейкин-10, трансформирующий фактор роста-бета);

595

- периферическую локализацию опухолевых клеток, которая затрудняет попа­ дание большого количества опухолевого антигена в лимфоидные органы. Это может приводить к презентации опухолевого антигена без костимулирующих сигналов, след­ ствием чего является толерантность вместо активации.

Одной из главных причин считается недостаточная иммуногенность опухолевых клеток. Представляется, что опухолевые клетки могут образовываться в организме достаточно часто и, если они иммуногенны, то легко элиминируются иммунной систе­ мой. Опухолям, достигшим клинических размеров, уже ранее тем или иным способом удалось «ускользнуть» от иммунного надзора.

Одним из постоянных объектов для изучения вакцинотерапии является меланома - опухоль, растущая из меланоцитов. На ранних стадиях меланома эффективно лечится с помощью хирургического метода. Однако диссеминированная меланома под­ дается терапии чрезвычайно плохо. Только у очень ограниченной группы больных с помощью стандартной химио-, лучевой и биотерапии удается добиться лечебного эф­ фекта.

Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены.

В последние годы было описано несколько антигенов, представляемых Т-лимфо- цитам на основе молекул главного комплекса гистосовместимости I класса [1]. Эти антигены подразделяются на:

-раково-тестикулярные антигены (MAGE);

-меланоцитные дифференцирующие антигены (тирозиназа, тирозиназа-связан- ные белки TRP-1 /-2, MelanA/MART-l, gplOO и gp75);

-антигены, образующиеся вследствие мутации генов или повышенной экспрес­ сии нормальных генов, так называемые индивидуальные антигены [18].

Специфический клеточный иммунный ответ на меланомные антигены классически происходит путем узнавания чужеродных пептидов рецепторами Т-клеток посредством молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) дендритных клеток. Эти пеп­ тиды, получаемые путем процессинга экзогенных (экстрацеллюлярных) или эндоген­ ных (внутриклеточных) антигенов, представляются дендритными клетками специфи­ ческим Т-клеткам в регионарных лимфатических узлах. Белки при этом разделяются на короткие фрагменты, состоящие из 8-10 аминокислот для МНС класса I и по 13-18 аминокислот - для МНС класса И. Молекулы МНС класса I взаимодействуют с CD8 клетками для стимуляции цитотоксического Т-клеточного ответа, тогда как молекулы МНС II класса активируют соответствующие CD4 хелперы с целью индукции гумо­ рального иммунного ответа [15].

Различие только по одной аминокислоте в этих маленьких пептидах оказывает огромное влияние на это взаимодействие, так как изменяется расположение пептида в пространственной «ячейке» МНС и узнавание комплекса МНС/пептид рецепторами Т-лимфоцитов будет нарушено вследствие этих пространственных изменений.

Раково-тестикулярные антигены MAGE 1, 2 и 3 экспрессируются опухолями раз­ личных гистологических типов. Они были первыми опухолеассоциированными анти­ генами, выделенными из клеток меланомы [ 1 ]. Их обнаруживают также в нормальных яичках и яичниках у взрослых. По этой причине они получили свое название.

Меланомные дифференцирующие антигены. Основными меланоцитными анти­ генами являются Melan-A/MART-1, тирозиназа и gp 100. Они экспрессируются как нормальными, так и малигнизированными меланоцитами, и иммунный ответ против этих мишеней ассоциируется с развитием аутоиммунной реакции против нормальных меланоцитов [12]. Клиническим проявлением этого является витилиго. В связи с тем,

596

Глава 8 Возможности вакцинотерапии иеланоиы кожи

что эти гены не экспрессируются а опухолях другого происхождения, вакцинация про­ гни них может позволить добиться относительной тканевой специфичности иммунно­ го ответа.

Кроме перечисленных универсальных опухолеассоциироваиных антигенов, мо­ гут быть так называемые уникальные, или индивидуальные антигены. Эти антигены экспрессируются опухолевыми клетками и обычно являются следствием мутаций только у конкретного больного меланомой.

Особенностью перечисленных опухолеассоциированных антигенов является рестриктивность презентации отдельных антигенов МНС I и II класса, а также возмож­ ность представления отдельных эпитопов одного антигена разными поверхностными молекулами АШС.

Перечисленное объясняет, почему меланома является основным объектом для оценки эффективности различных методов биотерапии. В пользу этого говорят также:

-многочисленные документированные доказательства случаев спонтанного рег­ ресса, в основе которых лежат иммунологические механизмы,

-клиническая эффективность ряда цитокинов (интерферона-с и интерлейки- на-2) при метастатической меланоме.

Все методы биотерапии классифицированы S. Rosenberg [23] следующим обра­

зом:

I группа - активная иммунотерапия:

-неспецифическая иммунотерапия (BCG, С. parvum, левамизол, интерферон,

ИЛ-2),

-специфическая иммунотерапия (вакцинотерапия).

II группа - пассивная иммунотерапия:

- антитела (моноили поликлональные антитела или конъюгаты с токсинами и изотопами),

- клетки (опухольинфильтрирующие лимфоциты или TIL, лимфокинактивированные киллеры или LAK).

III группа - непрямые методы:

- удаление или блокирование факторов роста или ангиогенеза.

IV группа* - высокодозная неаблативная химиотерапия с аллогенной транс­ плантацией элементов костного мозга.

В центре внимания настоящей лекции находится активная специфическая им­ мунотерапия, или вакцинотерапия.

Условно противоопухолевая вакцинотерапия подразделяется на следующие группы.

1. Вакцины на основе цельных клеток: - аллогенные; - аутологичные.

2.Аутологичные белки теплового шока.

3.Ганглиозиды.

4.Синтетические пептиды.

5.ДНК.

6.Рекомбинантные вирусы.

7.Вакцины на основе дендритных клеток.

Рассмотрим последовательно перечисленные методы вакцинотерапии.

Указанная группа выделена позже.

597

ЧАСТЬ VII МЕЛАНОМА

Аллогенные клеточные вакцины

Вакцины на основе цельных клеток могут быть разделены на две подгруппы: ал­ логенные и аутологичные.

Использование аллогенных опухолевых вакцин базируется на представлении, что клетки из опухоли одного типа от разных индивидуумов могут иметь общие опухолеассоциированные антигены, которые способны индуцировать значимый иммунный от­ вет. Аллогенные вакцины получают из клеточных линий, подобранных таким образом, чтобы обеспечить максимальное представительство опухолеассоциированных антиге­ нов и широкий спектр экспрессии МНС. Аллогенные вакцины легко приготавливать, они содержат множество потенциальных антигенных мишеней (в том числе еще не идентифицированных). Последние открытия в области механизма презентации анти­ генов и активации Т-клеток позволили получить дополнительные данные о целесооб­ разности использования аллогенных противоопухолевых вакцин. На животных моде­ лях антигенпрезентирующие клетки костномозгового происхождения показали спо­ собность эндоцитоза опухолевых антигенов и представления их как CD4+, так и CD8+ Т-клеткам. Этот эффект получил название «cross-priming» [10]. Однако для индукции противоопухолевого иммунного ответа опухолевые клетки в вакцине должны совпа­ дать с МНС гаплотипом реципиента.

Аллогенные вакцины на основе цельных клеток в течение многих лет изучались несколькими исследовательскими группами. Имеются научно обоснованные доказатель­ ства того, что этот тип вакцинации может индуцировать образование антител к несколь­ ким меланомным антигенам, включая ганглиозиды и дифференцирующие антигены.

Наиболее изученной считается вакцина CancerVax. Это аллогенная, живая вак­ цина, полученная из трех облученных меланомных клеточных линий, выбранных на основе высокой экспрессии иммуногенных антигенов. CancerVax содержит МНС гаплотипы, совместимые с 95% пациентов с меланомой. Вакцинация предполагает индук­ тивную (5 доз х каждые 2 нед в течение 2 мес, одновременно первые 2 введения прово­ дятся вместе с BCG) и поддерживающую фазы (каждые 4 нед в течение 12 мес, затем каждые 2 мес в течение второго года и каждые 3 мес до 5 лет). Клинические исследова­ ния показали минимальную токсичность CancerVax, а исследования по II фазе у боль­ ных с диссеминированной меланомой кожи выявили значимое увеличение 5-летней выживаемости по сравнению с историческим контролем. Этот показатель для боль­ ных, получавших вакцину, составил 42% и медиана выживаемости 42 мес, тогда как в историческом контроле аналогичные показатели равнялись 19% и 18 мес [9].

Другим вариантом аллогенной вакцины является Melacine. В настоящее время про­ водятся рандомизированные клинические исследования обоих препаратов по III фазе.

Вариантом аллогенной вакцины является использование антигенов, выделяемых аллогенными клеточными линиями меланомы [2].

Как установлено, подобным способом можно индуцировать продукцию антител и Т-клеточный ответ против многих антигенов, экспрессируемых клетками меланомы [22]. Оценка эффективности подобной вакцины в условиях рандомизированного исследова­ ния показала увеличение в 2 раза показателей безрецидивной и общей выживаемости в группе больных, подвергшихся вакцинотерапии, по сравнению с контролем (безре­ цидивная выживаемость: 18,6 мес и 7,1 мес; 2-летняя выживаемость: 77 и 60% соот­ ветственно) [3]. К сожалению, исследование было преждевременно прервано из-за труд­ ностей с набором больных.

Третьим направлением, основанным на использовании аллогенной вакцинотера­ пии, является применение вирусного опухолевого лизата. Для этого использовались

598

Возможности вакцинотерапии иеланоиы кожи

непатогенные вирусы Vaccinia virus и Newcastle disease virus, которые лизировали клетки и потенцировали их иммуногенность (вирусный меланомный онколизат). Подобная вакцина содержит многие опухолеассоциированные антигены и способна стимулировать поливален­ тный иммунный ответ. Однако клиническое изучение вакцины в условиях рандомизирован­ ных исследований, проведенноеМ.К. Wallack и соавт. [28] и P. Hersey [8), не показало увели­ чения показателей безрецидивной и общей выживаемости по сравнению с плацебо.

Вакцины на основе аутологичных клеток

Основными преимуществами аутологичных клеточных вакцин являются:

-идентичность по МНС гаплотипу реципиента,

-возможность обеспечения вакцинации с помощью уникального набора антиге­ нов, характерных для данного пациента.

Основными недостатками подобного подхода являются:

-необходимость получения опухолевого материала у больного;

-трудоемкость приготовления вакцины;

-трудность стандартизации процесса приготовления вакцины;

-низкая иммуногенность антигенов, экспрессируемых опухолевыми клетками. Аутологичные вакцины могут быть немодифицированными и модифицированными. Первые исследования с немодифицированными аутологичными опухолевыми

клетками проводились в 70-е годы (см. табл. 7.8.1.).

Результаты этих исследований, с одной стороны, свидетельствуют о низкой эф­ фективности метода при метастатической меланоме кожи, с другой стороны - о прин­ ципиальной возможности получения с помощью противоопухолевых вакцин объектив­ ных лечебных эффектов, в том числе с полным исчезновением или уменьшением более чем на 50% клинических проявлений заболевания (полный регресс, частичный рег­ ресс). Вместе с тем, зарегистрированная эффективность оказалась значительно ниже, чем ожидалось исследователями, что и послужило причиной временного отказа от ис­ пользования этого метода. Более того, некоторыми исследователями были отмечены случаи прогрессирования опухоли, которые они связали с введением вакцины, что яви­ лось причиной широкого распространения среди онкологов ошибочного мнения о воз­ можности стимуляции роста злокачественных опухолей.

Учитывая низкую эффективность вакцины из аутологичных клеток при диссеминированных опухолях, проводится клиническая оценка этого метода у больных с высо­ ким риском рецидива заболевания после радикальной операции (адъювантная тера­ пия).

С целью повышения иммуногенности аутологичных опухолевых клеток предпри­ нимаются шаги по внедрению в генетический аппарат опухолевых клеток генов, ответ­ ственных за продукцию ряда цитокинов (модифицированные аутологичные вакцины).

Таблица. 7.8.1.

Эффективность активной иммунотерапии с помощью вакцин у больных метастатической меланомой кожи

599

ЧАСТЬ VII МЕЛАНОМА

Как показали исследования G. Dranoff и соавт. [6], наиболее подходящим для этой цели является гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), который обладает наибольшей способностью потенцировать отторжение опухоли в мы­ шиной модели меланомы В16. Клиническое изучение аутологичных вакцин с трансфекцией гена GM-CSF показало, что подобное лечение сопровождается индуцирова­ нием как локального воспалительного процесса, так и воспалительного процесса в ме­ стах локализации отдаленных метастазов. При этом сообщается об отдельных клини­ ческих эффектах, однако окончательное заключение о действительной эффективнос­ ти метода возможно только после проведения полноценного рандомизированного ис­ следования с продолжительным наблюдением за больными.

Ганглиозные вакцины

Очевидно, что противоопухолевая вакцина, приготовленная на основе опреде­ ленных антигенов, имеет ряд преимуществ:

-простота оценки специфического иммунного ответа,

-большая потенциальная иммуногенность,

-возможность прослеживания типа иммунного ответа на конкретный антиген. В ряде предклинических и клинических исследований показана способность ан­

тител, образование которых индуцировано подобной вакциной, элиминировать цирку­ лирующие опухолевые клетки и микрометастазы (адъювантное применение). Мише­ нью этих антител являются поверхностные антигены. На поверхности меланомных клеток наиболее интенсивно экспрессируются ганглиозиды. Ганглиозиды являются гликолипидами, содержащими как нейтральные сахара, так и сиаловые кислоты. Извест­ но несколько ганглиозидов: GM3, GD3 (основной меланомный ганглиозид), GD2, GM2 и О-ацетил GD3 [30].

GM2 является наиболее иммуногенным меланомным ганглиозидом и по этой при­ чине объектом большинства клинических исследований. Уже первые работы показы­ вали тесную связь между наличием в сыворотке больных антител против GM2 и уве­ личением безрецидивной и общей выживаемости. В исследовании P.O. Livingston и соавт. [13] 122 больных меланомой кожи III стадии с высоким риском рецидива заболе­ вания после операции получали на рандомизированной основе GM2 и BCG или только BCG. Образование aHTH-GM2 IgM было обнаружено у 85% леченых больных. Анализ показателей выживаемости не выявил достоверных различий между обеими группа­ ми. Однако при исключении из анализа больных, у которых имелись антитела против GM2 до начала лечения, прослеживались достоверные преимущества с точки зрения выживаемости у больных, иммунизированных с помощью GM2/GCG (р=0,02). Это было первым клиническим рандомизированным исследованием, в котором было пока­ зано, что индуцирование образования антител против ганглиозидов коррелирует у боль­ ных меланомой с клиническим эффектом. В последующем была разработана новая форма вакцины на основе GM2, связанная с адъювантом (GMK). Эта форма вакцины сопровождается образованием антител у 100% больных [7].

Эффективность GMK вакцины оценивалась у больных меланомой в мультицентровых рандомизированных исследованиях по сравнению с интерфероном-а. Первые 16 мес наблюдения за больными не показали увеличения показателей безрецидивной и общей выживаемости больных.

Одной из причин отсутствия значимого лечебного эффекта, вероятно, является то, что ганглиозид GM2 экспрессируется на поверхности всех меланомных клеток,

600

Возможности вакцинотерапии иелаионы кожи

но степень его экспрессии незначительна по сравнению с другими ганглиозидами. Менее 20% меланомных клеточных линий могут быть лизированы моноклональными антителами к GM2 и комплементу. Поэтому для получения клинически значимого ре­ зультата необходимо индуцирование образования антител против других ганглиозидов. В этой связи очевидна целесообразность использования поливалентных вакцин на основе нескольких ганглиозидов.

Другим оригинальным подходом является использование вакцин, содержащих антиидиотипические моноклональные антитела, которые имитируют ганглиозиды. Предпринимаются также попытки комбинированного использования этих конъюгатов и антидиотипических вакцин. Этот способ активной специфической иммунотерапии проходит предклинические и клинические испытания.

Пептидные вакцины

Современные биотехнологические методы позволяют получать синтетические опухолеассоциированные антигены в необходимых количествах.

Первая вакцина на основе синтетических пептидов содержала белки, представ­ ленные основными HLA подтипами [19]. К сожалению, этот подход имел серьезный недостаток, связанный с короткой полужизнью пептидов и их способностью связы­ ваться с молекулами HLA in vivo. Повышение иммуногенности этих пептидов может быть достигнуто путем прямого их введения в лимфатические узлы и селезенку. Имеются убедительные экспериментальные доказательства того, что пептиды, пред­ ставляемые иммунной системе в течение нескольких дней, являются высокоиммуногенными. По этой причине проводятся исследования интранодального введения пеп­ тидов, в том числе с костимулирующими факторами (GM-CSF).

Одним из первых было проведено исследование MAGE-3, являющегося пепти­ дом, рестриктивным HLA-A1 гаплотипу [16]. Лечебный эффект был зарегистрирован у 6 из 19 больных. Это исследование убедительно показало, что синтетические пептиды являются безопасным и перспективным методом вакцинотерапии. Цитотоксичность Т-лимфоцитов против меланомных клеток обратно коррелирует с экспрессией антиге­ на в тканях меланомы. У больных с прогрессированием на фоне вакцинотерапии на­ блюдались варианты с потерей антигена, что позволяет предположить возможность иммуноселекции опухолевых клонов на фоне вакцинации [11].

Ряд исследований был выполнен в Национальном институте рака (США) по изу­ чению пептидов, полученных из меланомного дифференцирующего антигена gplOO. Первоначально лечение проводилось HLA-A2 + пациентам с помощью нативного пеп­ тида, но в последующем другая группа больных получала лечение белком, в котором изменена одна аминокислота. Этот пептид имеет аффинность к HLA-A*201 выше, чем нативный, что послужило основанием предполагать возможно большую индукцию Т-лимфоцитарного ответа [20]. После введения ИЛ-2 в периферической крови эти Т-лимфоциты не обнаруживались, но лечебный эффект наблюдался, что позволило пред­ положить их миграцию в места локализации антигена.

Было также проведено несколько клинических исследований, в которых пред­ принимались попытки иммунизировать больных меланомой с помощью белков, полученных из раково-тестикулярных антигенов или дифференцирующих анти­ генов.

Вакцины на основе синтетических пептидов считаются одним из наиболее инте­ ресных методов иммунотерапии и активно изучаются в клинике.

601

Вакцины на основе белков теплового шока

В последние несколько лет большое внимание, с точки зрения возможности ге­ нерирования противоопухолевого иммунного ответа, уделяется белкам теплового шока (heat-shock proteins). Эти белки являются устойчивыми внутриклеточными мо­ лекулами, которые, как установлено, несут потенциально иммуногенные пептиды [25]. Известно, что белки теплового шока играют важную роль в индукции иммунного от­ вета, механизм, лежащий в основе их действия, пока неизвестен. Одна из гипотез предполагает специфическое связывание этих белков на поверхности антигенпрезентирующих клеток с последующим эндоцитозом и представлением эндосомы по­ средством МНС класса Ш [4].

В ряде клинических исследований уже изучался подобный подход, в том числе при меланоме. При этом из удаленной опхуоли выделялись белки теплового шока (в первую очередь HSP96) и вводились внутрикожно. Как показали результаты, этот метод безопасен и способен индуцировать противоопухолевый иммунный ответ. В настоящее время предпринимаются попытки комбинированной вакцинации на ос­ нове рекомбинантного белка теплового шока (HSP70) совместно с тиразиназой gp 100.

ДНК вакцины

Иммунизация плазмидой ДНК, которая кодирует антиген из меланомной клет­ ки, является одним из новых способов индукции образования антител и Т-клеточно- го ответа. Плазмида вводится в кожу или мышцу путем инъекции, где индуцирует локальную воспалительную реакцию, и в последующем захватывается профессио­ нальными антигенпрезентирующими клетками. Как антиген попадает в антигенпрезентирующую клетку, точно неизвестно.

Этот вид вакцинотерапии имеет ряд достоинств [24]:

-ДНК легко получать в больших количествах,

-наличие комплементарной ДНК полной длины обеспечивает множественные потенциальные эпитопы и поэтому позволяет избегать необходимости МНС-рестрик­ ции.

Вэксперименте показано, что иммунизация мышей ксеногенной (человеческой) ДНК-вакциной, кодирующей gplOO, gp75, TRP-1 и TRP-2, приводит к защите от сингенной мышиной меланомы В16, а также сопровождается быстрой и распространен­ ной депигментацией шерсти[29].

Вклинических исследованиях при инфекционных заболеваниях ДНК-вакцина­ ция оказалась безопасной и высокоэффективной с точки зрения развития иммунного ответа при малярии.

Внастоящее время проводятся исследования, в которых больные с меланомой иммунизируются ДНК-кодированными антигенами (тирозиназа и gplOO).

Вариантом ДНК-вакцинации считается использование рекомбинантных вирус­ ных вакцин и минигенных вакцин. Рекомбинантные вирусы (poxvirus, adenovirus) изготавливаются таким образом, что содержат разные антигены меланомных клеток. Эта методика имеет преимущества, связанные с иммуногенными свойствами вирус­ ных векторов. Основную проблему представляют предсуществующая или генериро­ ванная иммуногенность к самому вектору. Это особенно важно при повторных иммунизациях. Выходом из положения является использование «голой» ДНК.

602

ЧАСТЬ VII МЕЛАНОМА

Рекомбинантные вирусные вакцины

Рекомбинантные вирусные вакцины (аденовирусы) могут использоваться для доставки меланомных антигенов. Эти вирусы имеют очень высокую адъювантную ак­ тивность, но нейтрализующие антитела могут блокировать этот тип вакцины.

С аналогичной целью использовались также на животных моделях отдельные линии бактерий сальмонеллы и листерии. Листерия представляется наиболее перс­ пективной для доставки антигена для HLA класса I и II (активация CD4 и CD8). Дру­ гим преимуществом этих вакцин является возможность перорального применения. Этот подход в настоящее время оценивается в клинических исследованиях по I и II фазах.

Для повышения эффективности вакцин используются различные адъюванты: BCG, С. parvum, alum, компоненты бактериальных стенок и др. Механизм их действия заключается в индуцировании местной воспалительной реакции с активацией «про­ фессиональных» антигенпрезентирующих клеток, цитокинов, Т- и В-лимфоцитов.

Очень перспективным в качестве адъюванта считается гранулоцитарно-макро- фагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), который обладает способнос­ тью потенцировать выживание и экспансию дендритных клеток [5].

Наблюдаемый в последнее время всплеск интереса к вакцинотерапии злокаче­ ственных опухолей не случаен. Он связан со значительными успехами в области гене­ тики, молекулярной биологии, иммунологии, которые углубили современные представ­ ления об иммунологии опухоли, механизмах канцерогенеза и регуляции опухолевого роста и подтвердили перспективность развития активной специфической иммунотера­ пии.

Предклинические модели и клинические исследования показывают, что исполь­ зование вакцинотерапии представляется оптимальным после максимального хирурги­ ческого удаления опухолевых клеток, т.е. с адъювантной целью. Кроме того, в связи с гетерогенностью экспрессии опухолевых антигенов в меланомах у разных больных и даже в разных клетках в одном метастазе, существенного прогресса от этого метода можно ожидать после достижения иммунного ответа против нескольких антигенов одновременно. Поэтому весьма перспективно использование в первую очередь поли­ валентных вакцин.

Большую сложность в проведении клинических исследований по вакцинотера­ пии представляет определение конечных целей. Большинство пациентов в такие ис­ следования попадают уже после проведения лечения различными методами, имея не­ сомненные признаки иммуносупрессии. Очевидно, что иммунотерапия должна быть более эффективна у больных с небольшой опухолевой массой, например, после хирур­ гического лечения в случае высокого риска рецидива заболевания. Выполнение таких исследований с конечной целью оценки времени до прогрессирования или выживаемо­ сти требует большого числа больных и длительного времени наблюдения. Это оправ­ дано в том случае, если результаты лечения больных с местнораспространенными или метастатическими формами рака по II фазе показали высокую клиническую активность метода. Между тем, очевидно, что эффективность вакцинотерапии ниже у больных, обычно включаемых в исследования по II фазе. Это чрезвычайно затрудняет выбор кан­ дидатов для III фазы, так как отсутствие эффективности при распространенных фор­ мах не означает отсутствие эффекта при применении с адъювантной целью.

Таким образом, в начале XXI века вакцинотерапия меланомы, как и 70 лет назад, по-прежнему остается очень перспективным, но по-прежнему экспериментальным ме­ тодом лечения.

604

Глава 1 Современные представления

о канцерогенезе рака шейки матки

К.П. Хансон, Е.Н. Имянитов

Папилломавирусы человека (human papillomaviruses, HPV) составляют своеоб­ разную группу ДНК-содержащих вирусов, характеризующихся тропизмом к эпителию

ивызывающих субклинические формы инфекции, которая, однако, может приводить к такому серьезному последствию, как рак шейки матки (РШМ) [1, 12]. Поэтому неслу­ чайно одним из важнейших достижений в изучении этиологии рака принято считать установление факта причинной связи между HPV-инфекцией и РШМ [12]. Это откры­ тие по своей значимости находится в одном ряду с обнаружением роли табакокурения при раке легкого, а также роли хронической вирусной инфекции при гепатитах В (HBV)

иС (HCV) в этиологии первичного рака печени. Как и в отношении заболеваний, обус­ ловленных HBV и HCV, предпринимаются серьезные усилия, направленные на поиск новых методов диагностики HPV и создание эффективных профилактических и лечеб­ ных вакцин против данной группы вирусов [14].

Внастоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 000 новых случаев РШМ. Большинство из них приходится на развивающиеся страны, тем не менее, РШМ остается серьезной проблемой и для индустриально развитых стран. Так, например, в Англии выявляется 13,7 случаев РШМ на 100 000 женщин, причем 5 из них заканчива­ ются смертельным исходом. В США заболеваемость РШМ составляет 8,3 на 100 000, что составляет 14 000 новых случаев и 5 000 смертей в год [28].

Хотя вариации встречаемости РШМ могут быть частично объяснены географичес­ кими различиями и некоторыми другими факторами риска, главную роль в снижении забо­ леваемости в развитых странах играет внедрение скрининговых программ. Данный факт еще раз подчеркивает тесную связь РШМ с HPV-инфекцией. Сегодня имеющаяся сово­ купность эпидемиологических и экспериментальных данных позволяет однозначно утвер­ ждать, что РШМ относится к заболеваниям, обусловленным вирусной инфекцией, кото­ рая передается половым путем [12]. Заметим, что при РШМ в 90-100% случаев в опухо­ левом материале обнаруживается ДНК HPV, в то время как инфицированность в популя­ ции здоровых женщин не превышает 5-20% [12]. Исследования последних лет показали, что 95% неоплазм шейки матки содержат разновидности HPV, принадлежащие к так на­ зываемым типам «высокого риска» (HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33 и HPV45) [26].

Не вызывает сомнений, что вывод об этиологической роли HPV при РШМ имеет не только важное теоретическое, но также и непосредственное практическое значение.

Во-первых, становится актуальным формирование групп риска, в которые, преж­ де всего, должны попадать постоянные носительницы HPV-инфекции, а разнообраз­ ные социально-экономические факторы, которым ранее придавали ведущую роль, дол­ жны рассматриваться как второстепенные.

Во-вторых, основные превентивные меры должны быть направлены на борьбу с HPV-инфекцией, и именно в этом контексте следует рассматривать внедрение в дан­ ную область современных технологий.

609

Современные представления о канцерогенезе рана шейки матки

Ведущая роль в канцерогенном цессе принадлежит белкам Е1, Е2, Е6 и Е7 [2,46]. По-видимому, процесс реализации туморогенного потенциала HPV состоит из нескольких последовательных генети­ ческих событий. Вероятно, в качестве инициирующего фактора выступают мута­ ции в различных участках гена Е1, кото­ рый в норме отвечает за эписомальный статус HPV-ДНК. В результате поврежде­ ния Е1 происходит интеграция генома HPV в хромосомы клетки-хозяина. Процесс встраивания генома HPV может сопровождаться инактивацией еще одно­ го вирусного гена - Е2. В результате по­ тери функциональной активности гена Е2 увеличивается экспрессия генов Е6 и Е7, которые непосредственно запускают про­ цессы опухолевой трансформации. Онкогенные свойства продуктов Е6 и Е7 обус­ ловлены их способностью образовывать комплексы с негативными регуляторами

клеточного роста - белками р53 (для Е6) и Rb (для Е7). Существенно, что белки Е6 и Е7 разных типов HPV могут отличаться друг от друга по своим биохимическим свой­ ствам и трансформирующему потенциалу.

Остановимся несколько более подробно на характеристике белков HPV и их роли в канцерогенном действии на клетки эпителия шейки матки [35].

Белок Е6 HPV-16 состоит из 151 аминокислоты и инициирует ряд важных про­ цессов, способствующих клеточной иммортализации. Поскольку Е6 является одним из наиболее ранних генов, экспрессирующихся в ходе HPV-инфекции, он создает ус­ ловия для более интенсивной продукции вирусных частиц в клетке. Эти изменения внутриклеточной среды включают подавление апоптоза вследствие деградации белка р53, ингибирование транскрипции ряда клеточных генов, а также удлинение продол­ жительности жизни клеток за счет активации теломеразы.

Белок Е7 играет наиболее важную роль в трансформации клеток. Е7 представ­ ляет собой ядерный белок, состоящий из 98 аминокислот и содержащий два казеинкиназных сайта фосфорилирования сериновых остатков (в 31 и 32 положениях). Молекула белка разделена на три домена, различающихся по степени сродства к аде­ новирусному белку Е1 А. Описаны различные пути взаимодействия Е7 с клеточными белками. Многие из этих белков относятся к факторам, регулирующим клеточное деление. Е7 ускоряет переход G1 —S и взаимодействует с белками семейства RB-cyn- рессора (Rb, р 107, р 130), деацетилазами гистонов, транскрипционным фактором АР-1, циклин-зависимыми киназами и CDK-ингибиторами. Эти взаимодействия объясня­ ют способность Е7 стимулировать пролиферацию клеток, а также вызывать их иммортализацию.

Белок Е5 HPV-16 невелик по размеру (84 аминокислоты) и представляет собой гидрофосфатную молекулу, локализованную в клеточной мембране. Белки Е5, выде­ ленные из клеток человека и животных, отличаются по своей трансформирующей ак­ тивности. Вследствие гидрофобной природы Е5 его очистка весьма затруднительна,

611

ЧАСТЬ VIII

РАН ШЕЙКИ МАТКИ

и это его свойство ограничивает возможности создания эффективного антигена про­ тив данного белка.

Белки Е1 и Е2 играют существенную роль в репликации вирусных частиц. Именно эти белки определяют число копий вируса в клетке хозяина. Однако механизм транс­ крипционного контроля синтеза самих Е1 и Е2 остается невыясненным.

Итак, биологические свойства и молекулярная структура HPV-белков изучены достаточно полно, тем не менее конкретные пути реализации канцерогенного эффекта вируса требуют еще дальнейшего уточнения.

Известно, что как канцерогенные, так и неканцерогенные типы HPV стимулиру­ ют клеточную пролиферацию, причем этот эффект осуществляется по весьма сходным, но не идентичным механизмам. Кроме того, степень сродства Е7 к Rb и Е6 в отношении р53 значительно выше у белков, выделенных из канцерогенных типов HPV. Углублен­ ное изучение различий между двумя принципиально различными типами HPV может дать ключ к разгадке механизма канцерогенного действия вирусов данной группы, а также проблемы вирусного канцерогенеза в целом.

Патогенез и клинические проявления генитальной HPV-инфекции

Основной путь передачи генитальной HPV-инфекции - половые контакты [47]. Попадая в организм, HPV локализуется в базальном клеточном слое эпителия, кото­ рый представляет собой популяцию делящихся клеток. По мере эпителиальной диф­ ференциации геном папилломавирусов проходит все стадии продуктивной инфекции. Этот процесс завершается в зрелых кератиноцитах. Такая форма инфекции приводит к цитопатическим эффектам, проявляющимся в форме коилоцитоза, остроконечных кон­ дилом и т.д. [7,47, 54]. Как показывают многочисленные эпидемиологические исследо­ вания, в большинстве случаев наблюдается достаточно длительная персистенция HP V ДНК в клетках базального слоя эпителия [23]. Дальнейшая динамика HPV-инфекции может заключаться либо в ее регрессии, т.е. элиминации вирусного пула клеток, либо, наоборот, в прогрессии, сопровождающейся включением HPV-ДНК в клеточный ге­ ном и появлением характерных для злокачественной трансформации морфологичес­ ких изменений эпителия.

В практической медицине принято различать клиническую, субклиническую и латентную формы генитальной HPV-инфекции [23,48,52,54]. Клиническая форма HPVинфекции характеризуется четко выраженной картиной поражения эпителия генитального тракта и легко диагностируется при простом визуальном осмотре. К типичным морфологическим проявлениям HPV-инфекции относят злокачественные новообразо­ вания, а также остроконечные и гладкие кондиломы, расположенные в области шейки матки, вагины, вульвы или ануса [48, 55, 58]. Субклиническая HPV-инфекция, как пра­ вило, не выявляется при визуальном обследовании, однако соответствующие измене­ ния эпителия обнаруживаются посредством цитологического и гистологического об­ следований [7, 21 ]. И, наконец, латентная форма HPV-инфекции выявляется только с помощью молекулярно-генетических методов [34, 57].

Лабораторная диагностика HPV-инфекции

Длительное время единственным методом ранней диагностики папилломавиру­ сов являлось цитологическое исследование, основанное на поиске характерных ДЛЯ

612

Глава 1 Современные представления о канцерогенезе рака шейки натки

HPV-ннфекцин цитологических изменений эпителия, таких как коилоцитоз, дискератозит.д. [7, 21). Однако подобный подход зачастую дает ошибочные результаты, отли­ чается высоким субъективным компонентом и не выявляет латентные формы HPVинфекцпп [21, 32, 48]. В целом, диагностика HPV стала достоверной лишь с появлени­ ем методик, основанных на детекции нуклеиновых кислот - гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы детекции HPV на основе гибридизации ДНК

В зависимости от целей и возможностей лабораторий широко применяются раз­ личные техники гибридизации, такие как Саузерн-блот, дот-блот, in situ, filter in situ и т.д. [17, 57]. Все они основаны на использовании HPV-ДНКв качестве молекулярного зонда, предварительно меченного радиоактивной или биохимической меткой.

Бесспорными преимуществами в детекции HPV обладает метод Саузерн-блот гиб­ ридизации. По сравнению с другими, этот метод характеризуется высокой чувствитель­ ностью, специфичностью и информативностью [57]. При осуществлении Саузерн-блота клеточная ДНК обрабатывается специфическими эндонуклеазами рестрикции, и полу­ ченные фрагменты с помощью электрофореза разделяются в агарозном геле. После де­ натурации ДНК переносится на мембрану, которая в дальнейшем гибридизуется с мече­ ным HPV-зондом. При оптимальном подборе специфических зондов и условий гибриди­ зации можно получить сведения о физическом статусе HPV-ДНК в клетке, типах HPV, филогенетической взаимосвязи папилломавирусов и т.д. [10, 30, 32, 57]. Недостатками данного метода являются трудоемкость и длительность выполнения процедуры, а также необходимость использования относительно больших количеств биологического мате­ риала для анализа. Эти факторы затрудняют использование Саузерн-блот гибридизации для рутинной диагностики и решения задач скрининга.

Гибридизация in situ позволяет установить топографическую взаимосвязь между вирусом и тканью, так как является единственным методом, который не разрушает мор­ фологию образца. Однако в сравнении с другими техниками, гибридизация in situ обла­ дает недостаточной чувствительностью. По данным разных авторов, при использовании такого подхода частота выявления вируса в тканях с субклиническими признаками HPVинфекции составляет от 0 до14% [48], в то время как по результатам Саузерн-блот гиб­ ридизации этот показатель достигает 36% [57]. При выполнении техники filter in situ клеточный материал (мазок, смыв) отпечатывается на мембране, денатурируется in situ и затем гибридизуется с меченым зондом. К сожалению, данная методика также проиг­ рывает в чувствительности и специфичности по сравнению с остальными [17, 57].

Следует подчеркнуть, что методики, основанные на реакции гибридизации, ме­ нее чувствительны к контаминации, чем ПЦР-диагностика. Поэтому они являются ме­ тодом выбора в тех условиях, когда правильная организация ПЦР-лаборатории невоз­ можна, или когда положительные результаты ПЦР-теста вызывают сомнения.

Методы детекции HPV на основе ПЦР

В течение последнего десятилетия лидирующее место в клинической диагности­ ке HPV-инфекции заняли методы, основанные на проведении реакции ПЦР, что связа­ но с ее высокой разрешающей способностью, технической простотой и быстротой дан­ ной процедуры [8, 36].

613

Глава 1 Современные представления о канцерогенезе рака шейки натки

на организацию программ любого скрининга ограниченны, поэтому исследованж жно быть организовано таким образом, чтобы обеспечить максимальную пользу для

популяции в целом. Для того, чтобы убедиться в целесообразности осуществления та­ кой программы, необходимо произвести детальный подсчет средств, затраченных как силами здравоохранения, так и женщинами, вовлеченными в исследование. Данный подход может дать более цельное представление о пользе, полученной в отношении продолжительности и качества жизни.

Встречаемость HPV-инфекции за рубежом и в России

Согласно накопленным эпидемиологическим сведениям, встречаемость HPV в здоровых популяциях значительно варьирует в различных этнико-географических ре­ гионах и во многом определяется поведенческими, социально-экономическими, меди­ цинскими и гигиеническими стандартами. Как правило, локальные показатели инфи­ цированное™ папилломавирусами тесно взаимосвязаны с таковыми для других генитальных инфекций (сифилиса, гонореи, хламидиоза, урогенитального микоплазмоза и т.д.) [3]. Согласно имеющимся эпидемиологическим сведениям, встречаемость HPVинфекции среди женщин различных этнико-географических регионов варьирует от 5 до 40% [20, 31, 47]. Минимальная зарегистрированная частота инфицированности HPV (5%) наблюдается в Испании - стране с «низким риском» РШМ [39]. Этот пока­ затель несколько выше на Филиппинах (9,2%). В Мексике, Бразилии, Марокко и Парагвае - странах с традиционно высокой заболеваемостью РШМ - 17,17,20,5,20% здоровых женщин соответственно являются носительницами HPV-инфекции [39, 40, 43]. В Аргентине и Гондурасе зараженность генитальными папилломавирусами дости­ гает рекордных цифр и приближается к 40% [ 19, 53]. Несмотря на высокий социальноэкономический и образовательный уровень, частота выявления HPV у здоровых жен­ щин США составляет 26%, а у жительниц Канады - 21,8% [42]. Эти показатели в 1,5-2 раза превышают уровень HPV-инфицированности, отмечаемый в развитых европейс­ ких и азиатских странах, таких как Швеция (12,8%), Дания (15,4%) или Япония (10,7%) [22, 30, 33].

Большинство исследователей отмечают значительное разнообразие типов папилломавирусов, выявляемых в каждой отдельно взятой популяции [42]. Среди здоровых женщин, так же как и у больных РШМ, наиболее часто обнаруживается HPV-16. В 1,5-2 раза реже выявляется HPV-18. Суммарно, на долю HPV-16 и -18 приходится 45% от общего числа всех генитальных папилломавирусов. Среди прочих типов HPV, в Европе и США чаще других отмечают HPV-31, -33, -35, в совокупности составляю­ щих около 8% от общей HPV-инфицированности, а также и HPV-6 и -11 (9%) [15]. Распределение HPV по типам подвержено определенным этнико-географическим ко­ лебаниям. Например, для стран Азии характерна относительно высокая встречаемость HPV-52 и -58 [27], в то время как на Филиппинах и в странах Латинской Америки не­ сколько увеличена представленность HPV-45 [39]. Выявление региональных особен­ ностей HPV-инфицированности крайне важно для оптимизации программ по диагнос­ тике и профилактике папилломавирусного носительства.

Несмотря на очевидную социальную значимость сведений о распространенности папилломавирусов, HPV-носительство в России практически не подвергалось объек­ тивным оценкам. Более того, в случае нашей страны даже приближенное прогнозирова­ ние картины HPV-эпидемиологии представляется крайне затруднительным. Действитель­ но, с одной стороны, многие медико-социальные особенности Российской Федерации

615

ЧАСТЬ VIII

РАК ШЕЙКИ МАТКИ

47.Schiffman M.H. Epidemiology of cervical human papillomavirus infection / / Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1994,-Vol. 186. - P. 55-81.

48.Schneider A., Koutsky L. Natural history and epidemiology features of genital HPV infec­ tion // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Munoz N., Bosch F.X., Shah K.V., Meheus A. (eds.) - Lyon, France: IARC, 1992. - P. 25-52.

49.Southern S.A., Herrington C.S. Molecular events in uterine cervical cancer // Sex. Transm. Infect. - 1998. - Vol. 74. - P. 101-109.

50.Stern P.L., Brown M., Stacey S.N. et al. Natural HPV immunity and vaccination strate­ gies / / J . Clin. Virol. - 2000. - Vol. 19. - P. 57-66

51.Syrjanen K., Syrjanen S. Epidemiology of human papillomavirus infection and genital neoplasia // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. - 1990. - Vol. 69. - P. 7-17.

52.Syrjanen K. Human papillomavirus in genital carcinogenesis // Sex. Transm. Dis. - 1994. -Vol. 21 . - P . S86-S89.

53.Tonon S.A., Plcconi M.A., Zinovich J.B. et al. Human papillomavirus cervical infection and associated risk factors in a region of Argentina with a high incidence of cervical carcinoma // Infect. Dis. Obstet. Gynecol. - 1999. - Vol. 7. - P. 237-243.

54.Tyring S.K. Human papillomavirus infections: epidemiology, pathogenesis, and host im­ mune response / / J. Arner. Acad. Dermatol. - 2000. - Vol. 43. - P. S18-S26.

55.Villa L.L. Human papillomaviruses and cervical cancer // Adv. Cancer Res. - 1997. - Vol. 71 . - P . 321-341.

56.Walboomers J.MM., Melkert P. W.J., Van den Brule A.J.С et al. The polymerase chain reaction for human papillomavirus screening in diagnostic cytopathology of the cervix / / Diagnos­ tic Molecular Pathology. A Practical Approach. / Herrington C.S., McGee J.O.D. (eds.) - Oxford: IRLPress, 1992.-P. 153-172.

57.Wick M.J. Diagnosis of human papillomavirus gynecologic infections / / Clin. Lab. Med. - 2000.-Vol. 2 0 . - P . 271-287.

58.Zur Hausen H. Papillomavirus infection - a major cause of human cancer // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol. 1288. - P. 55-78.

622