3 курс / Фармакология / ИК_спектроскопия_в_фармацевтическом_анализе_Мельникова_Н_Б_,_Зимнякова

Существование таких частот обусловлено тем, что хотя зави-

симость между колебаниями разных частей молекулы существует всегда, взаимодействие связей в пределах функциональной груп-

пы характеризуется строгим постоянством и только в небольшой степени зависит от природы углеродного скелета, несущего эту функциональную группу. Поэтому оказывается возможным уста-

новить соответствие между различными функциональными груп-

пами и свойственными им групповыми частотами. Именно по этой причине ИК-спектрофотометрия используется главным об-

разом для определения функциональных групп молекулы.

Колебательная спектроскопия является:

молекулярно – специфичной, что позволяет получать информацию о функциональных группах в молекуле – их типе, взаимодействиях и ориентациях;

селективной по отношению к изомерам, благодаря об-

ласти «отпечатков пальцев»;

методом количественного и недеструктивного анализа,

даже по отношению к неустойчивым соединениям;

методом, работающим в области концентраций от 0,1%

до 100%, но также пригодным и для определения мик-

роколичеств после соответствующего концентрирова-

ния;

11

В основе получения ИК-спектра лежит облучение исследуе-

мого образца ИК-светом с постепенно изменяющейся частотой с

помощью прибора - ИК-спектрофотометра.

Схема ИК-спектрофотометра сходна со схемой УФ-

спектрофотометра, однако конструкция приборов более сложна.

ИК-излучение является тепловым; его источником обычно слу-

жит керамический стержень (SiСкарборунд), раскаляемый про-

ходящим электрическим током. С помощью системы зеркал све-

товой поток разделяется на два одинаковых луча, один из кото-

рых пропускается через кювету с веществом, другой - через кю-

вету сравнения. Прошедшие через кюветы излучение поступает в монохроматор, состоящий из вращающейся призмы, зеркала и щели, позволяющий выделять излучение со строго определенной частотой и плавно изменять эту частоту. Учитывая, что в ИК-

области большинство веществ непрозрачно, призмы изготовля-

ются из монокристаллов солей. В приборах высокого класса при-

меняют три призмы: из LiF (2000-3800 см-1), NaCl (700-2000 см-1)

и KBr (400-700 см-1). Каждая из призм в другом интервале волно-

вых чисел дает значительно меньшее разрежение.

Интенсивности двух световых потоков (основного и луча сравнения), прошедших через монохроматор, автоматически вы-

читаются одна из другой. Электрический импульс, образующийся

12

при попадании результирующего светового потока на детектор типа термопары, усиливается и регистрируется самопищущим по-

тенциометром. Запись представляет собой ИК-спектр в виде зави-

симости поглощения или пропускания (в %) от частоты (в см-1)

или длины волны (в мкм)

Для правильной работы прибор должен находиться на проч-

ной устойчивой поверхности, исключающей его колебания, что особенно важно в момент снятия спектров. Располагать прибор необходимо вдали от нагревательных приборов и источников во-

ды (влаги). Последнее особенно важно, поскольку вода затрудня-

ет получение ИК-спектров, так как поглощает ИК-излучение.

ИК-спектрофотометрия включает следующие стадии:

1.Подготовка исследуемого образца

2.Регистрация (снятие) спектра с помощью прибора

3.Интерпретация (анализ спектра, отнесение полос по-

глощения к определенным ФГ, связям, фрагментам структур)

4.Решение аналитической задачи.

Подготовка проб

Существуют различные способы подготовки исследуемого образца в ИК-спектрофотометрии:

1.Растворы веществ наиболее удобны для получения спектров,

так как в этом случае отсутствуют межмолекулярные взаимодей-

ствия. В связи с тем, что в ИК-области поглощает любое вещест-

во, в качестве растворителей используют соединения простейшей структуры, спектры которых состоят из минимального числа по-

13

лос, и наиболее часто – CCl4 и CS2. Для растворов применяют ци-

линдрические кюветы толщиной 0,1-1 мм с окнами из солевых пластин. Необходимый для заполнения кюветы объем раствора

0,1-1,0 мл при концентрации 0,05-10%.

2.Тонкие пленки (< 0,01 мм) жидкого вещества, помещенные между солевыми пластинами, удерживаемыми капиллярными си-

лами.

3.Пасты, приготовляемые тщательным растиранием твердого образца с вазелиновым маслом и помещаемые в виде тонкого слоя между солевыми пластинами. Само вазелиновое масло по-

глощает в области 2900 и 1400 см-1 Методика получения пасты с вазелиновым маслом более проста и экспрессна.

4.Твердые вещества в виде тонкого порошка 0,5-1 г тщательно перемешанные с порошком бромида калия ≈100 мг и затем спрессованные в специальном устройстве под давлением в тон-

кую пластину.

Важным условием получения ИК-спектров является отсутст-

вие влаги в анализируемом образце. Испытуемое вещество или препарат тщательно измельчают в агатовой ступке. Обычную ступку нельзя использовать, поскольку в ней имеются поры, в

которых содержится вода. Затем полученный порошок необхо-

димо поместить в среду, хорошо пропускающую ИК-излучение.

Если анализируется лекарственная субстанция, для анализа берут испытуемую навеску массой около 15 мг (0,015 г).

При анализе таблеток содержание действующего вещества в пробе должно быть около 5 мг (0,005 г). Остальная часть — это

14

вспомогательные вещества. При таком соотношении на спектре прослеживаются полосы лекарственного вещества, а полосы вспомогательных веществ либо отсутствуют, либо немногочис-

ленны и имеют небольшую интенсивность.

Небольшое количество полученной пасты помещают стек-

лянной палочкой между двумя стеклами из калия бромида, кото-

рые, в свою очередь, зажимают в специальном устройстве (кюве-

те). Кювету помещают в измерительный отсек прибора и получа-

ют ИК-спектр.

Для получения надежных результатов рекомендуется снимать фоновый спектр (спектр воздуха) непосредственно перед каждым измерением. Это, во-первых, связано с колебаниями влажности,

во-вторых, с изменением газового состава в измерительном отсе-

ке (двухатомные молекулы N2, О2 не имеют ИК-спектров, однако СО2 поглощает ИК-изучение) и, в третьих, с постепенным «про-

гревом» прибора после его включения.

Интерпретация спектров

Инфракрасный спектр испытуемого образца должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра сравнения по положению и относительным интенсивностям.

Однако в настоящее время при интерпретации ИК-спектров необходимо учитывать ряд факторов. Современные ИК-

спектрофотометры имеют достаточно большую чувствительность и управляются серьезным программным обеспечением. Получен-

ные спектры также анализируются с помощью этих компьютер-

15

ных программ, а не рисуются относительно грубо с помощью са-

мописца. Это позволяет видеть на рисунке полосы поглощения практически любой интенсивности — вплоть до 0,5 % по шкале пропускания (transmittance). Высокое разрешение современных приборов (в данном случае 1 см-1) дает возможность разделить находящиеся рядом полосы. С другой стороны, воспроизводи-

мость физических методов анализа хотя и улучшилась, но поря-

док значений остался прежним. Для качественных аналитических приборов воспроизводимость (относительное стандартное откло-

нение) составляет обычно 2–5 % с учетом погрешностей пробо-

подготовки.

Поэтому в случае ИК-спектроскопии (особенно при получе-

нии спектров таблеток, где имеется побочное действие вспомога-

тельных веществ) добиться полного (100%) совпадения полос да-

же для подлинного (нефальсифицированного) препарата не всегда удается. Некоторые очень слабые полосы могут исчезать, а ино-

гда появляться в виде артефактных полос поглощения очень не-

большой интенсивности. При разрешении 1 см-1 воспроизводи-

мость значений волновых чисел составляет обычно ±4—8 см-1 в

области 4000 — 2000 см-1 и ±1—3 см-1 в области 2000—400 см-1.

Последнее может приводить к слиянию (неразрешению) полос поглощения, находящихся друг от друга на расстоянии несколь-

ких см-1.

Поэтому при интерпретации спектров важно чтобы все поло-

сы большой, средней и малой интенсивности имели полное сов-

падение с соответствующими полосами стандартного спектра.

16

Исчезновение или появление полос очень малой интенсивности

(1—2 % по шкале пропускания), а также слияние полос, находя-

щихся друг от друга на расстоянии менее 6—8 см-1, не свидетель-

ствует о факте подделки.

В случае исследования новых химических соединений про-

водят анализ спектра (интерпретацию, расшифровку, объяснение нахождения в спектре определенных полос). Имеющееся полосы поглощения относят к определенным функциональным группам,

связям, фрагментам структур, используя таблицы характеристи-

ческих частот, имеющиеся в руководствах по ИК-

спектрофотометрии. На основании подобного анализа спектра делают выводы (заключение) о строении исследуемого вещества.

При расшифровке спектров необходимо учитывать следую-

щие моменты:

а) отсутствие характеристической полосы поглощения является более надежным доказательством отсутствия структурной группы, чем доказательство ее наличия на основании появле-

ния полосы поглощения;

б) не все полосы можно интерпретировать;

в) выводы, получаемые из спектров, часто остаются более или менее обоснованными предположениями; точным доказатель-

ством спектры становятся тогда, когда имеются надежные дан-

ные для сравнения и спектр идентифицируемого вещества во всех деталях совпадают со спектром проанализированного со-

единения.

17

Для структурного анализа часто рекомендуют следую-

щую схему:

-определение класса соединения (для алифатических соедине-

ний частота валентных колебаний группы ≡СН < 3000 см-1, для ненасыщенных и ароматических соединений частота валентных колебаний группы >СН > 3000 см-1);

-обнаружение функциональных групп (-ОН, -NH2, >NH, - СN,

>С=O) целесообразно начинать с области высоких частот;

-установление типа заместителей в ароматических соединениях,

положения и характера двойных связей, влияния стерических факторов.

Полученная таким образом информация в большинстве случаев достаточна для выбора некоторых возможных вариантов.

При определении подлинности ИК-спектр лекарственного вещества является такой же константой как tп0л , tкип0 , [α] и др. В

этом случае анализа спектра не требуется. Как же поступают на этой стадии контроля качества?

а) рекомендуется получить ("снять") спектр анализируемого ве-

щества и стандартного образца этого же соединения в одинако-

вых условиях (агрегатное состояние, растворитель, толщина слоя и др.) - при этом картина спектров должна совпадать (чис-

ло полос, их частота, форма контура). Способ рекомендован для гормонов стероидной структуры, антибиотиков: ампицил-

лин-стандарт, метациклин-стандарт; тестостерона пропионат-

стандарт.

18

б)если стандартный образец отсутствует, то рекомендуется срав-

нивать полученный спектр анализируемого вещества со спек-

тром приведенным в фармакопейной статье: в этом случае в статье также приведены условия получения спектра анализи-

руемого вещества (например, для рибоксина, фепромарона,

рифампицина, эстрадиола-дипропионата.

в) в некоторых случаях рекомендуется снимать не весь спектр, а

наиболее характерные его фрагменты. Например, для фуразо-

лидона-стандарта ФС рекомендует снять спектр в области

1900-700 см (область "отпечатков пальцев").

Условия получения ИК-спектров лекарственных веществ со-

гласно действующей НД приведены в табл. 5, приложения 2.

ФТОРХИНОЛОНЫ

ЦИПРОФЛОКСАЦИН, ЛЕВОФЛОКСАЦИН

Субстанция. В агатовой ступке растирают 15 мг лекарственного вещества с 1 каплей вазелинового масла до получения однородной пасты. Часть полученной пасты на кончике стеклянной палочки помещают между двумя пластинами из калия бромида и получают ИК-спектр образца.

Таблетки. В агатовой ступке растирают навеску измельченной таблетки, содержащую 5 мг действующего вещества, с 1 каплей вазелинового масла до получения однородной пасты. Часть полученной пасты на кончике стеклянной палочки помещают между двумя пластинами из калия бромида и получают ИКспектр образца.

19

Инфракрасный спектр испытуемого образца должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра сравнения по положению и относительным интенсивностям.

Примечание. Расчет массы навески порошка растертых таблеток проводят следующим образом:

mНАВ - масса навески порошка растертых таблеток;

X- требуемое содержание действующего вещества в навеске порошка растертых таблеток;

mТАБ - масса таблетки (определяется взвешиванием);

D- дозировка действующего вещества в таблетке (указана на упаковке).

Например, навеска порошка растертых таблеток должна содержать 50 мг действующего вещества. При этом доза лекарственного вещества в таблетке составляет 250 мг, а масса самой таблетки — 500 мг. Тогда навеска порошка, содержащая 50 мг действующего вещества, составляет 100 мг. Аналогично навеска порошка, содержащая 5 мг действующего вещества, составляет

10 мг.

ОФЛОКСАЦИН, СПАРФЛОКСАЦИН

Субстанция. В агатовой ступке растирают 15 мг лекарственного вещества с 1 каплей вазелинового масла до получения однородной пасты. Часть полученной пасты на кончике стеклянной

20