3 курс / Фармакология / Диссертация_Яичков_И_И_Разработка_методик_количественного_определения

62

В

MPA – хроматограмма микофеноловой кислоты (319→191+205 m/z); dMPA –хроматограмма внутрен-

него стандарта (321→191+205 m/z)

Рисунок 3.8. Пример хроматограммы холостого образца (А) и образца МФК в концен-

трации 0,5 мкг/мл (Б) и 30 мкг/мл (В).

Таким образом, разработанная методика определения МФК с применением ВЭЖХ-МС/МС соответствует требованиям, установленным руководствами по валида-

63

ции биоаналитических методик [22, 24, 85, 87]. Данный аналит, содержащий в своей структуре один фенольный гидроксил, оставался стабильным в образцах К3ЭДТА-

плазмы в течение 4 мес хранения при температуре не выше -20ºС. Обратная конверсия ФГМФК находилась в допустимых пределах. Поэтому добавления к плазме каких-либо растворов стабилизаторов не требуется.

3.1.2. Разработка методики количественного определения микофеноловой кислоты

в плазме крови методом ВЭЖХ-МС

Детектирование микофеноловой кислоты проводилось по молекулярному иону

319 m/z. Оптимизация параметров масс-спектрометрического детектора проводилась путём анализа раствора данного аналита в ацетонитриле в концентрации 0,1 мкг/мл в режиме FIA (Flow Injection Analysis – ввод пробы через автосемплер при потоке элюента в масс-спектрометрический детектор без хроматографической колонки). Выбранные в результате условия детектирования приведены в табл. 3.7.

Таблица 3.7

Параметры масс-спектрометрического детектирования МФК методом ВЭЖХ-МС

Для обеспечение возможности детектирования следовых количеств микофеноло-

вой кислоты при проведении фармакокинетических исследований НПКО данной мето-

дики был снижен до 0,05 мкг/мл [34, 39]. Использованные в ВЭЖХ-МС/МС - методе па-

раметры хроматографического разделения (табл. 3.2) и осаждение белков плазмы мета-

нолом в соотношении 1:4 «плазма/осадитель» не позволили достичь данного уровня чувствительности (рис. 3.9).

Рисунок 3.9. Хроматограмма образца МФК с концентрацией 0,05 мкг/мл при использо-

вании параметров хроматографического разделения ВЭЖХ-МС/МС-метода

64

Для разработки ВЭЖХ-МС-методики определения МФК в плазме крови была вы-

брана колонка Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (100*4,6мм, 3,5 мкм) также на основе ок-

тадецилсиликигеля. Начальные условия хроматографического разделения были следу-

ющие: скорость потока - 0,6 мл/мин; температура термостата - 40ºС; объём вводимой пробы – 1 мкл; ПФ - ацетонитрил : вода в соотношении 50:50 (об./об.). Как видно из рис. 3.10, аналит практически не удерживается при данных условиях хроматографического разделения, его tR составило – 1,323 мин.

Рисунок 3.10. Хроматограмма раствора МФК в ацетонитриле 1 мкг/мл – ПФ: ацетонит-

рил : вода -50:50 (об./об.)

При увеличении количества воды в составе ПФ (ацетонитрил : вода - 35:65 (об./об.)) tR МФК незначительно возросло до 1,800 мин, а также наблюдалось раздвое-

ние хроматографического пика (рис. 3.11), что свидетельствует об одновременном при-

сутствии молекулярной и ионизированной формы МФК.

Рисунок 3.11. Хроматограмма раствора МФК в ацетонитриле 1 мкг/мл – ПФ: ацетонит-

рил : вода -35:65 (об./об.)

При включении состав элюента 0,1% раствора муравьиной кислоты (ацетонитрил

: вода : 0,1% раствор муравьиной кислоты - 50:45:5 (об./об./об.) повысило удерживание определяемого вещества (tR МФК = 3,707 мин, площадь хроматографического пика –

507842 ЕД*с) за счёт его перевода в молекулярную форму (рис. 3.12). Использование раствора формиата аммония рН = 2,5 в концентрации 20 ммоль/л (ацетонитрил : раствор формиат аммония рН = 2,5 - 50:50 (об./об.)) и раствора муравьиной кислоты 0,1% (аце-

тонитрил : раствор муравьиной кислоты 0,1% - 50:50 (об./об.)) не изменяло tR МФК, од-

нако, приводило снижению чувствительности в 5 раз (площади хроматографических пи-

ков МФК – 102589 ЕД*с и 125896 ЕД*с, соответственно).

65

Рисунок 3.12. Хроматограмма раствора МФК в ацетонитриле 1 мкг/мл – ПФ: ацетонит-

рил : вода : 0,1% раствор муравьиной кислоты - 50:45:5 (об./об./об.)

Таким образом, изократический режим элюирования с применением ПФ на осно-

ве ацетонитрила, воды и 0,1% раствора муравьиной кислоты в соотношении 50:45:5 (об./об./об.) является оптимальным для анализа МФК при скорости потока 0,6 мл/мин и температуре термостата 40ºС. Данные условия позволяют полностью хроматографиче-

ски разделить аналит и его основной метаболит ФГМФК (рис. 3.13).

А

Б

Рисунок 3.13. Хроматограмма раствора ФГМФК в ацетонитриле в концентрации 100

мкг/мл: А– Режим SIM – 319 m/z; Б - Режим Scan - 50-550 m/z (полярность – отрица-

тельная)

Для пробоподготовки был использован наиболее простой и экспрессный метод -

осаждение белков. При применении ВЭЖХ-МС для анализа проб данный метод исполь-

зуется достаточно часто [18]. Таким образом, оптимальными условиями подготовки об-

разцов является следующие: к 50 мкл плазмы добавляли 200 мкл метанола, полученную смесь перемешивали на вортексе в течение 30 сек и центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. Затем 5 мкл надосадочной жидкости вводили в хроматографическую систему [107, 108].

66

3.1.2.1. Исследование обратной конверсии глюкуронидов микофеноловой кислоты в про-

цессе хранения при значении НПКО методики 0,05 мкг/мл

Оценка обратной конверсии ФГМФК также проводилось на образцах плазмы, со-

держащих данное соединение в концентрации 100 мкг/мл, при использовании К3ЭДТА и гепарината лития в качестве антикоагуалянтов. При этом из данных проб через опреде-

лённые промежутки времени хранения при комнатной температуре отбирались аликво-

ты объёмом 50 мкл для последующего хромато-масс-спектрометрического определения.

Затем проводили сравнение площадей хроматографических пиков МФК, которая обра-

зовывалась в результате гидролиза ФГМФК, с площадью хроматографических пиков МФК на уровне концентраций 0,05 мкг/мл. Уровень обратной конверсии основного ме-

таболита МФК при применении антикоагулянта К3ЭДТА не превышал максимально до-

пустимого уровня (не выше 20% от площади хроматографического пика образца МФК с концентрацией 0,05 мкг/мл (НПКО)) в течение 6 ч. Образцы, стабилизированные гепа-

ринатом лития, можно хранить при комнатной температуре не более 2 ч, что значитель-

но меньше, чем при использовании К3ЭДТА (табл. 3.8). Поэтому при проведении био-

аналитических исследований микофеноловой кислоты следует применять К3ЭДТА [107, 108].

Таблица 3.8

Влияния антикоагулянтов на процесс обратной конверсии фенольного глюкуронида ми-

кофеноловой кислоты при значении НПКО методики 0,05 мкг/мл

Далее проводилось изучение стабильности ФГМФК в К3ЭДТА-плазме в течение 3

циклов заморозки/разморозки, в депротеинизате образцов плазмы при хранении в авто-

семплере в течение 24 ч, а также долгосрочная стабильность при температуре не выше

–20 С в течение 1 мес. Концентрация метаболита в образцах также составила 100

мкг/мл. В результате гидролиз ФГМФК полностью отсутствовал (табл. 3.9).

67

* данное испытание проводилось перед изучение обратной конверсии на образцах, полученных от крыс, чтобы выяснить, какой вклад вносит гидролиз ФГМФК в результаты испытания

Для изучения обратной конверсии метаболитов ФГМФК и АГМФК в процессе хранения образцы, полученные от нелинейных крыс, были проанализированы через 1

мес после отбора.

Как видно из данных, приведённых в табл. 3.10, различие между начальным и ко-

нечным результатами измерений не превышает 20%, во всех случаях, что отвечает кри-

териям приемлемости [22, 24, 85, 87]. Таким образом, выбранные условиях хранения позволили сохранить уровень обратной конверсии ФГМФК и АГМФК на допустимом уровне и добавление раствора стабилизатора для предотвращения гидролиза ацилглю-

куронида микофеноловой кислоты не требуется.

Таким образом, в случае выбора уровня НПКО методики определения МФК 0,05

мкг/мл образцы плазмы, стабилизированной К3ЭДТА, следует хранить при комнатной температуре не дольше 6 ч из-за обратной конверсии ФГМФК. При заморозке до темпе-

ратуры не выше –20 С в течение 1 мес, в течение 3 циклов заморозки/разморозки, а

68

также депротеинизата плазмы в условиях автоматического пробоотборника разложения данного метаболита не наблюдалось.

3.1.2.2. Валидация ВЭЖХ-МС-методики определения микофеноловой кислоты в плазме

Аналитический диапазон данной методики составил 0,05 - 30,0 мкг/мл. Калибро-

вочные кривые содержали 9 калибровочных концентраций: 0,05, 0,10, 0,25, 1,00, 2,50, 7,50, 15,00, 22,50, 30,00 мкг/мл. Подтверждение внутрисерийной и межсерийной преци-

зионности и правильности было выполнено на шести уровнях концентраций: 0,05, 0,50, 1,50, 5,00, 12,50, 25,00 мкг/мл. Результаты валидации методики представлены в таблице

3.11.

В

Рисунок 3.14. Примеры хроматограмм холостого образца (А) и образца с концентрацией МФК 0,05 мкг/мл (Б) и 30,00 мкг/мл (В)

69

Таблица 3.11

Результаты валидации ВЭЖХ-МС-методики определения микофеноловой кислоты в

Таким образом, разработанная методика определения МФК в плазме с примене-

нием ВЭЖХ-МС соответствует требованиям, установленным российскими и междуна-

родными руководствами по валидации [22, 24, 85, 87]. Нижний предел количественного определения МФК составил 0,05 мкг/мл. Применение более длинной хроматографиче-

ской колонки Zorbax Eclipse Plus C18 (100*4,6мм, 3,5 мкм) позволило нивелировать эф-

фект матрицы за счёт более эффективного разделения аналита и компонентов биологи-