3 курс / Фармакология / Диссертация_Яичков_И_И_Разработка_методик_количественного_определения

91

Изучение краткосрочной стабильности при комнатной температуре, стабильности при замораживании/размораживании, стабильности обработанных образцов в автосем-

плере проводилось на 2 уровнях концентраций: 0,06 мкг/мл (LQC), 2,40 мкг/мл (HQC).

При этом метилдопа оставалась в плазме относительно стабильной (Прил. 2, табл. 2).

Долгосрочная стабильность МД в плазме оценивалась при двух температурных режимах: не выше -20 С и не выше -80 С. Как видно из данных, приведённых в табл. 3.24, при температуре хранения не выше -20 С аналит остаётся стабильным в течение 1

мес, а при температуре не выше -80 С - в течение 3 мес, что значительно дольше.

Для установления максимального времени, необходимого для подготовки стабили-

зированных образцов плазмы после забора крови у добровольца, была изучена стабиль-

ность метилдопы в цельной крови без добавления стабилизатора. Испытание проводили на 6 модельных смесях с концентрациями аналита 0,06 мкг/мл и 2,4 мкг/мл. При этом образцы перед обработкой сначала хранили в течение 20 мин на ледяной бане, а затем в течение 40 мин при комнатной температуре. Относительная концентрация МД на уровне 0,06 мкг/мл составила 85,17%, на уровне 2,40 мкг/мл – 94,98%, что отвечало кри-

териям приемлемости.

Таким образом, разработанная методика количественного определения МД в плаз-

ме методом ВЭЖХ-МС/МС валидирована по показателям селективность, линейность калибровочной кривой, внутрисерийная и межсерийная прецизионность и правильность,

эффект переноса, эффект матрицы, стабильность в соответствии с требованиями норма-

тивной документации [22, 24, 85, 87]. Все валидационные испытания выполнены с до-

бавлением к плазме раствора стабилизатора-антиоксиданта для предотвращения разло-

жения определяемого вещества. Как показало исследование долгосрочной стабильности при различных температурных режимах, образцы, содержащие аналит, целесообразно хранить при температуре не выше -80ºС.

3.3. Разработка методики количественного определения мебевериновой и демети-

лированной мебевериновой кислот в плазме крови

Выбор параметров масс-спектрометрического детектирования осуществлялся пу-

тём непосредственного ввода растворов ДМК и МК в метаноле в концентрации 0,1

мкг/мл в ионный источник с помощью шприцевого насоса. Наибольшая интенсивность аналитического сигнала была достигнута в режиме регистрации положительных ионов.

92

Масс-спектры, получившиеся в результате фрагментации молекулярных ионов МК и ДМК представлены на рис. 3.34. Дочерний ион 121 m/z получается в результате разрыва углеводородной цепи в молекуле МК, дочерний ион 91 m/z - в результате последующего отщепления метоксигруппы от бензольного кольца, дочерний ион 77 m/z - в результате элиминирования метильной группы от бензольного кольца (рис. 3.35 А). Дочерний ион

65 m/z образуется за счёт перегруппировочного процесса по механизму Мак-Лафферти,

что свидетельствует об образовании в ходе распада молекулярного иона МК гидрокси-

фенилкатионов, часть которых в результате кетоенольной таутомерии имеет форму ке-

тона [15, 16]. Фрагментация молекулярного иона ДМК (рис. 3.35 Б) происходит анало-

гичным образом: дочерний ион 107 m/z также образуется в результате разрыва углево-

дородной цепи, дочерний ион 77 m/z – вследствие последующего образования фенилка-

тиона.

А Б Рисунок 3.34. Масс-спектры молекулярных ионов мебевериновой (А) и деметилированной мебевериновой (Б) кислот

А

Б

Рисунок 3.35. Схема фрагментации мебевериновой (А) и деметилированной мебевериновой кислот (Б)

93

В результате фрагментации молекулярных ионов дейтерированных внутренних

стандартов МК и ДМК (рис. 3.36) получаются аналогичные масс-спектры.

Рисунок 3.36. Структурные формулы дейтерированных внутренних стандартов мебевериновой (А) и деметилированной мебевериновой (Б) кислот

Наилучшая чувствительность достигается при регистрации аналитов по следующим MRM-переходам: для МК - 280→121 m/z, для ДМК – 266→107 m/z. Оптимальные условия масс-спектрометрического детектирования приведены в табл. 3.25. Для детектирования внутренних стандартов выбраны следующие MRM-переходы: МК-D5 - 285→121 m/z, для ДМК-D5 - 271→107 m/z.

Таблица 3.25

Параметры масс-спектрометрического МК и ДМК

Подбор условий хроматографического разделения мебевериновой и деметилированной мебевериновой кислот осуществлялся при следующих параметрах: колонка Luna C8 (150*4,6 мм, 5 мкм), скорость потока - 0,4 мл/мин; комнатная температура; ПФ – метанол: ацетонитрил : вода : водный раствор формиата аммония в концентрации 80 ммоль/мл (рН=3,5) в соотношении 50:20:20:10 (об/об/об/об) (рис. 3.37 А).

Применение двумерной хроматографии с использованием второй колонки Luna С8 Mercury (20*4,0 мм, 5 мкм) на основе октилсиликагеля позволило значительно увеличить соотношение «сигнал/шум» за счёт уменьшения дрейфа базовой линии (рис 3.37 Б). Поток подвижной фазы до 0,25 мин с колонки Luna С8 Mercury (20*4,0 мм, 5 мкм) (колонка №1) направлялся на слив, с 0,25 мин до 0,75 мин - с колонки №1 направлялся на колонку Luna C8 (150*4,6 мм, 5 мкм) (колонка №2), 0,75 мин до конца анализа - с колонки №1 направляется на слив, а с колонки №2 – в масс-спектрометрический детектор

94

(рис. 3.30). Анализ выполнялся при комнатной температуре в течение 6 мин. Параметры

градиентного элюирования представлены в табл. 3.26 [40, 108, 110].

ДМК

МК

Рисунок 3.37. Примеры хроматограмм МК и ДМК, полученных с использованием одной колон-

ки Luna C8 (150*4,6 мм, 5 мкм) (А) и применением двумерной хроматографии (Б)

Таблица 3.26

Параметры градиентного элюирования при определении мебевериновой и деметилиро-

ванной мебевериновой кислот

Растворители: A - ацетонитрил, B - метанол, C – раствор формиата аммония рН=3,5, D – вода

При анализе раствора фенольного глюкуронида деметилированной мебеверино-

вой кислоты (ФГДМК) в метаноле в концентрации 2000 нг/мл при данных условиях его разложение в источнике ионов до ДМК не наблюдалось (рис. 3.38).

95

266→107 m/z

Рисунок 3.38. Хроматограмма раствора фенольного глюкуронида деметилированной мебевериновой кислоты в метаноле

Таким образом, применение двумерной хроматографии является наиболее опти-

мальным для анализа МК и ДМК благодаря увеличению соотношения «сигнал/шум» при детектировании аналитов: для ДМК - в 3 раза, для МК – в 2 раза. Так же при ис-

пользовании данных условий анализа отсутствует фрагментация ФГМДК в источнике ионов.

Для пробоподготовки было выбрано осаждение белков. При этом к 100 мкл плаз-

мы, добавляли 400 мкл раствора дейтерированных стандартов МК-D5 и ДМК-D5 с кон-

центрациями 400,0 нг/мл в метаноле. Полученную смесь перемешивали на вортексе в течение 30 сек, затем центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об/мин. Объём вво-

димой пробы составил 5 мкл [35, 108, 110].

3.3.1. Предварительное изучение стабильности деметилированной мебевериновой

кислоты в плазме и обратной конверсии её фенольного глюкуронида

Предварительное изучение стабильности деметилированной мебевериновой кис-

лоты проводилось в образцах плазмы, содержащих К3ЭДТА и гепарината лития в каче-

стве антикоагулянтов, на уровне концентрации 1600 нг/мл. Расчёт концентрации ДМК на данном этапе проводился методом внешнего стандарта. Результаты, полученные по-

сле 24 ч хранения модельных смесей при комнатной температуре и 3 циклов заморажи-

вания/размораживания отвечают критериям приемлемости (табл. 3.27): значения отно-

сительной концентрации ДМК укладываются в диапазон от 85,0% до 115,0%. Следова-

тельно, добавление растворов антиоксидантов не требуется.

96

Оценка обратной конверсии фенольного глюкуронида ДМК проводилось в образ-

цах плазмы в течение 24 ч хранения при комнатной температуре и 3 циклов замороз-

ки/разморозки с использованием К3ЭДТА и гепарината лития в качестве антикоагуалян-

тов. Из-за отсутствия данных литературы о фармакокинетических параметрах данного метаболита для исследования была выбрана концентрация 2000 нг/мл с учётом его пол-

ного гидролиза. При этом из приготовленных модельных смесей отбирались аликвоты объёмом 100 мкл для последующего анализа сразу после приготовления и через 24 ч по-

сле приготовления. Затем осуществлялось сравнение площадей хроматографических пиков ДМК, образовавшейся в результате гидролиза глюкуронида, с площадью хрома-

тографических пиков ДМК на уровне концентраций 10 нг/мл (табл. 3.28). Так же была выполнена оценка обратной конверсии ФГДМК в депротеинизате после 24 ч хранения в автосемплере.

Таблица 3.28

Влияние антикоагулянтов на процесс обратной конверсии фенольного глюкуронида де-

метилированной мебевериновой кислоты

Таким образом, при использовании обоих антикоагулянтов гидролиз ФГДМК от-

сутствовал в течение 24 ч хранения образцов плазмы при комнатной температуре, 3

98

Таблица 3.29

Результаты валидации ВЭЖХ-МС/МС-методики определения мебевериновой кислоты в

99

Таблица 3.30

Результаты валидации ВЭЖХ-МС/МС-методики определения деметилированной мебе-

100

В

DMAC – деметилированная мебевериновая кислота (266→107 m/z); MAC - мебевериновая кислота

(280→121 m/z); d5DMAC – внутренний стандарт ДМК-D5 - (271→107 m/z); d5MAC – внутренний стандарт МК-D5 - (285→121 m/z)

Рисунок 3.40. Пример хроматограммы холостого образца (А) и образца с концентрация-

ми МК и ДМК на уровне 10 нг/мл (Б) и 2000 нг/мл (В)

Краткосрочная стабильность при комнатной температуре, стабильность в течение

3 циклов замораживания/размораживания, стабильность обработанных образцов в про-

боотборнике, долгосрочная стабильность оценивались на 2 уровнях концентраций, оди-