3 курс / Фармакология / Биотехнологические_способы_получения_лекарственных_препаратов_Фауст

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Биотехнологические способы получения лекарственных препаратов

краткий курс лекций

для студентов IV курса

Направления подготовки

240700.62 Биотехнология

Профиль подготовки

Биотехнология

Саратов 2016

Введение

Медицинские биотехнологии - это технологии, основанные на использовании живых систем (организм, ткани, клетки, их компоненты и метаболиты) в диагностике, лечении и профилак­ тике болезней человека. Микробные клетки и их метаболиты, фитопрепараты, клетки и ткани животного происхождения занимают определяющее место в медицинской практике, ее совершенствовании и развитии. Если вчера разрабатывались медицинские препараты на основе целых микробных клеток (вакцины, диагностикумы, пробиотики) и их метаболитов (анти­ биотики, ферменты, аминокислоты, витамины), то сегодня, благодаря технологии рекомбинантной ДНК микроорганизмы продуцируют человеческие гормоны и цитокины (инсулин, интерфероны, интерлейкины и др.), разрабатываются ДНКвакцины и т.д.

Лекция 1 ПРЕДМЕТ, ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ «БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ»

Клетки и ткани животного и человеческого происхождения хорошо знакомы нам по моноклональным антителам, трансплантации внутренних органов, костного мозга.В настоящее время существуют трансгенные животные, продуцирующие с молоком человеческие терапевтические белки, развивается регенеративная медицина, позволяющая in vitro наращивать аутологичные человеческие ткани и органы. В лечение и диагностику (особенно онкозаболеваний, наследственной патологии, вирусных инфекций) внедряются технологии, основанные на использовании наночастиц и биочипов. Современные методы молекулярной биологии, молекулярной генетики позволяют оперировать отдельными биомолекулами, выполнять внутриклеточные манипуляции, благодаря применению в медицине достижений микроэлектроники, биоинженерии, компьютерной технологии. В медицинской практике используются следующие биотехноло­гические процессы:

-ферментационные - продукция антибиотиков, витаминов, ферментов, аминокислот и др.; биосинтез и биотрансформация;

-иммунобиотехнологии - вакцины, диагностикумы, аллергены, антитела, в том числе моноклональные антитела (гибридомная технология);

-клеточные технологии - клеточная терапия, тканевая инже­ нерия, оплодотворение in vitro;

-технологии рекомбинантных ДНК - генотерапия, продукция рекомбинантных белков человека;

-нанобиотехнологии, аналитические биотехнологии - биочипы и биосенсоры; - фармбиотехнологии - биопрепараты на основе лекарственных растений.

Систематизировать известные знания в области медицинской биотехнологии возможно, исходя из следующих возможных вариантов:

1) излагать материал раздельно по каждому из трех биообъектов (микроорганизмы, клетки и ткани растительного и животного происхождения), применительно к диагностике, лечению и профилактике болезней;

2) излагать материал по применению биообъектов и технологий раздельно по главам: диагностика, лечение и профилактика;

3) излагать материал по медицинской биотехнологии, исключив темы, входящие в программы других медицинских дисциплин (например, тема «Вакцины» излагается по курсу медицинской микробиологии; «Моноклональные антитела» - иммунологии; «Антибиотики» - фармакологии, клинические дисциплины и т.д). Но подобные принципы систематизации материала по медицинской биотехнологии не оптимальны, так как в 1-ом

и2-ом вариантах систематизации исключается рациональное изложение одного из двух основных принципов изложения материала (либо по биообъекту либо по диагностике, лечению и профилактике).

Мировой рынок терапевтических, рекомбинантных белков стремительно растет, потому что они эффективны при многих ранее неизлечимых заболеваниях, порой более действенны по сравнению с традиционными методами лечения и диагностики. Поэтому создание новых лекарственных биопрепаратов, продуци­ руемых генетически модифицированными микроорганизмами, трансгенными растениями и животными относится к перспектив­ ному современному направлению исследований и разработок в области медицинской биотехнологии. Рекомбинантные инсулин, интерферон, соматотропин, эритропоэтин, интерлейкины и другие препараты пептидной природы широко применяются в клинической практике.

Лекция 2

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ (ЧАСТЬ ПЕРВАЯ)

2.1. Рекомбинантные белки

Методы генетической инженерии позволяют создавать новые терапевтические белки для лечения наследственных болезней (рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, паркинсонизм и др.). Существенными темпами растет мировое производство новых рекомбинантных белковых препаратов: вакцины, иммуностимуля­ торы, факторы свертывания крови, гранулоцитарный колоние­ стимулирующий фактор, интерфероны и др. Высокая специфич­ ность действия, фармакологическая активность, незначительность возможных побочных действий, чистота от посторонних биологи­ чески активных веществ, относительно низкая себестоимость определяют перспективность дальнейшего развития биотехно­ логического производства человеческих белков в клетках микро­ организмов, растений и животных. Рекомбинантные человеческие белки - это белки, ДНК которых конструирована in vitro путем встраивания генов, кодирующих белок человека в геном микроорганизмов, клеток растений и млекопитающих. С этой целью вначале трансформируемый фраг­ мент ДНК обрабатывается эндонуклеазой рестрикции. В резуль­ тате образуется ДНК с «липкими концами», которая может соединяться с любой молекулой ДНК, имеющей комплементарные липкие концы. ДНК-лигаза ковалентно связывает две нити в одну рекомбинантную молекулу ДНК. Затем конструированная молекула ДНК встраивается в вектор (на основе вирусов либо плазмид) и последний трансфицируется в клетку-продуцент рекомбинантного белка (клетки микроорганизмов, растений, млекопитающих).

Для экспрессии рекомбинантного белка в вектор вводятся промотор, сайт связывания с рибосомой и терминатор, а также меркерный ген, обеспечивающий селекцию и идентифи­ кацию клеток, продуцирующих рекомбинантный белок. При клонировании в клетках прокариот гены человека не должны содержать нитроны, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены. В случае встраивания генов человека в векторную систему на основе бактериофага и трансфекции последней в клетки E.coli, то обеспечивается внеклеточное накопление рекомбинантного белка, непосредственно в культуральной среде, в активной растворимой форме. Это происходит потому, что вследствие репродукции вируса бактериальная клетка разрушается и рекомбинантный белок оказывается во внеклеточной среде.

Если в качестве вектора используется плазмида, то экспресси­ руемый рекомбинантный белок может остаться внутри клеток микроорганизмов. Тогда необходимо не только разрушать клетки для извлечения целевого продукта, но и переводить белок в активную растворимую форму, последовательно используя методы денатурации и ренатурации целевого белка. Эти процедуры приводят к значительным потерям целевого продукта, а в процессе ренатурации могут образовываться молекулы рекомбинантного белка с неправильной конформацией, от которых очень сложно избавиться в процессе очистки препарата. Наряду с технологией де- и ренатурации при выделении реком­ бинантного белка из клетки или из внеклеточной среды, используется технология аффинной хроматографии на основе хелатных комплексов кобальта или ионов никеля, которые иммобилизованы ковалетной связью на частицах полистирольной основы. Ионы кобальта или никеля с повышенной селективностью образуют координационные связи с гистидиновыми группами рекомбинант­ ного белка (рис. 29). Рекомбинантные, как и иные белки содержат шесть и более идентичных гистидиновых остатков, которые действуют как сайты связывания металлов; эти сайты используются при очистке белка и экспрессии. Последовательность hexa-His называют His-концом, который может быть помещен на N-

конец белка-мишени. His-конец содержит сайт расщепления для специ­ фических протеаз. Рекомбинантные белки с His-концом очи­ щаются методом металло-хелат аффинной хроматографии на нике­ левых или кобальтовых ионных колонках методом элюирования из металл-хелатной колонки с помощью гистидина или имидазола. Затем очищенный белок с His-концом обрабатывают с помощью специфической протеазы для отщепления Hisконца, или не обрабатывают, если His-конец не влияет на активнй сайт белка.

Если продуцентами рекомбинантного белка являются модифицированные штаммы микроорганизмов, то последние культивируются в биореакторе; при использовании трансгенных растений рекомбинантный белок накапливается в листьях, в плодах, в корне; у трансгенных животных обычно «биореактором» является молочная железа, с молоком которой выделяются рекомбинантные белки.

Технология выращивания культур клеток растений или млекопитающих in vitro применяется редко из-за определенных методических сложностей и пока не высокой рентабельности. Так, все линии культур клеток животных, используемых для этих процессов, должны иметь индивидуальные характеристики. Более того разные стадии производства белка требуют различных условий процесса. Поэтому отработка технологического процесса, создание клеточных линий - продуцентов рекомбинантного белка и оптимизация питательных сред являются особенно важными для обеспечения максимального выхода качественного конечного продукта (белка). Вместе с тем, получение рекомбинантных белков в суспензии культур клеток - это перспективное направление развития биотехнологического производства.

Взависимости от биологического действия рекомбинантные терапевтические белки подразделяются на следующие группы: - гормоны (инсулин, соматотропин и др.); - цитокины (интерфероны, интерлейкины, факторы роста клеток костного мозга - колониестимулирующие факторы и эритропоэтин, факторы некроза опухолей и др.); - факторы свертывания крови (рекомбинантный активатор тканевого плазминогена - rt РА; рекомбинантный VIII фактор свертывания крови; рекомбинантный активированный VII фактор свертывания или проконвертин - rVIIa и др.); - ферменты (рекомбинантная проурокиназа, рекомбинантная альфа-ДНК-аза и др.); - вакцины (против вирусного гепатита В, вакцина против ротавирусной инфекции и др.); - и другие рекомбинантные белковые препараты. Близки к рекомбинантным белкам по технологии получения химерные и гуманизированные моноклональные антитела.

2.2.Инсулин, технологии получения

В1869 году в Берлине 22-летний студент-медик П. Лангерганс изучая с помощью микроскопа строение поджелудочной железы, обратил внимание на ранее не известные клетки, образующие группы, которые были равномерно распределены по всей железе, в последующем они были названы «островки Лангерганса». В 1901 году было показано, что сахарный диабет обусловлен разрушением этих «островков» в поджелудочной железе.

До начала 20-х годов XX века у молодых людей с сахарным диабетом, т.е. нуждающихся

винсулине, не было никаких шансов прожить долго. Осенью 1921 года в г.Торонто (Канада) врачи Ф.Бантинг и Ч.Бест выделили некое вещество из поджелудочной железы телят, которое снижало уровень сахара крови у собак с экспериментальным диабетом. И января 1922 года, после множества успешных испытаний на собаках, страдающему диабетом 14-летнему мальчику была сделана первая в истории инъекция инсулина. Впоследствии они получили Нобелевскую премию, а день рождения Бантинга в настоящее время отмечается как Международный день диабета (14 ноября). Инсулин синтезируется клетками Лангерганса в поджелудоч­ ной железе, гормон регулирует углеводный обмен в организме, обеспечивает усвоение глюкозы клетками, его недостаток при­ водит к сахарному диабету.

Первичная структура или точная последовательность расположения аминокислот, образующих молекулу инсулина впервые определена Ф. Сенгером. В после­ дующем Д.Ходжкин с помощью метода рентгеновской дифракции определила пространственное строение молекулы инсулина (вторичную — четвертичную структуры). Первые препараты инсулина были животного происхождения. С 1922 года свиной и бычий инсулин применялся как лечебный препарат при диабете. Технология заключалась в экстрагировании белкаинсулина из поджелудочной железы (100 грамм кристал­ лического инсулина из 800-1000 кг поджелудочной железы). В процессе синтеза белково-пептидных гормонов в клетках эндокринных желез вначале происходит образование полипептида, не обладающего гормональной актив­ ностью. Полипептид в своем составе имеет фрагменты, содержащие аминокислотную последовательность соответствующего гормона. Такая белковая молекула называется пре-про-гормоном и имеет в своем составе (обычно на N- конце) структуру, которая называется лидерной или сигнальной последовательностью (пре- ). Эта структура пред­ ставлена гидрофобными радикалами и нужна для прохождения этой молекулы от рибосом через липидные слои мембран внутрь цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭПР). При этом, во время перехода молекулы через мембрану в результате ограниченного протеолиза лидерная (пре-) последовательность отщепляется и внутри ЭПР оказывается прогормон. Затем через систему ЭПР прогормон транспортируется в комплекс Гольджи и здесь заканчивается созревание гормона. Вновь в результате гидролиза под действием специфических протеиназ отщепляется оставшийся (N-концевой) фрагмент (про-участок). Образованная молекула гормона, обладающая специфической биологической активностью поступает в секреторные пузырьки и накапливается до момента секреции в железе. Синтез инсулина в поджелудочной железе происходит следую­ щим образом. В клетках Лангерганса на рибосомах ЭПР синтезируется пептидпредшественник -препроинсулин. Он представляет собой полипептидную цепь, построенную из 110 аминокислотных остатков и включает в себя расположенные последовательно: Сппептид, А-пептид, С-пептид и В-пептид. Почти сразу же после синтеза в ЭПР от этой молекулы отщепляется сигнальный (Сп) пептид— последовательность из 24 аминокислот, которые необходимы для прохождения синтезируемой молекулы через гидрофобную липидную мембрану ЭПР.

Образуется проинсулин, который транспортируется в комплекс Гольджи, где происходит частичный протеолиз - из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается С-пептид - фрагмент из 31 аминокислоты, соединяющий А и В- цепи. В секреторных гранулах инсулин, соединяясь с ионами цинка, образует кристал­ лические гексамерные агрегаты. Это белок из 51 аминокислотного остатка, состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных дисульфидными мостиками (рис.). Таким образом в клетках Лангерганса в результате процессинга из препроинсулина обра­ зуется проинсулин и затем инсулин. Однако инсулин крупного рогатого скота отличается от челове­ ческого тремя аминокислотными последовательностями, свинойодной, поэтому возможна выработка в организме больного человека антител против этих пептидов. В настоящее время используются препараты человеческого инсулина, полученные генноинженерной технологией, при помощи рекомбинантных штаммов бактерий (E.coli),

дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и др.

Вначале была разработана технология синтеза А и В-цепей, сигнального и соединительного пептидов в одной и той же клетке рекомбинантного штамма E.coli (рис.30). Однако при клониро­ вании и экспрессии гена инсулина человека, в прокариотах синтезировался препроинсулин (в бактериальных клетках нет процессинга), а он не обладает биологической активностью. Далее возможно полученный препроинсулин многоэтапно обработать соответствующими ферментами и получить инсулин, но это оказался достаточно сложный и дорогостоящий биохимический процесс.

Поэтому технология получения генно-инженерного инсулина в клетках E.coli была принципиально изменена. Предварительно химическим путем раздельно синтезируются

две нуклеотидные последовательности - кДНК, кодирующие А цепь и В цепь. Затем их встраивают раздельно в две векторные плазмиды, последние трансформируют в два различных штамма Е. coli. В этих фрагментах кДНК нет нуклеотидных последовательностей, кодирую­ щих сигнальные (Сп) и соединительные (С) пептиды. Генетически модифицированные Е coli раздельно культивируют, затем выделяют из культуральной жидкости рекомбинантные белки - А и В цепи инсулина, их соединяют химическим путем дисульфидными связями, получают чистый, биологически активный инсулин. Одноцепочечные олигонуклеотиды, короткие фрагменты ДНК, кодирующие А и В цепи инсулина получают химическим синтезом при помощи ДНК-синтезатора. Это аппарат, состоящий из системы клапанов и насосов, позволяющих в реакционную смесь по строго заданной программе вводить нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи нуклеотидов. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединить к 5-штрих гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке с компьютерным программным сопровождением.

Лекция 3 РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ (ЧАСТЬ ВТОРАЯ)

3.1. Интерфероны

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных сил организма. К общим свойствам цитокинов, объединяющим их в самостоятельную систему регуляции, относятся: - плейотропизм (полифункциональность) и взаимозаменяемость биологического действия, -

индуцибельный характер синтеза, - отсутствие антигенной специфичности действия, - саморегуляция продукции и формирование цитокиновой сети, в которой отдельные цитокины обладают синергическим или антагонистическим действием. В отличие от гормонов большинство цитокинов являются молекулами локального (паракринного) действия. Они продуцируются и утилизируются клетками, находящимися в тесной близости. Возможно и аутокринное действие цитокинов, т.е. действие на ту же клетку, которая секретировала данный цитокин. После выделения клетками-продуцентам и цитокины имеют короткий период полувыведения из кровотока. До 50% циркулирующих цитокинов интернализуется в течение 30 минут. Основными клетками-продуцентами цитокинов иммунной системы являются T- хелперы и макрофаги; цитокины - факторы роста продуцируются фибробластами, эндотелиальными клетками, макрофагами, лимфоцитами и лейкоцитами. Известно более 200 индувидуальных соединений, относящихся к семейству цитокинов. Наиболее хорошо изучены факторы роста и цитокины иммунной систем. В клинической практике существуют три основных направления применения цитокинов: - цитокиновая иммунотерапия, при которой цитокины выступают в роли лекарственных средств, - антицитокиновая терапия, направленная на блокирование биологического действия или удаление избытка цитокинов из организма, - цитокиновая генотерапия, применяемая с целью усиления противоопухолевого иммунитета, коррекции дефектов в системе цитокинов и их рецепторов. Среди цитокинов наиболее часто применяются и налажено широкомасштабное биотехнологическое производство рекомбинантных интерферонов, интерлейкинов, эритропоэтина.

В 1957 году учеными было показано, что лабораторные мыши, переболевшие гриппом, не подвержены инфекции другими, более опасными вирусами. Последующие исследования показали, что клетки животных и человека в ответ на вирусную инфекцию выделяют белковое соединение, защищающее не зараженные клетки от вирусной инвазии. Это вещество было названо интерфероном.

Интерфероны - это группа глобулярных белков, относящихся к трем классам: альфа, бета и гамма. Интерфероны - альфа и бета вырабатываются во всех клетках организма человека, в отличие от гамма-интерферона, который синтезируется в Т-лим- фоцитах и NKклетках. Интерферон-гамма имеет меньшую противовирусную активность, но выполняет более важные иммунорегуляторные функции. Интерфероны проявляют свое действие, связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клеток, что в свою очередь ведет к синтезу клетками около 30 протеинов, благодаря которым и реализуется биологическое действие интерферонов, а именно: противовирусный, противомикробный, противоопухолевый, иммуномодулирующий эффекты. Противовирусное действие интерферонов обусловлено, главным образом, индукцией синтеза двух ферментов в клетках : 2*5’- олигоаденилатциклазы и протеинкиназы. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных вирусных ДНК, образующихся в клетках при репродукции вирусов.

Активация этих ферментов ингибирует биосинтез белка и размножение вирусов в инфицированных ими клетках организма путем деградации вирусных иРНК и рРНК; клетки, зараженные вирусами вследствие этого лизируются. Интерфероны видоспе­ цифичны, т.е. человеческий интерферон биологически активен в организме человека, мышиный - в организме этого животного и т.д. В лейкоцитах синтезируется преинтерферон, состоящий из 187 аминокислотных остатков. Затем ферментативно отщепляется сигнальный пептид (21 аминокислотный остаток) и образуется интерферон, размером в 166 аминокислотных остатков. Интер­ ферон лейкоцитарный можно получать из донорской крови: из одного литра крови выделяют 1 мкг альфа-интерферона.

Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны индуцируют синтез двух ферментов - 2',5'-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы, вероятно, за счет инициации транскрипции соответствующих генов. Оба образующихся фермента проявляют свою активность в присутствии двух­ цепочечных РНК; именно такие РНК являются продуктами

репликации многих вирусов или содержатся в их вирионах. Первый фермент синтезирует 2',5'-олигоаденилаты (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу I; второй фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции IF2. Конечным результатом этих процессов является ингибирование биосинтеза белка и размножения вируса в инфицированной клетке, а затем ее лизис.

Доказано, что существуют и альтернативные механизмы действия интерферонов (инактивация тРНК, вмешательство в процессы метилирования и т. п.), (Мосин О.В.,1994).

Технология получения рекомбинантного интерферона. Гены лейкоцитарного интерферона встраиваются в плазмидный вектор pBR322 E.coli. В составе плазмиды есть промотор, инициирующий репликацию последовательности — точка ori; есть терминирующий кодон, регулирующий окончание синтеза молекулы интерферона.

С целью усиления антивирусной и противоопухолевой актив­ ности цитокина созданы плазмидные векторы, одновременно несущие гены синтеза нескольких интерферонов (альфа 1, альфа 2 и др). Гибридные интерфероны индуцировали образование в клет­ ках 2,- 5’-олигоизоаденилатсинтетазы. Этот фермент участвует в синтезе 2’-5’-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Некоторые гибридные интерфероны проявляли выраженную антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека в эксперименте, отмечена их иммуномодулирующая способность. При культивировании рекомбинантного штамма E.coli экспрессируются гены, ответственные за синтез интерферона; трансформированные гены интерферона не содержат интронов; полученный рекомбинантный интерферон биологически активен. Концен­ трация интерферона достигает 5 мг/л культуральной жидкости.

Перспективно использование в качестве продуцента интерферона эукариотных микроорганизмов - Saccharomyces cerevisiae. Эти продуценты характеризуются отработанной технологией их ферментации в промышленных условиях, легко сепарируются, не содержат токсичных и пирогенных веществ, как у грамотрицательных бактерий; могут осуществлять процессинг, т.е. отщеплять сигнальный пептид; обладают собственными сайтами инициации и терминации. Рекомбинантные препараты интерферонов (реаферон-ЕС, интераль и др.) применяются, в первую очередь, при острых и хронических вирусных гепатитах, герпетических поражениях, гриппе и др. Показана эффективность интерферонов при лечении цитомегаловирусной инфекции, различных бактериальных инфекций (гнойно-септические осложнения у новорожденных, у хирургических больных, хламидиоз и др.). Интерфероны используются в комплексной терапии при онкологических заболеваниях. Наряду с монопрепаратами интерферона в клинической практике используются комбинированные формы: виферон (с витамины С и Е), кипферон (с иммуноглобулинами M,A,G) и др.

3.2. Интерлейкины. Эритропоэтин

Группа цитокинов, обладающих провоспалительными, ростовыми и другими регуляторными функциями в межклеточных взаимоотношениях иммунной, нервной, эндокринной и кроветворной систем носит общее название «интерлейкины» (ИЛ1, ИЛ2,....ИЛ25). Эти биологически активные соединения вырабатываются лейкоцитами, моноцитами, макрофагами и др. Синтез интерлейкинов начинается в ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей и запускает комплекс защитных реакций организма. Стимулируется функция лейкоцитов, наблюдается активация клональной пролиферации и дифференциации Т и В-лимфоцитов, усиление эффективного потенциала цитотоксических Т-лимфоцитов (СД8-клеток) и естественных киллеров (NK-клеток), а также усиление функциональной активности мононуклеарных фагоцитов и антигенпрезентирующих клеток, увеличение синтеза плазматическими клетками специфических иммуноглобулинов большинства изотипов, наряду с уменьшением