3 курс / Фармакология / Биотехнологические_способы_получения_лекарственных_препаратов_Фауст

набирается стерилизующая доза. После выключения такая стерилизационная установка становится абсолютно безопасной в радиационном отношении.

Значительный опыт по использованию радиационной стерилизации биотехнологических препаратов накоплен при обработке антибиотиков: стерилизации подвергались расфасованные по флаконам лиофильно высушенные субстанции, соли антибиотиков и их препараты с разными наполнителями.

В ряде случаев препараты искусственно заражали микроорганизмами разных видов и их спорами. Стерилизующая доза в 2,5 Мрад обусловливала гарантированную стерильность. При этом облученные препараты — большинство антибиотиков (природные и полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины и ряд других) сохраняли активность и удовлетворяли фармакопейным тестам. Исключение составляли полиены, т.е. структуры с сопряженными двойными связями (например, нистатин, который при облучении заметно терял активность).

При сравнении их с необлученными препаратами можно было выявить некоторые отличия: белые (бесцветные) порошки теряли «блестящий» оттенок, приобретая матовый, а порошки красного (актиномицины) и желтого (тетрациклины) цвета тускнели.

Под влиянием облучения изменяется и кристаллическая решетка стекла. Оно темнеет, мутнеет и приобретает, таким образом, непривлекательный с коммерческой точки зрения вид, хотя полностью сохраняет свои функциональные качества. Потемнение обратимо, но при комнатной температуре исчезает медленно (в течение нескольких месяцев). Не выпускать облученные препараты в течение такого срока в аптечную сеть — значит сократить для потребителя срок годности облученных серий. Теоретически для изготовления флаконов и ампул можно использовать стекло с некоторыми редкоземельными элементами, однако это стекло слишком дорого для изготовления из него сотен миллионов единиц стандартных изделий.

Лекция 8

ВАКЦИНЫ

8.1. Характеристика вакцин

Вакцины (Vaccines) - препараты, изначально предназначенные для профилактики инфекции, для создания активного иммунитета. Основным действующим началом каждой вакцины является иммуноген, т. е. корпускулярная или растворенная субстанция, несущая на себе химические структуры, аналогичные антигенным компонентам возбудителя заболевания, вызывающим иммунный ответ. Предупреждение распространения инфекций с помощью иммунизации, без сомнения, является одним из величайших дости­ жений человечества в области медицины. По данным Всемирной организации здравоохранения и Детского фонда Организации Объединенных Наций за 2007 год, благодаря вакцинации против четырех болезней - коклюша, дифтерии, столбняка (КДС) и кори - за год было предотвращено почти 2,5 миллиона случаев смерти во всех возрастных группах. В 2006 году глобальный охват детей грудного возраста вакцинацией против КДС достиг 79% по сравне­ нию с 20% в 1980 году. В более широких масштабах стали также применяться и некоторые недостаточно используемые вакцины, включая вакцины против гепатита В, краснухи и желтой лихо­ радки. В 2006-2007 годах в разных странах испытания проходили 25 новых вакцин. Технология разработки и производства вакцин длится несколько лет, потому что вакцина испытывается по многим тестам, причем каждый следующий тест проводится только после успеха предыдущего; используются очень хорошо оборудованные и достаточно дорогие технологические линии. За XX столетие средняя продолжительность

жизни людей увеличилась примерно на 30 лет, что в немалой степени обусловлено массовой вакцинацией. Половина существующих вакцин появилась в течение последних 25-30 лет, что соответствует раз­ работке примерно одной вакцины в год, по сравнению с одной в пять лет, как это было в более ранний период. Как известно, эффективность вакцинации связана с индукцией протективного гуморального и/или клеточного иммунного ответа, который в свою очередь определяется особенностями структуры антигенов возбудителей, против которых производится вакцинация. Также ее эффективность обусловлена характером взаимодействия микро­ организма с системой врожденного иммунитета.

В настоящее время успешно используются вакцины против патогенов, вызывающих остро текущие инфекции. Для латентных или хронических заболеваний, вызываемых такими возбудителями, как ВИЧ, герпес-вирус человека, вирус гепатита С, микобактерии туберкулеза и др., а также болезней, вызываемых микроорганизмами, характеризующимися внутривидовой изменчивостью (серологические варианты; антигенный дрейф или шифт), эффективные вакцины необходимо разрабатывать.

С развитием знаний о функционировании иммунной системы сфера применения вакцин постоянно расширяется. Разрабатываются препараты для иммунотерапии онкологических заболеваний. В перспективе - конструирование вакцин для лечения и предупреждения аллергии, аутоиммунных заболеваний. К 2000 году объем продаж вакцин в мире составил почти 4 млрд. долларов, в 2004 около 10 млрд. долл., к 2015 ожидается реализация на 30-40 млрд. долларов. Как известно, основу каждой вакцины составляют протективные антигены, представляющие собой лишь небольшую часть микробной клетки или вируса и обеспечивающие развитие специфического иммунного ответа. Протективные антигены по химической природе могут быть белками, гликопротеидами, липополисахаридобелковыми комплексами. Они могут быть структурными компонентами микробной клетки (коклюшная палочка, стрептококки и др.), секретироваться ими (бактериальные токсины),

ау вирусов располагаются преимущественно в составе суперкапсида или капсида вириона. Для вакцинации используются живые, убитые микроорганизмы, их структурные

компоненты и вторичные метаболиты в качестве чужеродных антигенов, спо­ собных вызвать специфический иммунитет в организме. В первую очередь очень важны такие свойства микробных белков, жиров, углеводов и их комплексов в качестве вакцин как эффективность (антигенность и иммуногенность) и безвредность для человека. Общеизвестна классификация, подразделяющая вакцины на: живые, убитые, химические и анатоксины. Столь же актуально классифицировать вакцины на: субъединичные, генноинженерные, синтетические, съедобные, терапевтические , противоопухолевые, ДНКвакцины; а также форсифицированные и комбинированные.

Живые вакцины получают путём ослабления (аттенуации) вирулентности, с сохранением антигенной стуруктуры и иммуногенности потенциально патогенных микроорганизмов (чумная палочка, бруцеллы, возбудитель туляремии). Аттенуируются штаммы физическим (изменение температурного режима, осмотического градиента, воздействием УФЛ и др.) и химическим (низкие концентрации антибиотиков, желчи, красителей и др.) способами, пассажем на невосприимчивых животных; курином эмбрионе и культуре тканевых клеток в случае вирусов.

Вакцинный штамм, после введения, размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный инфекционный процесс. У большинства привитых вакцинальная инфекция протекает без клинических симптомов и приводит к формированию, как правило, стойкого иммунитета. Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи (Рудивакс), кори (Рувакс), полиомиелита (Полно Сэбин Веро), паротита (Имовакс Орейон). Живые вакцины выпускаются в лиофилизированном виде (кроме полиомиелитной).

На фоне преимуществ живых вакцин имеется и одно предостережение, а именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно

протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины. Эффективность живых вакцин определяется в конечном счете способностью аттенуированного микроорганизма размножаться в организме привитого, воспроизводя иммунологически активные компоненты непосредственно в тканях. Живые вакцины наиболее иммуногенны, но есть трудности в стандартизации и особые требования к транспортировке и условиям длительного хранения.

Инактивированные вакцины получают способами физической и химической инактивации высокопатогенных штаммов полноценных в отношении вирулентности и антигенной структуры (так возбудители коклюша инактивируются формалином, лептоспиры — высокой температурой, холерный вибрион - формалином). Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными. При использовании убитых вакцин иммунизирующий эффект зависит от количества иммуногена, вводимого в составе препарата, поэтому с целью создания более полноценных иммуногенных стимулов приходится прибегать к концентрации и очистке микробных клеток или вирусных частиц. С целью усиления иммунного ответа нередко требуется применение нескольких доз (бустерная иммунизация). В целом инактивированные вакцины достаточно иммуногенны, менее реактогенны чем живые, легко стандартизируются, их проще хранить, транспортировать. Иммунизирующую способность инактивированных и всех других нереплицирующихся вакцин удается повысить путем: - сорбции иммуногена на крупномолекулярных химически инертных полимерах; - добавления адъювантов, стимулирующих иммунные реакции организма; - заключения иммуногена в мельчайшие капсулы, которые медленно рассасываются, способствуя депонированию вакцины в месте введения и пролонгированию действия иммуногенных стимулов.

Химические вакцины состоят из компонентов клеток микроорганизмов, включающих протективные антигены, способные обеспечить адекватный иммунный ответ. Чаще это макромолекулярные гликоили липопротеиды микробных клеток, т.е. основные антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. Примерами химических вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae, против менингококка типа А, брюшнотифозная спиртовая вакцина, содержащая Vi - антиген возбудителя, полисахаридные вакцины (Менинго А+С, Акт-ХИБ, Пневмо 23, Тифим Ви), ацеллюлярные коклюшные вакцины и др. Такие вакцины стандартны, у них низкая реактогенность, но и слабая иммуногенность. Анатоксины получают путём выделения, очистки и инактивации вторичного метаболита микроорганизмов - экзотоксина. Эти препараты представляют собой бактериальные токсины, обезвреженные воздействием формалина при повышенной температуре с последующей очисткой и концентрацией. Анатоксины сорбируют на различных минеральных адсорбентах, например на гидроокиси алюминия. Адсорбция значительно повышает иммуногенную активность анатоксинов. Это связано как с созданием «депо» препарата в месте введения, так с адъювантным действием сорбента, вызывающего местное воспаление, усиление плазмоцитарной реакции в регионарных лимфатических узлах. Анатоксины характеризуются достаточной иммуногеностью и специфичностью, создают прочный, активный, приобретённый иммунитет. Технология получения анатоксина из дифтерийного экзотоксина разработана в 1922 году Г.Рамоном.

Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae культивирован на жидкой питательной среде, затем из культурной жидкости выделен и очищен дифтерийный экзотоксин и инактивирован 0,3-0,4% раствором формалина в нейтральной среде при 37°С в течение 1 месяца. Инактивированный токсин с сохранённой антигенной структурой и иммуногенностью - анатоксин адсорбирован на гидрате окиси алюминия (адъювант). Таким же способом получают столбнячный, стафилококковый, ботулинический и другие анатоксины.

Генно-инженерные вакцины, полученные технологией рекомбинантной ДНК и содержащие продукты экспрессии отдельных генов микроорганизма, наработанные в специальных клеточных системах (протективные антигены различных возбудителей, синтезируются в дрожжевых клетках или в кишечной палочке). Особую группу генетических вакцин составляют ДНК-вакцины, которые могут использоваться не только в профилактических, но и в терапевтических целях для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, аллергических состояний, злокачественных ново­ образований. Столь же актуально получение съедобных вакцин.

При разработке рекомбинантной вакцины против гепатита В, гены вируса, кодирующие синтез поверхностного неинфекционного антигена - HesAg встраиваются в вектор на основе плазмиды. Далее этот вектор трансфицируется в дрожжевые клетки (Saccharomyces cerevisiae). Модифицированная дрожжевая клетка начинает синтезировать HB,Ag. Последний выделяется из культуральной среды, очищается. Полученная таким образом рекомбинантная вакцина содержит около 95% HB,Ag и до 5% дрожжевого белка, но в нем полностью отсутствует ДНК дрожжевой клетки. Вакцинный антиген адсорбируется гидроксидом алюминия.

ДНК-вакцины представляют собой генетические структуры или фрагменты ДНК, выделенные из клеток патогенных микроорганизмов, опухолевых клеток и др.; они ответственны за синтез протективных антигенов микроорганизмов, опухолъассоцинрованных антигенов и др., вызывающих в организме иммунный ответ. Такие генетические структуры при помощи плазмидных либо вирусных векторов трансфицируются в клетки человеческого организма, экспрессируются и синтезируют опухолеспецифические, микробные и др. белки (протективные антигены), вызывающие иммунный ответ либо активирующие защитные силы организма при той или иной патологии. Съедобные вакцины. Съедобные или мукозные вакцины впервые получены Мэйсон в 1992 году путем клонирования гена, детерминирующего HBtAg вируса гепатита В в клетках табака. Трансгенный табак при росте продуцирует наряду с растительными белками и НВ Ag.

Конъюгированные вакцины. Некоторые бактерии, вызывающие такие опасные заболевания, как менингиты или пневмонию (гемофилюс инфлюэнце, пневмококки), имеют антигены, трудно распознаваемые незрелой иммунной системой новорожденных и грудных детей. В конъюгированных вакцинах используется принцип связывания таких антигенов с протеинами или анатоксинами другого типа микроорганизмов, хорошо распознаваемых иммунной системой ребенка. Протективный иммунитет вырабатывается против конъюгированных антигенов.

Терапевтические вакцины. Применение инактивированных вакцин с лечебной целью, с целью стимуляции иммунного ответа известно при хронической гонорее, хронической стафилококковой инфекции и других хронических инфекционных заболеваниях. В настоящее время спектр применения терапевтических (лечебных) вакцин нацелен не только на хронические заболевания, вызванные бактериями или вирусами (в частности, вирусами гепатитов В и С, вирусом папилломы, ВИЧ), но и на опухоли (прежде всего, меланому, рак молочной железы или прямой кишки), аллергические или аутоиммунные болезни (рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит).

8.2. Технологии получения вакцин

Бактериальные и вирусные вакцины в силу многокомпонентности и многостадийности технологии разрешено производить на тех предприятиях, которые могут соблюдать основные принципы GMP. Для производства вакцин необходима специальная технологическая линия, укомплектованная соответствующим оборудованием. Важен автоматический контроль и регулирование технологического процесса, включающий постоянную в динамике производства вакцины регистрацию и регулирование отдельных

этапов. Столь же актуально соблюдение стерильности на всех этапах получения вакцин. Исключение как внешней (воздух, оборудование, персонал), так и внутренней (использование стандартного, соответствующего ГОСТу субстрата для подготовки питательных сред при культивировании вакцинных штаммов; использование животных тканей и клеток, куриных эмбрионов, полученных от здоровых животных и птиц, выращенных в специализированных хозяйствах, необходимых для культивирования вирусов) контаминации посторонней микрофлорой. Очень важно в производстве вакцин строгое соблюдение технологии, применение стандартных методик, сырья и реактивов. В производстве используются только те химические вещества, которые отвечают требованиям международной или национальной фармакопеи и подвергаются входному контролю.

В соответствии с требованиями ВОЗ не допускается использование, например, пенициллина и других бета-лактамов на любой стадии производства вакцин. Разрешается использование других антибиотиков, но их количество в конечном продукте ограничивается. Также в процессе изготовления вакцин используются только такие раство­ рители, стабилизаторы и консерванты, которые не оказывают негативного влияния на качество вакцины и не вызывают побочного действия на вакцинируемый организм. При хранении и транспортировке требуется соблюдение «Холодовой цепи», т.е. бесперебойное обеспечение оптимального температурного режима хранения и транспортирования медицинских иммунобиологических препаратов, в том числе вакцин на пути их следования от предприятия-изготовителя до вакцинируемого. Производство некачественной вакцины, нарушение условий хранения и транспортировки, как и неправильная техника введения человеку вакцины, аллергия у прививаемого могут приводить к поствакцинальным осложнениям. В технологии производства живых, инактивированных, субъединичных вакцинных препаратов вначале необходимо наработать путем ферментации биомассу микроорганизмов, чтобы иметь в достаточном объеме микробные антигены для изготовления вакцин в промышленных масштабах. Для производства ДНК-вакцин требуется масштабная амплификация ДНК, кодирующего синтез белка — иммуногена. Для продукции синтетических, пептидных вакцин требуются в качестве субстрата в достаточном объеме различные аминокислоты и их производные.

Генно-инженерные вакцины создаются на основе технологии рекомбинантной ДНК. Биомасса модифицированных микроорганизмов нарабатывается ферментационной технологией.

При производстве живых и инактивированных вакцин предварительно подготавливается посевный материал и среда культивирования. Биомасса вакцинных штаммов нарабатывается в биореакторах глубинной ферментацией (бактерии, дрожжи) или поверхностной на твердых питательных средах (мицелиальные грибы). Процессы выполняются в строго асептических условиях, исключающих контаминацию посторонней микрофлорой, фагами. В случае получения живой вакцины биомассу аттенуированного штамма концентрируют, стандартизируют по количеству микроорганизмов в единице объема, лиофилизируют со стабилизирую­ щей средой, фасуют в ампулы или флаконы. Срок хранения лиофилизированных живых вакцин 1-2 года при 4-8°С.

При получении убитых вакцин микроорганизмы концентрируют, стандартизируют по числу микробных клеток в единице объема, инактивируют. Далее лиофилизация, фасовка и упаковка во флаконах или ампулах, хранение.

При создании субъединичных вакцин клетки микроорганизмов лизируют, выделяют вакцинный антиген из клеточного детрита путем сорбции, фильтрации, хроматографии и др. Далее конъюгация антигена с иммуномодуляторами, адъювантами, стабилизация.

Получение комбинированной вакцины Входящие в состав комбинированной вакцины «Инфарникс Гекса», столбнячный и дифтерийный анатоксины получают обработкой формальдегидом очищенных токсинов Corybacterium diphtheriae и Clostridium tetani.

Компоненты ацеллюлярной коклюшной вакцины получают путем их выделения и очистки

из культуры Bordetella pertussis. Дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и компоненты ацеллюлярной коклюшной вакцины адсорбируются на солях алюминия. Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBV) продуцируется культурой рекомбинантных дрожжевых клеток (Saccharomyces cerevisiae), полученных методом генной инженерии; в их геном интегрированы гены вируса гепатита В, кодирующие поверхностный HBsAg. После накопления биомассы рекомбинантных дрожжевых клеток, из культуральной среды выделяется этот поверхностный антиген и тщательно очищается физико-химическими методами. При этом антиген спонтанно трансформируется в сферические частички диаметром 20 нм, в которых содержатся негликозилированные полипептиды антигена и липидный матрикс, состоящий, главным образом, из фосфолипидов, имеющих характерные свойства природного HBsAg.

Вирусы полиомиелита III типа культивируют in vitro на клеточной линии VERO, очищают и инактивируют с помощью формальдегида. Бактериальный полисахарид используется в качестве адъюванта, он конъюгируется со столбнячным анатоксином. После очищения конъюгат адсорбируют на гидрате окиси алюминия и лиофилизируют в присутствии лактозы, используемой в качестве стабилизатора. Препарат «Инфарникс Гекса» представляет собой суспензию для инъекций в одноразовом шприце и лиофилизированный порошок для инъекций во флаконе; содержимое шприца и флакона смешиваются перед использованием.

Получение вирусных вакцин Вакцинные штаммы вирусов нарабатываются в культуре тканевых клеток либо в куриных эмбрионах. Предварительно подготавливается культура тканевых клеток (первично-трипсинизированных или перевиваемых) или куриный эмбрион (7-9-11дневный) для культивирования вирусов. В асептических условиях вирусом заражается клеточная культура либо куриный эмбрион. Вирус репродуцируется, накапливается в клеточной культуре или в полости куриного эмбриона. Затем его выделяют, очищают, стандартизируют, лиофилизируют, фасуют в ампулы и укупоривают (в случае цельновирионных вакцин, живых или инактивированных). Живые вакцинные штаммы предварительно аттенуируются пассированием их на культуре клеток in vitro.

Один из традиционных методов ослабления вирусов - культивирование in vitro в животных клетках. Сначала патогенный вирус выделяют из зараженных клеток человеческого организма. Затем их пассируют в культуре клеток животного происхождения, тем самым аттенуируя, ослабляя «заразность» вируса. Для некоторых заболеваний, например краснухи, такой технологии бывает достаточно, чтобы получить вакцинный штамм.

Для получения субъединичных вакцин из вирусных частиц выделяются поверхностные (они наиболее иммуногены и специфичны) либо нуклеопротеидные антигены . Выделенные субстанции очищаются, стабилизируются, вносятся дополнительные компоненты (адъюванты, сорбенты, иммуномодуляторы и др.). Например, при получении вакцины коревой живой сухой на основе аттенуированного штамма J1-16 выполняются следующие этапы: из эмбрионов перепелов путем трипсинизации готовят культуру клеток для посева вакцинного штамма вируса кори J1-16.

После заражения культуру инкубируют в термостате при 36°С в течение 15 суток; культуральная жидкость, содержащая вирус проверяется на контаминацию посторонней микрофлорой и определяется титр вируса — как показатель биологической активности препарата. При разработке ассоциированной вакцины, содержащей наряду с вирусом кори, еще и штаммы паротита и краснухи, для их культивирования используется диплоидная клеточная линия ЭФЧJ15, полученная из легочной ткани эмбриона человека. Такая клеточная линия сохраняет жизнеспособность и биологическую активность на протяжении 60 пассажей и проявляет выраженную чувствительность к вышеуказанным вирусам. Дополнительное внесение в культуру клеток таких компонентов, как СаС12, аргинин и аминопептид, а также использование смеси сред 199 и Игла с двойным содержанием аминокислот значительно повышает репродукцию вирусов, существенно повышает их

титр. Положительные свойства диплоидной линии клеток состоят в том, что, кроме несомненного преимущества как вирусологической модели, клетки ЭФЧ-Л5 характеризуются пролиферативной активностью, хорошо культивируются статическим и роллерным способами, быстро восстанавливаются после криоконсервирования, сохраняя при этом высокую жизнеспособность и чувствительность к исследуемым вирусам; свободны от контаминации бактериями, грибами, вирусами и микоплазмами.

Получение противогриппозных вакцин В 2004 году около 13-15% реализованных вакцин составила гриппозная вакцина. Производство вакцины исчисляется несколькими сотнями млн. тривалентных инактивированных вакцинных доз в год, однако это покрывает потребности только 10-15% мирового населения. Разработаны технологии получения следующих гриппозных вакцин: - цельновирионные вакцины, они представлены живой противогриппозной вакциной, содержащей ослабленный вирус гриппа, выращенный в аллантоисной полости куриного эмбриона или инактивированной вакциной, также полученной пассированием на курином эмбрионе.

Лекция 9

ПРОБИОТИКИ

9.1. Пробиотики, свойства, получение

Пробиотики - это биопрепараты, содержащие живые микро­ организмы - симбионты человека, обладающие способностью восстанавливать нарушенную микроэкологию организма. При приеме внутрь они колонизируют слизистую оболочку соответст­ вующих отделов кишечника, продуцируют БАВ - органические кислоты, бактериоцины и другие метаболиты, подавляющие рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Пробиотики также благоприятно влияют на физиологическое состояние кишечника, оказывают детоксицирующее и иммуномодулирующее действие. У здорового человека микрофлора, населяющая кишечный, генитальный биотопы или слизистую ротовой полости (в этих биотопах больше всего различных микроорганизмов и это «ворота» кишечной, респираторной и мочеполовой инфекций) в своем большинстве представлена симбионтными микроорганизмами - это состояние эубиоза. При самых различных заболеваниях (инфекционные, соматические и особенно при патологии тех органов, где вегетирует симбионтная миклофлора) нарушается микроэкология в вышеуказанных биотопах, начинают доминировать случайные или транзиторные, в том числе условно-патогенные микроорганизмы (протей, кандида, гемолитический стрептококк, золотистый стафилококк, лактозонегативные энтеробактерии), а количество симбионтов уменьшается - это состояние дисбактериоза. Дисбактериоз в свою очередь отягощает либо является причиной других заболеваний.

Чтобы восстановить эубиоз, нарушенную микроэкологию, нужно восстановить в первую очередь популяционный уровень симбионтной миклофлоры, одновременно и

формируемую патогенными и условно-патогенными бактериями. Также значима и адгезивная способность микроорганизмов. Полезные биологические свойства пробиотиков способствуют не только коррекции микроэкологии, но и восстановлению нару­ шенных физиолого-биохимических процессов в организме в целом.

9.2. Технологии получения пробиотиков

Наиболее часто пробиотики разрабатываются на основе бифидобактерий и лактобацилл. Первый лечебно-профилактический препарат на основе живых бифидобактерий был изготовлен в 1956 году в Германии. Для ферментационного культивирования бифидобактерий и лактобацилл в качестве источника углерода необходимы углеводы, бикарбонат, диоксид углерода; как источник азота цистеин и др. Эти микроорганизмы требовательны к питательным средам, поэтому при культивировании дополнительно вносятся аминокислоты аланин, лизин и аргинин (в составе казеина), пуриновые и пиримидиновые основания (в составе дрожжевого автолизата), рибофлавин и биотин, минеральные соли (Mg, Мп и др.), обязательно глюкоза или лактоза. В качестве основного по объему субстрата при культивировании чаще всего используется обезжиренное, гидролизованное молоко. В целом сырье, используемое для приготовления этих питательных сред безвредно для человека. Длительность ферментации в биореакторе 10-15 часов, процесс останавливается в конце логарифмической - начале стационарной фазы развития микроорганизмов, в период их наибольшей биологической активности. После ферментации биомасса концентрируется при помощи специального оборудования (сепаратор и др.); далее в концентрированную биомассу вносятся компоненты поддерживающей среды, обеспечивающие длительное хранении микроорганизмов в жизнеспособном состоянии (желатин, сахароза, обезжиренное молоко); затем суспензия чистой культуры пробиотического штамма разливается в ампулы или флаконы, лиофилизируется.

Готовый препарат проверяется на отсутствие посторонней миклофлоры, учитывается численность жизнеспособных микро- организмов-симбионтов, оценивается их антагонистическая активность в отношении тест-штаммов. Разработана и освоена технология микрокапсулирования пробиотиков. Это заключение в тонкую оболочку из полимерных веществ природного происхождения. Оболочка позволяет защитить бактерии от влияния желудочного сока и других факторов среды, максимально локализовать их действие в кишечном биотопе. Пленочное покрытие представляет собой нанесенный и затем высушенный в псевдоожиженном слое раствор-суспензию, состоящую из инертных веществ, природного или синтетического происхождения (гидрооксиметилцеллюлоза и др.). Формы и состав таблеток в современных технологиях: таблетки двояковыпуклые или овальные; новые вспомогательные вещества в их составе оптимизируют кинетику высвобождения активной субстанции. Например, добавление в суспензию лактобацилл аэросила повышает сыпучесть измельченной сухой массы (это препарат «Лактобактерин»

вформе порошка). В зависимости от технологии производства современные пробиотики можно разделить на две группы. Первая группа пробиотиков (лечебные пробиотики) произ­ водится с использованием метода лиофильной сушки живых бактерий. Препараты выпускают в форме порошка, таблеток, капсул или свечей. Эти формы имеют длительные сроки годности и не требовательны к непродолжительным изменениям темпера­ туры хранения. Существенным является то, что процесс лиофилизации приводит бактерии в анабиоз (неактивное состояние). Для возвращения в активное физиологическое состояние им требуется 8-10 часов. Кроме того, в процессе лиофилизации бактериальные клетки могут терять специфические рецепторы - адгезины, поэтому длительность колонизации ими кишечного биотопа уменьшается. Вторая группа - жидкие пробиотики (биологически активные добавки - БАДы) из живых микробных клеток. Они хранятся в форме суспензии

вактивном состоянии и способны к колонизации желудочно-кишечного тракта уже через 2

часа после приема. Однако существенно сокращается длительность их хранения (1- 1,5 месяца), выше риск контаминации посторонней микрофлорой. Например, жидкие пробиотики «Нормофлорины», включают в свой состав бифидобактерии и лактобактерии в физиологическиактивном состоянии, а также органические кислоты, аминокислоты (в том числе незаменимые), микро- и макроэлементы, ферменты и пребиотики. «Нормофлорин-Б» приготовлен на основе штаммов B.bifidum, B.longum; «Нормофлорин-JI» - штаммов L. acidophilus.

Бактерии в препаратах находятся в биологически активном состоянии и начинают работать с первых минут попадания их на слизистую, они устойчивы к желудочному соку и активно колонизируют слизистую кишечника. Антагонистические свойства пробиотических микроорганизмов, присутствующих в свежеприготовленной жидкой форме более выражены, чем у тех же штаммов, находящихся в лиофилизированном состоянии; это может быть связано с присутствием в жидких формах пробиотиков более высоких концентраций уксусной, молочной кислот, перекиси водорода, а возможно и других антагонистических и иных регуляторных субстанций-метаболитов.

Жидкие пробиотики в качестве БАДов производятся в соответствии с нормами для пищевых продуктов, а не нормами для лекарственных биопрепаратов. В перспективе возможна замена живых микроорганизмов в составе препарата на их отдельные компоненты и продукты обмена (например, короткоцепочечные жирные кислоты, пептидогликаны клеточной стенки, ДНК). Также возможно создание в будущем криобанков микробиоценозов здоровых людей, которые могут быть в последующем использованы для аутоимплантации, для направленного конструирования аутопробиотиков.

Лекция 10 НАНОЛЕКАРСТВА

10.1. Наночастицы

Предполагая перспективы развития нанотехнологий можно привести сравнительные аналогии из истории. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе, в медицине и биотехнологии была понята спустя почти столетие после открытия микромира Левенгуком, благодаря трудам JI. Пастера, Р. Коха и других выдающихся исследователей (заметьте, спустя столетие). Иная ситуация в нанотехнологии. В 1959 году физик Р. Фейнман писал о том, что существует «поразительный сложный мир малых форм, мир атомов и молекул Когда-нибудь люди будут удивляться тому, что до 1960 года никто не относился серьезно к исследованиям этого мира». Впервые термин «нанотехнология» употребил Н. Танагути в 1974 году. Он назвал этим термином производство изделий размером в несколько нанометров. В 1980-х годах о наноконструкциях и их будущем писал Э. Дрекслер в книгах: «Машины создания: грядёт эра нанотехнологии» («Engines of Creation: The Coming Era of Nanotechnology») и «Nanosystems: Molecular Machinery,

Manufacturing, and Computation». Более чем в 60 странах ведутся исследования и разработки в области нанотехнологий, в том числе и в Казахстане. К началу 2006 года, по оценке журнала Nature Materials было создано порядка 130 лекарств и средств доставки лекарств на основе нанотехнологий. Таким образом, спустя всего лишь 30-40 лет после устремления взора ученых на наномир, нанотехнологии начали активно внедряться во все сферы человеческой деятельности, особенно в биологии и медицине. Вместе с тем некоторые ученые сравнивают нынешнее состояние нанотехнологии с состоянием компьютерной технологии 20-25 летней давности, когда в ходу еще были арифмометры, логарифмические линейки и т.д.