3 курс / Фармакология / Биотехнологические_способы_получения_лекарственных_препаратов_Фауст

апоптоза мононуклеаров и нейтрофилов. Производство человеческого интерлейкина основано на техно­ логии рекомбинантной ДНК. Ген человеческого интерлейкина встраивается в плазмидный вектор и трансформируется в бакте­ риальные клетки E.coli

либо в дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae.

Так плазмидная конструкция , трансформированная в дрожжевые клетки содержит ген человеческого ИЛ2 и фрагмент ДНК маркерного пептида, кодирующие синтез химерного белка. Последний не только стабилизирует, защищает от внутриклеточного расщепления человеческий белок, но и в последующем облегчается очистка и выделение ИЛ2 путем аффинной хроматографии. Известны следующие коммерческие препараты реком­ бинантного интерлейкина (ИЛ2): Ронколейкин (Sacch. cerevisiae), Proleukin, Teceleucin (E.coli) и др.

Эритропоэтин. Ежедневно в организме человека образуется более 200 миллиардов клеток крови. Этот процесс регулируется различными механизмами с участием системы факторов роста клеток костного мозга. Факторы роста миелоидных клеток костного мозга в орга­ низме продуцируются различными типами клеток: фибробластами, эндотелиальными клетками, макрофагами, Т-лимфоцитами.

Четыре человеческих белка - ростовых фактора в настоящее время производятся с использованием рекомбинантных штаммов микроорганизмов: - грамостим, филграстим и ленограстим - это факторы роста лейкоцитарного ростка; - эритропоэтин (ЭПО) или эпотин - это фактор роста эритроидного ростка.

Среди коммерческих препаратов, полученных технологией рекомбинантных ДНК по объему промышленного производства и реализации лидируют инсулин и эритропоэтин. Эритропоэтин - гликопротеин, вырабатываемый в почечной ткани и избирательно стимулирующий размножение и дифференцировку в костном мозге клетокпредшественников эритроцитов.

В качестве рекомбинантных штаммов-продуцентов эритропоэтина используются E.coli. B.subtilis и другие микроорганизмы, трансформированные плазмидными векторами, несущими ген человеческого эритропоэтина. Известны следующие зарубежные препараты рекомбинантного эритропоэтина: Рекормон, Эритростим, Эпокрин, Эпрекс и др. Эритропоэтин применяется в первую очередь для лечения анемии у больных с хронической почечной недостаточностью, а также при анемии у недоношенных детей, анемии после операции, облучения, при онкологических заболеваниях, при пересадке костного мозга и др.

Рекомбинантный фактор свертывания крови VIII В клетки почек детенышей хомячков (ВНК) трансфицирован при помощи вирусного вектора ген человеческого фактора свертывания крови VIII (FVIII). Питательная среда, используемая для культивирования этих клеток содержит раствор белков плазмы человека и рекомбинантный инсулин (стимулятор роста), но не содержит белков животного происхождения. Процесс очистки культуры клеток ВНК включает этап вирусной инактивацйи при помощи детергента с последующей ионообменной или ионоаф­ финной хроматографией с использованием иммобилизованных моноклональных антител, специфически связывающих белок — рекомбинантный фактор свертывания крови VIII.На основе рекомбинантного фактора свертывания крови VIII разработан гемостатический препарат «Когенэйт ФС», представляющий собой высокоочищенный гликопротеин, состоящий из нескольких пептидов. Препарат обладает такой же биологической актив­ ностью, как и фактор VIII, получаемый из плазмы крови человека. Применяется с целью профилактики и лечения кровотечений при гемофилии А.

Фермент - рекомбинантная проурокиназа Технология получения рекомбинантной проурокиназы основана на трансфекции E.coli плазмидным вектором со встроенным геном, кодирующим синтез человеческой проурокиназы. Выделяют генетически модифицированный штамм, продуцирующий целевой продукт. Отобранные трансформанты культивируют в оптимальных для накопления рекомбинантного

полипептида условиях. Очищают и проводят реактивацию экспрессированного продукта - белка. При получении плазмиды для экспрессии полипептида в клетках E.coli объединяют оперон с регулируемым промотором последовательности связывания с рибосомой ШайнДальгарно, инициирующий кодон, фрагмент ДНК, кодирующий целевой полипептид, один или два терминатора, располагаемых за указанным фрагментом. Для объединения используют плазмиду pBR 322, из которой удалены nic / bom область и/или часть резистентного к тетрациклину гена. В последнюю между сайтами Е coRI и Hind III вводят сайт множественного клонирования, предназначенный для встраивания терминатора транскрипции, фрагмента ДНК, кодирующего рекомбинантный белок и синтети­ ческого Tip - промотора. Получают полипептид с проурокиназной активностью, его молекулярная масса 54000. Да, состоит из двух цепей, соединенных дисульфидным мостиком. Фермент специфически катализирует превращение плазминогена в плазмин - протеазу, способную лизировать фибриновые сгустки. Проурокиназу рекомбинантную применяют в качестве тромболитического средства при лечении острого инфаркта миокарда в первые часы от момента развития заболевания.

Лекция 4 ФЕРМЕНТЫ

4.1. Характеристика ферментов

В 1836 году Т.Шванн выделил из желудочного сока вещество, способное расщеплять и растворять белки, это был пепсин. В том же году Я. Берцелиус опубликовал работу, в которой писал: «Мы имеем достаточные аргументы для предположения о том, что в растениях и животных между тканями и жидкостями происходят тысячи каталитических

процессов, вызывающих множество различных расщеплений. В них, возможно, мы откроем в будущем каталитическую силу живых тканей, из которых построены телесные органы».

Ферменты микробного, растительного и животного происхождения используются в медицинской практике как биопрепараты с целью диагностики, лечения и профилактики различных болезней человека. Особенно они эффективны при терапии наследственной патологии, обусловленной отсутствием либо недостаточностью того или иного фермента в организме. Задачами биотехнологии ферментов являются: - разработка технологического процесса получения ферментных препаратов для лечения и профилактики болезней человека; - разработка диагностических тест-систем, аналитических методов, основанных на каталитической активности и стерео­ избирательности ферментов. Ферменты - главные рабочие инструменты всего живого. Они отвечают почти за все химические реакции, проходящие в живом существе: обеспечивают энергией и строительными материалами; создают и разрушают сигнальные молекулы, нужные для регуляции жизненных процессов; защищают организм от чужеродных веществ. Еще ферменты перезаписывают и размножают наследственную информацию, то есть синтезируют ДНК и РНК. Наконец, участвуют в реализации этой информации - в синтезе самих себя и других белков.

Ферменты, как и иные глобулярные белки синтезируются на рибосомах, функционируют внутри клетки (эндоферменты) либо секретируются во внешнюю среду (экзоферменты). Многие эндо­ ферменты находятся в клетке в свободном состоянии, будучи просто растворены в цитоплазме; другие связаны со сложными высокоорганизованными структурами. Ферментативный набор клетки типичен, характерен для вида, генетически детерминирован. Вместе с тем различают конститутивные (жизненноважные, чаще эндогенные), присутствующие всегда в определенной концентрации в клетке и индуцибельные ферменты, концентрация которых зависит от наличия субстрата.

Клетка может сохранять жизнедеятельность без индуцибельных ферментов. Ферменты составляют основную массу функциональных белков клетки. Для некоторых энзимов время активной деятельности не превышает двадцати минут, позже они должны быть заменены. Другие энзимы остаются активными в течение нескольких недель, прежде чем они будут расщеплены и удалены из организма. Ферменты намного эффективнее химических катализаторов, кроме того более избирательны: могут извлекать из сложной смеси только одно вещество и превращать его не в несколько продуктов, а в один.

Начало изучению структуры ферментов было положено Д. Самнером, который впервые установил белковую природу ферментов. К настоящему времени описано около ISO ферментов в кристаллической форме, т.е. расшифрована их структура. Как и другие белки, ферменты характеризуются первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурой: - первичная структура - это последовательность аминокислот, соединенных между собой пептидными связями; - вторичная структура - регулирует конформацию полипептидной цепи в виде спирали посредством водородных связей между СО- и NH-группами на отдельных участках цепи; - третичная структура - проявляется специфической укладкой полипептидной цепи в глобулу с образованием гидрофобного ядра молекулы фермента. Стабилизируют ее все виды химических связей. Сильные связи - пептидные и дисульфидные; слабые - водородные, гидрофобные и электростатические; - четвертичная структура - организуется в результате ассоциации двух и более глобулярных единиц.

Первичную структуру ферментов определяют методом секвенирования - определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи (разрабатываются методы детекции первичной структуры белка путем пропускания полипептидазной цепи через нанопоры; при прохождении через нее конкретной аминокислоты подается соответствующий сигнал детекции). Третичную структуру фермента определяют ренттеноструктурным анализом.

В структуре фермента различают активный центр и аллостерический, т.е. «имею­ щий иную пространственную структуру» центр. Активный центр фермента образован из

остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных полипептидных цепей, пространственно сближенных. Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента.

Активный центр представлен сосредоточением неполярных химических групп, специфически взаимодействующих с субстратом. Он не имеет определенных топографических границ, очерчивающих его от остальной части полипептида. Активные центры ферментов включают специфические аминокислотные остатки, являющиеся донорами (-СООН, -NH3, - SH) или акцепторами (-СОО-, -NH2, -S-) протонов. Один и тот же тип активного центра может использоваться в разных ферментах. Так, ферменты, гидролизующие ДНК (экзонуклеазы и эндонуклеазы), активируют воду с помощью комплекса ионов магния с карбоксильными группами и присоединяют ее к ДНК, которая при этом расщепляется на фрагменты. Такой же тип активного центра имеет фермент ДНКполимераза, но она сшивает два основания через фосфатные группы. Тот же активный центр, но активирует не воду, а гидроксильную группу сахарного остатка основания. Поэтому вместо расщепления ДНК на фрагменты, наоборот, имеет место их соединение с образованием из фрагментов целой молекулы ДНК. Если специфичность взаимодействия фермента с субстратом обусловлена свойствами активного центра, то аллостерический центр имеет значение в регуляции каталитической активности фермента. Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, при присоединении к которому низкомолекулярных соединений - ингибиторов или эффекторов изменяется третичная структура белковой молекулы. Вследствие этого меняется конфигурация активного центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Этот механизм лежит в основе аллостерической регуляции каталитической активности фермента, ее усиления либо подавления.

Для объяснения пространственного взаимодействия между ферментом и субстратом Э.Фишер предложил модель «ключ к замку». В последующем были разработаны различные математические модели для описания кинетики ферментативных реакций (Моно, Михаэлис и др.). В 1948 году Л.Полинг предположил, что каталитическое действие ферментов достигается стабилизацией переходного состояния химических реакций путем взаимодействия с активным центром фермента, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально. Согласно гипотезе «индуцированного соответствия» (модель Кошланда) ферментативная активность может регулироваться небольшими молекулами, отличными от молекул субстрата или продуктов реакции. Было показано существование аллостерических центров, разработаны методы регуляции активности ферментов

Свойства ферментов: - высокая эффективность действия ферментов; - ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции, т.е. они не расходуются (но некоторые ферменты в конце реакции подвергаются модификации и даже распаду, а не освобождаются в неизменном виде). Очень незначительное количество фермента катализирует расщепление большого количества субстрата; - высокая избирательность ферментов к субстратам (субстратная специфичность) и к типу катализируемой реакции (специфичность действия, т.е. способность катализировать только определенный тип химической реакции); избирательность действия ферментов на субстрат обусловлена k o i«формационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента, и уникальной структурой активного центра. У некоторой группы ферментов наблюдается слабая избирательность действия, это группоспецифические ферменты.

Избирательность их действия зависит от типа химической связи в молекуле субстрата. Так, пепсин расщепляет белки животного и растительного происхождения, хотя они могут существенно различаться как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы и жиры. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная -СО- NH-связь. Местом действия других группоспецифических ферментов - липаз, катализирующих гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты является сложно­ эфирная связь.

Моноспецифические ферменты способны катализировать превращение только единственного субстрата (к примеру, стереохимическая специфичность у бактериальной аспартатдекарбоксилазы, катализирующей отщепление СО только от L-аспарагиновой кислоты с превращением ее в L-аланин);

-аллостерическая регулируемость ферментов как биокатализаторов; чувстви­ тельность

кингибиторам и эффекторам ферментативной реакции; активирующее влияние на скорость ферментативной реакции оказывают вещества органической и неорганической природы. Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока; желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а ряд ферментов - также витамином С. Особенно часто активаторами выступают ионы двухвалентных и, реже, одновалентных металлов (Со, Mg, Zn, Fe, Са и др.). Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляю т пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов. Ингибиторы или антиферменты, вызывают торможение каталитической реакции (частичное или полное): ингибиторы трипсинасоевый и сывороточный антитрипсин, антифермент орнитиндекарбоксилаза; - высокая чувствительность ферментов к неспецифическим физико-химическим факторам среды - температуре, pH, ионной силе раствора и т.д.; термолабильность и pH-зависимость (величина pH влияет на сродство фермента к субстрату, на степень насыщения фермента субстратом, на стабильность его структуры).

7.2. Технологии получения ферментов 143 По типу катализируемой реакции ферменты подразделяют на 6 классов: -

оксидоредуктазы, ответственны за окислительно-восстановительные реакции (глюкозооксидаза, каталаза, дегидрогеназа и др.); - трансфсразы, катализируют перенос химических (функциональных) групп с одного субстрата на другой (протеинкиназа, пируваткиназа, ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза и др.); —гидролазы, осуществляют гидролиз, расщепление химических связей субстрата (амилазы, протеиназы, цсллюлазы, псктиназы, липазы и др.); - лиазы, катализируют отщепление либо присоединение к субстрату химических групп (аспартаза, фумараза и др.); - изомеразы, осуществляют структурные изменения в пределах одной молекулы субстрата или изомеризацию (глюкозоизомераза, триозофосфатизомераза и др.); - лигазы, ответственные за синтез из простых более сложных соединений с затратой энергии (ДНК-лигаза, аспарагинейнтетаза, пируваткарбокеилаза и др.).

4.2. Технологии получения ферментов

1) Технология микробыологического синтеза включает три основных этапа:

а) ферментация, наработка биомассы микроорганизмов, про­ дуцирующих фермент; участок ферментации укомплектован несколькими биореакторами (100-2000 л емкостью); процесс био­ синтеза проходит в асептических условиях, периодическая ферментация, аэрация и гомогенизация культуральной среды. Оптимально использование биореакторов с регулятором дифференциального давления и теплового расходомера кислорода. Наиболее важными факторами являются температура и содержание кислорода в культуральной среде. Для этого в оборудовании используют специальную мембрану для контроля содержания кислорода в растворе. Газообразный кислород растворяется в жидкости, поступая из специальной емкости. Уровень содержания кислорода в растворе зависит от разницы давлений между камерой с газообразным кислородом и раствором. Эта разность регулируется специальной установкой, т.е. имеет место не просто аэрация либо

оксигенация, а тонкая регуляция этого процесса, ибо кислород, растворенный может очень быстро истощаться, тем самым нарушаются процессы биосинтеза;

б) предварительная очистка ферментов с использованием сепараторов, ультрацентрифуг, нутчфильтров, установок для мембранной фильтрации, в том числе на полых волокнах и другого оборудования для отделения клеток от культуральной жидкости, а также внеклеточных продуктов;

в) этап заключительной, тонкой очистки фермента осуществляется с использованием вакуум-выпарных установок, экстракторов, ионообменных колонок и другой аппаратуры для полной очистки белка, до гомогенной массы фермента.

Рекомбинантные ферменты: - пуриннуклеозидфосфорилаза, уридинфосфорилаза и тимидинфосфорилаза полученные путем клонирования генов, кодирующих эти ферменты в составе плазмидных векторов в E.coli BL21(DE3). Ферменты могут быть использованы как противовирусные, противоопухолевые препараты в виде модифицированных нуклеотидов - виразол, кладрибин, флударабин; - щелочная фосфатаза, продуцент рекомбинантный штамм E.coli BL21(DE3); - химозин,выделен из эукариотического организма и внедрен в прокариоты - E.coli, Aspergillus awamori, Kluyveromyces lactis; -

ацетолактатдекарбоксилаза, продуцируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis и т.д. Сочетание фермента с антибиотиком - «Ируксол», содержит клостридил-пептидазу из

Clostridium histolyticum и левомицетин и т.д.

2)Технология выделения ферментов из органов и тканей млекопитающих. Для успешного выделения фермента из клеточного содержимого необходимо очень тщательное измельчение (гомогенизация) исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует присутствие защитных добавок, в частности SH-содержа- щих соединений (цистеина, глютатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.).

Важно поддерживать на всех этапах выделения фермента низкую температуру, так как при положительной температуре они теряют биологическую активность. Типична экстракция глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Далее для более тонкой очистки фермента используется ионообменная хроматография, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Одна из модификаций адсорбционного метода - аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке с адсорбентом, а все сопутствующие белки остаются в растворе. Затем изолированный фермент элюируют с колонки. Данная технология применима при выделении трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы, гиалуронидазы, тималина, цито­ хрома С, панкреатина и других ферментов животного происхождения.

Лекция 5

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

5.1. Характеристика антител

История открытия антител начинается с золотой эры микро­ биологии, с периода открытия многих возбудителей инфекционных болезней, когда врачи и ученые пытались найти лекарственные средства избирательно поражающие патогены, не нанося вреда клеткам макроорганизма. Врач и бактериолог П. Эрлих посвятил свою жизнь поиску лекарств, химиопрепаратов, которые целенаправленно поражали бы патоген как «магическая пуля», что позволяло бы воздействовать только на очаг болезни, не повреж­ дая здоровые ткани. В результате многочисленных исследований ему удалось найти эффективное для того времени средство - химиопрепарат, который поражал возбудитель сифилиса - бледную трепонему. В результате изучения механизмов иммунитета в сыворотке переболевших той или иной инфекцией были выявлены вещества, которые

избирательно связывались с возбудителем. Эти белковые соединения были названы антителами.

Терапевтическое применение антител началось в 1891 году, сразу же после того, как Беринг и Китазато показали, что сыворотка морских свинок, выживших после введения дифтерийного или столбнячного токсинов, приобретала способность защищать других животных от действия этих токсинов. В организме каждый клон В-лимфоцитов продуцирует один вид антител, а различный спектр клонов В-лимофоцитов формируется за счет перераспределения сегментов вариабельных генов антител (V-генов).

После презентации антигена В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела и в долгоживущие клетки памяти. Далее при повторной иммунизации происходит повышение аффинности антиген-специфичных клонов антител, связанное с изменениями в V-генах, а также про­ дукцией новых преадаптированных клонов В-лимфоцитов. Клон, продуцирующий антитела одной специфичности - моно­ клональные антитела можно получить гибридомной технологией (путем гибридизации В- лимфоцитов с миеломными клетками) и технологией рекомбинантной ДНК (рекомбинацией генов, кодирующих синтез константных и вариабельных доменов антител). Вплоть до открытия гибридомной технологии и технологии рекомбинантной ДНК антитела использовались в качестве лечебного препарата (иммунные сыворотки, их введение в организм вызывало развитие пассивного иммунитета) или диагностикума (препараты, содержащие готовые антитела, позволяющие опре­ делять in vitro комплементарные им антигены).

Внедрение в медицинскую практику гибридомной технологии позволило получать и применять высокоспецифичные, высокоизбирательные моноклональные антитела не только для нейтрализации возбудителя, но и с целью иммуносупрессии при трансплантации органов и тканей, для адресной доставки лекарств к тем или иным тканям организма, для лечения соматической патологии, онкозаболеваний и др. Технологии рекомбинантной ДНК позволили получать не только полноценные, двухвалентные, двухцепочечные (Fcконстантный фрагмент, Fabl и РаЬ2-вариабельные фрагменты ), но и одноцепочечные, неполноразмерные (только Fab-фрагмент), так называемые мини-антитела, используя с этой целью генетически модифицированные клетки микроорганизмов, растений и животных. Рекомбинантные антитела, как полноразмерные, так и их фрагменты составляют треть всех разработанных в биотехнологии рекомбинантных белков.

Рынок моноклональных антител является наиболее быстро развивающимся сегментом фармацевтической индустрии. К примеру в 2007 году реализация терапевтических моноклональных антител принесла только биотехнологическим компаниям США больше 26 млрд. долларов прибыли, основная часть моноклонов была востребована для терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний. А препарат «Ритуксан» (применяется при опухолях и аутоиммунных артритах), разработанный на основе терапевтических моноклональных антител по объему реализации занимает шестую позицию среди всех медицинских препаратов. Производством моноклональных антител в настоящее время занимаются более 200 биотехнологических компаний, в основном из США, Японии и Германии.

Рекомбинантные антитела (химерные, гуманизированные, конъюгированные; двуцепочечные и одноцепочечные или мини-антитела) по структуре и функциональным характеристикам существенно отличаются.

а) химерные антитела Химерные (или гибридные) антитела (chimaeric antibodies) - это антитела, в которых константный домен мышиных антител замещен соответствующим константным доменом иммуноглобулина человека. При помощи рекомбинантной технологии соединяются разнородные молекулы ДНК, кодирующие человеческий Fcфрагмент и мышиный Fab-фрагменты антитела. Поскольку иммуногенные и эффекторные (взаимодействие с системой комплемента, фагоцитами и др.) свойства антител опре­ деляются в основном его константным доменом, а специфичность взаимодействия с

антигеном определяется вариабельным доменом, то, естественно, химерные антитела (Fcфрагмент челове­ ческий, а Fab-фрагмент мыши­ ный) более эффективны и вызывают значительно меньше осложнений при сохранении специфичности, аффинности и авидности, свойственных мышиным моноклональным антителам.

б) гуманизированные антитела. В структуре гуманизированных антител мышиное происхождение имеют только небольшие антигенсвязывающие гипервариабельные участки (CDR) вариабельного домена — Fv-фрагмента. Если у химерных антител варибельный домен полностью является мышиным, то у гуманизированных только его часть животного происхождения. Fvфрагмент состоит из трех CDR участков (CDRI, CDRII, CDRIII). С помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза осуществляют последовательную замену только одного или двух CDR участков ДНК человека на соответствующий CDR участок ДНК мыши.

Таким образом гуманизированные антитела в отличие от химерных содержат еще меньше чужеродного белка (только CDR мышиного происхождения) и соответственно вероятность иммунного отторжения существенно ниже. Это в основном снимает проблему иммунного ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагностическими целями.

в) одноцепочечные антитела Наряду с полноразмерными химерными и гуманизированными антителами генная инженерия позволяет получать и одноцепочеч­ ные, мини-антитела, состоящие только из участков Fv-фрагмента (scFv). Это вариабельные домены легких и тяжелых цепей (VI и Vh) иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пептидным линкером; константные домены исходного мышиного антитела полностью отсутствуют. Таким образом, одноцепочечные миниантитела представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобулина, который обладает достаточно хорошей антигенсвязывающей активностью.

г) конъюгированные антитела. К моноклональным антителам присоединяют лекарственные соединения (цитостатики, токсины и др.) или диагностические метки (радиоактивные частицы, флуоресцирующие вещества), соответственно с целью адресной доставки к клеткам-мишеням либо детекции последних. Моноклональные антитела, конъюгиро­ ванные с токсинами называются иммунотоксинами. Моноклональные антитела можно получать также в ткани трансгенных растений либо синтетическим путем. Трансгенные растения (чаще всего табак) используют в научно-исследовательских лабораториях для получения, как съедобных вакцин, так и моноклональных антител против ново­ образований (опухоли кишечника, легких и др.) и инфекций (против герпеса, бешенства, стрептококковой инфекции и др.). Абзимы (антитела-ферменты, AntiBody enzyme) – это синтетические, каталитические антитела, способные осуществлять катализ реакций подобно ферментам. Например получены абзимы, специфически распознающие и расщепляющие кокаин, антиген ВИЧ gp41 и др.

Технологии гипериммунизации и гибридомы позволяют получать полноразмерные, двухцепочечные антитела (соответственно поли- и моноклональные). Технологии рекомбинантной ДНК позволяют получать одноцепочечные (химерные, гуманизирован­ ные, конъюгированные) антитела.

Гибридомная технология. Основные этапы гибридомной технологии: — иммунизация линейных мышей либо других лабораторных животных, соответствующими антигенами (к примеру, HBs-Ag или поверхностный белок СД4 вируса СПИД). Используются кратко- и долговременные схемы повторной иммунизации с подкожным, внутрибрюшинным либо внутривенным введением антигена; - выделение селезеночных лимфоцитов (способны к синтезу антител одной специфичности) у иммунизированных животных; - подготовка мышиных миеломных лимфоидных клеток (клетки миеломы - это малигнизированные В- лимфоциты, способные к неограниченному росту и размножению); - слияние (гибридизация) миеломных и селезеночных клеток в присутствии соединений, усиливающих процесс слияния клеточных мембран (к примеру, ПАГ); - выращивание

гибридных клонов; гибридомыпродуценты моноклональных антител от клеток селезенки унаследовали способность к продукции антител, а от миеломных клеток способность к неограниченному росту; - отбор, клонирование гибридом, синтезирующих антитела необходимой специфичности (определение в серологических реакциях); - накопление гибридомных клеток in vivo в асцитической жидкости или in vitro в культуре клеток; - выделение, концентрирование и очистка (осаждение солями, аффинная хроматография, гёль-фильтрация) моноклональных антител; - анализ авидности и аффинности антител, определение их титра.

Моноклональные антитела идентичны по классу и типу иммуноглобулинов, по специфичности, авидности и аффинности. Однако гибридомная технология, основанная на получении моноклональных антител из мышиных лимфоцитов имеет определенные ограничения для применения в медицинской практике. Эти антитела характеризуются антигенной чужеродиостью для человеческого организма и при их использовании с терапевти­ ческой целью имеет место реакция иммунного отторжения, они неспособны в полной мере выполнять эффекторные функций в организме человека. Кроме того, гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой клеточной плотности и требуют сложных и дорогих питательных сред.

5.2. Технологии получения антител

Технологии рекомбинантной ДНК. Получение рекомбинантных антител предполагает, во-первых, их разнообразие по специфичности взаимодействия с антигенами, соизмеримое с количеством различных клонов В-лимфоцитов в организме и, во-вторых, их промышленную продукцию, используя в качестве продуцента модифицированные микроорганизмы или эукариотные клетки. Для получения рекомбинантных антител с разной специфичностью, с различными гипервариабельными участками в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одно­ цепочечных (scFv) антител и Fvфрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli; это метод фагового дисплея. Для этого, используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией). Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. кДНК, кодирующие, сответственно Н- и L-цепи Fv-фрагмента встраивают в вектор, в геном бактериофага. Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отбираются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный связываться со специфическим антигеном. Впервые возможность экспрессии одноцепочечных последова­ тельностей, составленных из вариабельных доменов антител в составе гибридного белка оболочки нитевидного фага, была про­ демонстрирована еще в 1990-х годах. Рекомбинантные антитела экспонируются на поверхности репродуцировавшихся модифицированных нитевидных бактериофагов (каждый фаг несет один вариант антител). Далее эти антитела, гены которых закодированы в ДНК бактериофага-вектора, отбираются in vitro по способности взаимодействовать с антигеном. Таким образом создание рекомбинантных антител нужной специфичности начинается с получения библиотеки клонов ДНК, встроенных в соответствующее число бактериофагов. Затем про­ водится биопаннинг (biopanning) - селекция бактериофагов, обладающих большей аффинностью к иммобилизованным лигандам (специфическим антигенам).