4 курс / Общая токсикология (доп.) / Судебно_медицинская_экспертиза_отравлений_антихолинэстеразными_веществами

Время полураспада составляло при этом обычно около 2 часов. Если не вносить ткани в раствор ацетилхолина, то время полураспада составляет больше 40 часов (табл.28).

Следовательно, мы наблюдали действительно фермен­ тативный, а не спонтанный гидролиз ацетилхолина.

Важно было выяснить, в какой мере этот гидролиз осуществляется в самом кусочке ткани (или на его по­ верхности) и в какой мере гидролиз идет за счет холинэстеразы, переходящей из кусочков ткани в раствор, так как действенная концентрация ингибитора может сохра­ ниться, конечно, только в кусочке ткани, а в растворе ин­ гибитор разводится в десятки раз. Чтобы выяснить это,

мы применили прием, ранее использованный А. Г. Гинецинским и 3. И. Барбашовой (1949). Мышцу помещали на 2 часа в стаканчик с 9 мл раствора Рингера при по­ стоянной аэрации. Затем мышцу вынимали, а к раствору добавляли 1 мл ацетилхолина 1 • 10~4. Ход гидролиза ацетилхолина в этих условиях иллюстрирован в табл. 29. QChE составлял в среднем 0,025 вместо 0,132 в присут­ ствии мышцы. Следовательно, за счет холинэстеразы, пе­ решедшей из ткани в раствор, осуществляется не бо­

лее чем 22% гидролиза аце­ тилхолина.

В другой серии опытов мы определяли ход гидроли­ за ацетилхолина такими же мышцами и нервами после их предварительного расти­ рания до полной гомогенно­ сти (результаты приведены в табл. 30). С растертыми тка­ нями контрольных лягушек мы наблюдали гораздо бо­ лее быстрый гидролиз, чем с интактными кусочками.

QChE составляли соответст­ венно для мышц 3,616±0,565 (вместо 0,132±0,033), а для

102

±0,445 для нервов. Таким образом, в этих опытах под­ твердилась невозможность выявить торможение холинэстераз in vivo обратимыми ингибиторами типа наркоти­ ков методом растирания тканей. Абсолютные значения QChE, получаемые при растирании тканей, близки к при­ водимым в литературе (Nachmansohn, 1959).

В то же время при работе с интактными кусочками ткани в наших опытах отмечалось значительное тормо­ жение холинэстераз в тканях наркотизированных жи­ вотных.

Описанный метод работы с «кусочком неразведенной ткани» для выявления торможения холинэстераз был проведен применительно к другим ингибиторам обрати­ мого типа (прозерин, морфин и др.).

Полученные результаты свидетельствуют, что для об­ ратимых ингибиторов холинэстеразы этот метод может быть использован для специальных исследований.

Отравление хинином. В 1940 г. А. П. Николаев вы­ двинул предположение, что хинин усиливает сократитель­ ную деятельность матки потому, что он обладает антихолинэстеразным действием и стабилизирует ацетилхолин в организме.

Антихолинэстеразное действие хинина изучалось мно­ гими авторами, но полученные результаты были весьма противоречивы. В связи с этим мы решили исследовать активность холинэстеразы при отравлении хинином (Я- С. Смусин, 1961). Это представлялось нам тем более интересным, что хинин имеет и судебно-медицинское зна­ чение, поскольку встречаются смертельные случаи от передозировки хинина, применяемого с целью плодоизг­ нания.

Кроме обычно применяемого в медицинской прак­ тике хлоргидрата хинина, мы исследовали также альфайодметилат хинина, синтезированный Г. Т. Татевосяном в 1956 г.

Были установлены средние смертельные дозы, вызы­ вавшие смерть в течение первых суток при подкожном введении у 50% мышей (ДЛбо)- Эти дозы оказались рав­ ными для хлоргидрата хинина 0,4 г/кг, а для его альфайодметилата —0,14 г/кг.

Таким образом, при метилировании хинина токсич­ ность его сильно возросла. Соотношение ДЛБО В весовых единицах составляет для хлоргидрата и йодметилата хи­ нина соответственно 400 мг/кг и 140 мг/кг. В перерасчете на моли это составит 1,1 миллимоля на 1 кг и 0,3 миллимоля на 1 кг. Следовательно, токсичность хинина возрос­ ла при его альфа-метилировании в 3,7 раза. Увеличение токсичности многих фармакологических средств при их метилировании известно давно.

164

Нами были проведены опыты по определению актив­ ности истинной и ложной холинэстераз. Степень активно­ сти холинэстераз сравнивалась при действии равноэффективных доз обоих веществ (ДЛ50 и 2ДЛ5о). Действие хинина и его йодметилата на активность холинэстеразы in vitro изучалось биологическим методом Платтнера.

Наиболее удобно будет изложить методику на основа­ нии краткого описания типичного опыта.

Плян опыта:

Первая проба является контрольной: ацетилхолин в ней не разру­ шился, так как до его прибавления холинэстераза была денатурирована добавлением трихлоруксусной кислоты. Пробы 2 и 3 готовятся так же, как и контрольная проба, однако трихлоруксусная кислота добавля­ ется после истечения запланированного времени контакта ацетилхолина с холинэстеразой (в нашем случае 60 секунд). Аналогичным образом готовятся пробы 4 и 5, но в отличие от проб 2 и 3, кроме хо­ линэстеразы и ацетилхолина, в растворе во время контакта присутст­ вует еще ингибитор — хинин. Соответственно мы уменьшали коли­ чество дистиллированной воды с тем, чтобы объем жидкости во всех пробах был одинаковым.

В разбираемом случае оказалось, что в контрольной пробе (про­ ба 1) уменьшение концентрации ацетилхолина вдвое ведет к соответ­ ствующему снижению высоты сокращения мышцы (с 80 до 46 мм).

Теперь переходим к оценке полученных результатов методом гра­ фической интерполяции. В пробах 2 и 3 мышца сократилась в сред­ нем до 46 мм, а в пробах 4 и 5 — до 63 мм. Это соответствует разру­ шению ацетилхолина на 50 и 25%. После этого мы определяем Т5о холинэстеразы, т. е. время, необходимое для того, чтобы исходная концентрация ацетилхолина в результате ферментативного гидролиза снизилась вдвое. В данном случае Т50 составляет 120 секунд. Таким

165

образом, холинэстераза оказалась угнетенной на 50% (время полу­ распада ацетилхолина после добавления хинина оказалось вдвое больше). Исходная концентрация хинина, вызвавшая такое угнете­ ние, была равна 4-Ю- >но в момент экспозиции (вследствие добавле­ ния других компонентов смеси) эта концентрация была в 4 раза ни­ же, т. е. составляла 1 • Ю - 5 . Следовательно, хинин в концентрации 1 • 10 угнетает холинэстеразу сыворотки лошади на 50%.

Однако в очень редких случаях удается сразу устано­ вить концентрацию вещества, угнетающую холинэстера­ зу на 50%. Как правило, при работе мы сталкивались с серией концентраций, угнетающих холинэстеразу, на­ пример, на 20%, 40%, 50% и т. д. Для того чтобы точно подобрать концентрацию вещества, угнетающую холин­ эстеразу именно на 50%, можно опять-таки воспользо­ ваться графической интерполяцией, с помощью которой удается в первом приближении установить, какая кон­ центрация исследуемого вещества угнетает холинэстеразу вдвое. Графическая интерполяция проводится в прямо­ угольной системе координат. По оси ординат отклады­ ваем проценты угнетения холинэстеразы, по оси абс­ цисс— концентрацию ингибитора. Могут быть отложены как абсолютные значения концентрации, приведенные к одной степени разведения (например, от 0,1 до 16 • Ю- 8 ), так и характеристики отрицательных логарифмов этих величин.

Соединяем прямой линией две точки, характеризую­ щие угнетение холинэстеразы ингибитором на величину, большую и меньшую 50%. Эта линия, естественно, пере­ сечет горизонталь, соответствующую половинному угне­ тению холинэстеразы. Опустив из точки пересечения пер­ пендикуляр, получаем на оси абсцисс цифровое значение искомой концентрации или характеристику его отрица­ тельного логарифма (рис. 37,а).

На рис. 37 приведено вычисление концентрации ин­ гибитора, угнетающей холинэстеразу на 50%. По гори­ зонтали — концентрация ингибитора в абсолютных зна­ чениях, приведенных к общему знаменателю (все кон­ центрации даны применительно к концентрации 1 • Ю - 8 ) . Допустим, что вещество в концентрации 10 • 10~8 (1 • Ю- 7 ) угнетает холинэстеразу на 80%, а концентрация 5- Ю- 8 — на 40%'. Находим соответствующие точки на графике и соединяем их между собой. Опустив перпендикуляр на ось абсцисс из точки пересечения проведенной нами лй-

1G6

нии с горизонталью, соответствующей 50% угнетению эн­ зима, получаем, что исследуемое вещество будет тормо­ зить холинэстеразу на 50% в концентрации 6,4 • 10~8 (рис. 37,6).

Когда мы берем две точки, характеризующие угне­ тение холинэстеразы меньше или больше, чем на 50%,

то в идеальных условиях соединяющая их линия не мо­ жет быть прямой. Особенно это вырисовывается, если бе­ рут точки, далеко отстоящие друг от друга (например, угнетение холинэстеразы на 20 и 80%). Получаемые экс­ периментальным путем промежуточные точки приводят к заключению, что в таких условиях линия, проведенная

167