5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / ХРОНИЧЕСКАЯ_ОБСТРУКТИВНАЯ_БОЛЕЗНЬ_ЛЕГКИХ_2

астмой [177]. Было доказано, что источником окиси азота у этих больных являются нижние отделы респираторного тракта [177].

Внаше время, актуальность и острота изучения роли свободнорадикального окисления в развитии патологических процессов не только не снизилась, но и многократно возросла.

Вовлеченность активных форм кислорода и органических свободных радикалов в патогенез распространенных мультифакториальных заболеваний в настоящее время установлена более чем для 100 патологических состояний, затрагивающих практически все системы организма. К заболеваниям, характеризующимся усилением свободнорадикальных процессов, относятся: гипертоническая болезнь, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, язвенная болезнь, гастрит, сахарный диабет, бронхо-легочные заболевания и злокачественные новообразования [3, 94, 162, 218].

Впоследние годы активно изучается концепция «оксидативного стресса», которая играет ключевую роль в развитии воспалительного процесса при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [79, 176, 178].

1.2.Оксидативный стресс: система оксидантов

Функционирование живых систем в условиях физиологического оптимума характеризуется прооксидантным и антиоксидантным равновесием – важнейшим механизмом поддержания окислительного гомеостаза. Нарушение равновесия в системе «оксидант – антиоксидант» за счет преобладания оксидантов или недостаточности и снижения активности антиоксидантов, называют оксидативным стрессом.

Вроли прооксидантных факторов, относительный или абсолютный избыток которых приводит к оксидативному стрессу, выступают экзогенные и эндогенные оксиданты (рис.1).

Основными экзогенными оксидантами и их источниками являются: кислород; излучения: радиоактивное, лазерное и ультрафиолетовое;

оксиданты загрязненного воздуха (озон, диоксиды азота и серы и т.п.);

оксиданты, образующиеся при курении; ксенобиотики, пестициды; микроорганизмы, выделяющие оксиданты.

Вгруппу эндогенных оксидантов включены:

свободные радикалы [25, 80], в том числе активные формы кислорода и активные формы азота (рис.2);

продукты перекисного окисления липидов [17, 43];

общая оксидативная активность плазмы [9].

10

Кислород (гипероксия); радиоактивное, лазерное и УФ излучения;

оксиданты загрязненного воздуха; оксиданты, образующиеся при курении; ксенобиотики, пестициды;

микроорганизмы, выделяющие оксиданты и т.п.

Митохондрии, фагоциты, оксидазы, гемопротеин, пероксисомы, Р450

Рис.1. Классификация оксидантов

Свободные радикалы

Основную роль в развитии оксидативного стресса играют свободные радикалы.

Свободные радикалы (СР) – это молекулы, имеющие, по крайней мере, один непарный электрон, определяющий высокую химическую реакционную способность этих соединений.

В зависимости от концентрации СР оказывают прямо противоположные биологические эффекты: при нормальной концентрации

–регуляторный, при избыточной концентрации – токсический [124].

B. Halliwell [153] для обозначения свободных радикалов предлагает термины – активные формы кислорода, липидов, азота и хлора (рис.2).

Так, к активным формам кислорода относятся супероксид, радикал гидроксила, перекись водорода и синглетный кислород. Окись азота и результат ее взаимодействия с супероксидом – пероксинитрит предлагается называть активными формами азота. Активной формой хлора можно назвать гипохлорит, образуемый в реакции перекиси водорода с

11

ионом хлорида, которую катализирует фермент миелопероксидаза. Радикалами липидов следует считать алкил, алкоксил, диоксил [153].

третичные [8]. Первичные и вторичные радикалы являются в основном продуктами модификации молекулярного кислорода. Молекулярный кислород обычно не вступает в прямые неферментативные химические реакции с органическими соединениями тканей организма. Реакции с участием кислорода в живой клетке чаще всего происходят с помощью ферментов – оксидаз. В ходе этих реакций могут образовываться промежуточные свободнорадикальные продукты восстановления кислорода, которые получили название – активные формы кислорода:

О2˙ˉ – супероксид анион радикал кислорода,  1О2 – синглетный кислород, Н2О2 – перекись водорода, ОН• – гидроксильный радикал.

В норме более 90% кислорода, которым мы дышим, используется в качестве энергетического источника в клетке в окислительных реакциях, катализируемых цитохромоксидазой митохондрий, с высвобождением энергии и образованием воды. Это основной путь получения энергии для аэробных организмов.

12

АТРЕТИЧНЫЕ

Восстановление кислорода в дыхательной цепи митохондрий – относительно безопасный путь. Однако, электронпереносящая каталаза в окислительно-восстановительных реакциях может реагировать с кислородом с образованием активных форм кислорода (АФК), таких как супероксид анион (О2˙ˉ), который является основным первичным радикалом кислорода [10]. Митохондрии являются главным внутриклеточным источником О2˙ˉ в физиологических условиях [152]. Другим возможным источником О2˙ˉ является система NADPH-оксидаз, находящихся в нейтрофилах, моноцитах, макрофагах, эозинофилах [10, 152], которая запускается при активации этих клеток, в частности при бронхиальной астме.

Супероксид анион относительно нестабилен и период его полужизни составляет несколько миллисекунд [183]. Большая часть О2˙ˉ подвергается неферментативной деактивации или реакции, катализируемой супероксиддисмутазой, с образованием перекиси водорода (Н2О2) [10], которая окисляется в дальнейшем под действием миелопероксидазы (МПО) нейтрофилов и моноцитов или под действием эозинофильной пероксидазы (ЭПО) до гипогалогенидных кислот и других реактивных галогенных форм [181] или разлагается нерадикальным путем под действием двух других защитных антиоксидантных ферментов – каталазы

13

и глутатионпероксидазы [10]. Нужно отметить, что МПО и ЭПО способствуют также формированию активных форм азота, используя перекись водорода и нитрит в качестве косубстратов. Кроме того, эозинофилы обладают более высокой способностью к генерации супероксид аниона и перекиси водорода, чем нейтрофилы, что способствует более длительному и существенному повреждению, вызываемого ими [183].

Источником свободных радикалов кислорода могут быть следующие реакции:

1)реакции, катализируемые цитохромом Р-450 в микросомальных фракциях клеток [2, 64];

2)неферментативные реакции – аутоокисление гидрохинонов, лейкофлавинов, катехоламинов, тиолов. В инициации свободнорадикального окисления могут участвовать катион–радикалы молибдена, марганца, кобальта, железосерные кластеры [41].

Первичные радикалы

Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Выделяют три группы первичных радикалов (табл.1): активные формы кислорода, активные формы азота, семихиноны.

В норме первичные радикалы участвуют во многих жизненно важных процессах в организме, в том числе биоэнергетических процессах, поддержании гомеостаза [69], в антимикробной защите организма, реализации иммунных и воспалительных реакций [103].

Среди физиологических эффектов первичных радикалов выделяют индукцию транскрипции некоторых генов, в том числе онкогенов и генов раннего ответа [95, 179].

14

Первичные радикалы участвуют в регуляции клеточной пролиферации и тонуса сосудов, активации фактора транскрипции NF-kB (Nucleus factor kappa B), активирующий белок 1 (AP-1) [109, 244] и

вызывающий экспрессию генов, кодирующих некоторые цитокины и вирусы [15].

Обнаружены также регуляторные функции АФК [103, 185], которые не только стимулируют накопление в клетках вторых посредников – циклонуклеозидов (цАМФ – циклический аминозинмонофосфат и цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат), а также синтез простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и арахидоновой кислоты, высвобождающейся из мембранных фосфолипидов в процессе ПОЛ [15], но и напрямую могут выполнять функцию посредников гормонов. В пользу последнего свидетельствует накопление АФК при воздействии факторов роста клеток, цитокинов, инсулина, паратирина, витамина Д. АФК вызывают накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации протеинкиназ и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз. Кроме того, АФК активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядра клеток.

Первичные радикалы выполняют и сигнальную функцию [79, 104]. Современная концепция об их физиологической роли рассматривает процесс образования О2 и Н2О2 как естественный процесс в различных клетках, необходимый для формирования биологической сигнальной системы. Этот процесс представлен как сигнальная система редокс (redox signaling).

АФК в низких концентрациях участвуют в модуляции глюкокортикоидзависимого сигнала трансдукции, в стимуляции фосфолипазы и в биосинтезе эйкозаноидов, в индукции факторов роста, цитокинов и в изменении клеточного транспорта [184]. Активные формы азота (АФА), в частности окись азота также являются важными регуляторами клеточных функций, включающих контроль за сосудистым тонусом (регуляция тонуса и структуры сосудов, антитромботическое действие), мышечным сокращением, нейротрансмиссией, биоэнергетическим контролем, а также оказывает бронхорасширяющее действие [178]. Активные формы (АФК и АФА) участвуют в биоэнергетических процессах, поддержании гомеостаза, окислении и детоксикации экзогенных и эндогенных соединений, обладают микробоцидными свойствами, влияют на иммунитет, регулируют процессы клеточного размножения, апоптоза. ПОЛ играет важную роль в регуляции проницаемости клеточных мембран, их естественной репарации, пролиферации клеток, в биосинтезе простагландинов, в процессах фагоцитоза, в метаболизме ксенобиотиков [8].

Cупероксид (·OO-, О2˙ˉ) образуется в результате переноса электрона от NADPH-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембраны

15

фагоцитирующих клеток (гранулоциты, моноциты крови и тканевые клетки – макрофаги), на растворенный молекулярный кислород. Супероксид оказывает повреждающее действие на микроорганизмы, вызывающие активацию макрофагов. Из супероксида в организме образуются другие активные молекулярные соединения: гипохлорит, принимающий участие в процессах разрушения оболочек бактериальных клеток, и гидроперекиси липидов.

Однако избыточное количество О2˙ˉ может нанести вред самим фагоцитам и другим клеткам крови. Серьезные повреждения, вызываемые супероксидом кислорода при недостаточности антиоксидантной защиты in vivo, обусловлены, во-первых, образованием ОН• [140] и активных вторичных форм липидов [10], в реакциях катализируемых двухвалентным железом [10], которые вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот, инактивацию ферментов [145], запуск цепной реакции перекисного окисления липидов [10]. Кроме того, О2˙ˉ, связываясь с окисью азота, образует мощный оксидант и нитратный радикал – пероксинитрит [10, 166], который также вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, повреждает сосудистый эндотелий, увеличивает агрегацию тромбоцитов, участвует в процессах эндотоксемии, острого легочного повреждения при респираторном дистресс синдроме взрослых [88].

Другой первичный радикал, синтезируемый живыми клетками – это нитроксид (NO·) (табл.1), часто называемый просто окисью азота [198, 202]. Нитроксид – один из важнейших биологических медиаторов в организме животных и человека, участвующий во многих физиологических и патофизиологических процессах большинства систем организма: сердечно-сосудистой (регуляция тонуса и структуры сосудов, антитромботическое действие), дыхательной (бронхорасширяющее действие), нервной (участие в регуляции гладких мышц сосудов, бронхов, пищеварительной и мочеполовой систем; возможный медиатор функции памяти и болевой рецепции), иммунной (регуляция воспаления и иммунной защиты) [226].

Нитроксид образуется из аминокислоты L-аргинина при воздействии различных изоформ NO-синтаз (NOS) (рис.4). NO-синтазы – гемопротеины, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием кислорода и ряда кофакторов (NADPH, тетрагидробиоптерин) [81]. В настоящее время идентифицировано 3 изоформы NO-синтаз [132, 158, 198]. Функционально выделяют конститутивные (cNOS) и индуцибельные NO-cинтазы. Изоформы NO-синтаз отличаются друг от друга кодирующим геном, распределением в клетках, способом регуляции, скоростью ответа на стимул [226].

Конститутивных изоформ NOS две: эндотелиальная NOS (eNOS или тип 3) и нейрональная NOS (nNOS или тип 1), которые представлены в различных клеточных линиях [130, 132, 247]. Они кальцийзависимые и

16

кальмодуллинзависимые, и способствуют выделению небольшого количества NO· на короткий период в ответ на рецепторную и физическую стимуляцию одним из медиаторов (ацетилхолин, брадикинин, гистамин). NO·, образующийся под влиянием cNOS, действует как переносчик в ряде физиологических ответов.

Экспрессия третьей изоформы (индуцибельная кальцийнезависимая NOS (iNOS, тип 2) не происходит постоянно, а индуцируется в различных типах клеток (макрофаги, гладкомышечные клетки, кардиомиоциты, клетки макроглии) в ответ на воспалительные стимулы, включая АФК [87, 198] и способствует выделению большого количества NO·, что требуется для киллинга бактерий, вирусов и других патогенов [142]. Токсическое действие образовавшегося оксида азота на микроорганизмы и опухолевые клетки возможна, так как молекула NO·, имея свободный электрон на внешней орбите, является высокоактивной и обладает радикальной способностью.

Рис.4. Схема преобразования аргинина в нитроксид

В респираторном тракте представлены все три типа NOS [159, 194, 199, 226]. eNOS локализована в эндотелии сосудов бронхов, эпителиальных клетках, nNOS обнаружена в холинэргических и нехолинэргических / неадренэргических нервах бронхов, а также в эпителиальных клетках. iNOS может экспрессироваться в нескольких типах клеток в ответ на цитокины, эндотоксин, оксиданты. При бронхиальной астме iNOS локализована преимущественно в эпителиальных клетках, макрофагах и эозинофилах [113, 199].

Окись азота продуцируют сNOS эндотелия легочных сосудов, нейронов неадренергической нехолинергической ингибирующей нервной системы, эпителиальных клеток [87], а также iNOS эпителия дыхательных путей, воспалительных и иммунокомпетентных клеток (макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток), эндотелия, миоцитов [87]. Последние

17

экспрессируются лишь в условиях патологии под влиянием таких биологически активных веществ и гормонов, как адреналин, норадреналин, ацетилхолин, гистамин, АДФ, брадикинин, эндотелин и др. [54].

Нитроксид подавляет активацию NF-kB, увеличивая продукцию ингибитора фактора транскрипции IkB и стабилизируя его [5, 73].

Было доказано, что источником нитроксида при заболеваниях легких являются нижние отделы респираторного тракта. При IgE воздействии продуцируются NOS 2 и 3 типов.

Нитроксид выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с супероксид-радикалами участвует в уничтожении микроорганизмов (преимущественно грибковой природы).

Вопрос об активаторах синтеза NO· при бронхиальной астме в течение долгого времени оставался открытым. Основными кандидатамииндукторами считались комбинации двух и более провоспалительных цитокинов (INFγ, TNF-α и IL-1β), низкоафинный Fcε II рецептор СD23 [223] и бактериальный эндотоксин [161]. IL-4 может быть как индуктором, так и ингибитором синтеза оксида азота моноцита [58, 171]. Выполнив свои физиологические функции, NO· подвергается метаболизму одним из трех основных способов [126].

Основной путь метаболизма NO· – реакция, с гемопротеинами. Вопервых, многообразные клеточные эффекты NO· (расслабление гладких миоцитов и т.д.) запускаются при связывании его с гемсодержащим ферментом гуанилатциклазой. Во-вторых, NO· быстро реагирует с гемоглобином эритроцитов, образуя метгемоглобин и нитрит анион (NO2-), который быстро окисляется до нитрата (NОз-). NO2- в свою очередь является субстратом для гемопероксидаз, что может привести к формированию нитратного радикала (NO2˙) или родственных молекул. Образование NО2- из NO· в физиологических условиях не происходит

[126].

Второй путь метаболизма – образование S-нитрозотиолов в быстрой обратимой реакции NO·+ RSH —> RSNO, которые транспортируют NO· радикалы и связывают их со специфическими белковыми эффекторами, по сути, являясь единственным механизмом азотистого стресса [214]. Интересно, что S-нитрозотиолы могут ингибировать ферменты, связанные с ответом на оксидативный стресс в эукариотных клетках, такие как глутатионпероксидазу, глутатионредуктазу, глутатион-S-трансферазу. Возможно, S-нитрозотиолы, присутствующие в плазме человека – стабилизированная форма окиси азота в биологических тканях [126].

При избыточной продукции NO· запускается третий путь метаболизма, объясняющий цитотоксичность оксида азота, – реакция со свободными радикалами – один из главных путей образования АФА. В настоящее время, одной из наиболее изученных таких реакций, как уже рассматривалось выше, является реакция с О2˙ˉ с формированием

18

цитотоксичного пероксинитрита (ООNО-) [10], который в дальнейших реакциях приводит к образованию ОН• [140]. Оба этих вещества – высокоактивные оксиданты [126], вызывающие повреждение тканей воспалительного характера [163].

Третим первичным радикалом является радикал коэнзима Q (семиубихинон) (табл.1). На конечном этапе окисления субстратов в клетках электроны переносятся от NADP и NADPH по так называемой дыхательной цепи на кислород. В состав дыхательной цепи митохондрий входят флавопротеиды, комплексы негемового железа, убихинон и гемопротеиды (цитохромы a, b и c и цитохромоксидаза). Важным звеном цепи переноса электронов служит убихинол (коэнзим Q), радикал которого (семиубихинон, HQ·) образуется либо при одноэлектронном окислении убихинола, либо при одноэлектронном восстановлении убихинона. В норме этот радикал не более чем рядовой участник процесса переноса электронов, но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других радикалов кислорода [8].

Вторичные радикалы

Гидроксильный радикал (ОН•) и липидные радикалы (табл.2), образуются из первичных форм СР через их взаимодействие с избыточным

супероксидом и образованием двухвалентного из трехвалентного железа

(Fe3+Fe2+).

Таблица 2

Именно эта категория АФК обладает значительно большей активностью и выраженным токсическим действием на липиды клеточных мембран, молекулы ДНК, углеводы и белки.

Вторичные радикалы, в отличие от первичных, образуются в неферментативных реакциях и, насколько известно в настоящее время, не выполняют физиологически полезных функций. Напротив, они обладают разрушительным действием на клеточные структуры. Именно образование

19