5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Чучалин_А_Г_Респираторная_медицина_т_1_2017

3.Электронные и проблемно-ориентированные истории болезни систематизируют ведение медицинской документации.

4.Одышка, кашель, кровохарканье и боль в грудной клетке являются основными жалобами пациентов с патологией бронхолегочной системы.

5.На основании опроса и физикального обследования в 88% случаев возможно сделать диагностическое заключение.

6.Стридор является наиболее грозным признаком и требует неотложной помощи.

7.Появление у больного de novo признака «барабанных палочек» служит основанием для тщательного обследования пациента в целях исключения рака легкого.

8.Внелегочные «маски» респираторной патологии следует учитывать в дифференциальной диагностике.

Список литературы

См.

5.2. Микробиологическая диагностика при легочных заболеваниях

М.Ю. Чернуха, И.А. Шагинян

Введение

Микроорганизмы, инфицирующие нижние дыхательные пути пациентов с легочными заболеваниями, определяют лечение, качество жизни, а для больных МВ перспективы для трансплантации и общую выживаемость. Точная и своевременная идентификация возбудителей инфекций дыхательных путей имеет значение для обеспечения своевременного начала лечения соответствующими антибиотиками в целях элиминации бактериальных патогенов и организации надлежащего инфекционного контроля для профилактики распространения патогенных микроорганизмов среди больных. Очень часто правильная микробиологическая диагностика представляет трудности, так как микробная флора дыхательных путей представлена часто ассоциациями, а некоторые микроорганизмы проявляют атипичные для своего вида фенотипические свойства, например ауксотрофные P. aeruginosa и SCV (small colony variants —

фенотип мелких колоний) S. aureus.

Эволюция представлений о разнообразии этиологической структуры инфекций нижних дыхательных путей происходит параллельно с совершенствованием методов выявления микробных возбудителей и их маркеров, появлением новых технологий, основанных на молекулярно-биоло- гических подходах к этиологической диагностике

бронхолегочных инфекций. В настоящее время описано более 100 микроорганизмов, способных вызывать инфекции нижних дыхательных путей, почти все они были хотя бы однократно обнаружены при биопсии легочной ткани и в мокроте (табл. 5.12, 5.13) [1].

Сложность проведения микробиологической диагностики легочных заболеваний связана со следующими особенностями.

•Широкое разнообразие инфекционных агентов, относящихся к разным классам микроорганизмов, что определяет широкий перечень биологических материалов и методов их исследования.

•Секрет, получаемый из нижних отделов дыхательного тракта, контаминируется микрофлорой верхних дыхательных путей и ротовой полости, представленной аэробными, анаэробными бактериями и грибами в концентрациях 1010–1012 КОЕ/мл.

•Грамотрицательная флора (Enterobacteriaceae,

Pseudomonas, Acinetobacter) в ротоглотке встречается в незначительном объеме. Однако у пациентов, ранее получавших антибиотики или страдающих хроническими заболеваниями — сахарным диабетом, острой лейкемией, хроническим алкоголизмом, концентрация возбудителей грамотрицательной флоры достигает 107 КОЕ/мл. Такая концентрация возбудителей создает предпосылки для развития инфекций нижних дыхательных путей, так как даже незначительная аспирация секрета ротоглотки (в объеме от 0,1 до 1 мл) приводит к попаданию 104 КОЕ/мл в трахеобронхиальное дерево.

•Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae или Staphylococcus aureus, колонизирующие мокроту, осложняют диагностику пневмококковой пневмонии, плевропневмонии анаэробной этиологии и туберкулеза легких.

•Особое место занимают хронические инфекции легких.

•Предшествующая антибактериальная терапия искажает первичную этиологическую природу инфекционного процесса [1].

•Хроническую инфекцию легких при МВ можно рассматривать как модель инфекции, развивающейся при ХОБЛ. Особенностью ее является хроническая смешанная инфекция легких, вызванная доминирующими возбудителями

S. aureus, P. aeruginosa, Burkholderia cepacia complex, Achromobacter spp., другими неферментирующими микроорганизмами (НФМО),

а также нетуберкулезными микобактериями и грибами.

При изучении микрофлоры нижних дыхательных путей различных возрастных групп детей, больных МВ, исследователями различных стран установлено, что доминирующими возбудителями инфекции легких у больных МВ являются

Р. aeruginosa и S. aureus, H. influenzae, бактерии

комплекса B. cepacia (Всс). Показано, что в первые годы жизни у больных МВ доминирует золотистый стафилококк, а затем основным возбудителем становится синегнойная палочка [2]. Грибы

Aspergillus fumigatus и грибы рода Candida выделяют у больных МВ в более взрослом возрасте, особенно подвергавшихся многократному лечению антибиотиками. В последнее время одной из главных причин, приводящих к летальному исходу, является инфекция, вызванная бактериями B. сepacia complex. Этот возбудитель способен вызывать так называемый «цепация-синдром» — некротизиру-

ющую пневмонию с септицемией, нередко приводящую к летальному исходу. Инфицирование больных МВ бактериями комплекса B. cepacia представляет особую опасность, так как данный микроорганизм обладает природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретает резистентность к широкому спектру антимикробных препаратов. Такие свойства затрудняют эрадикацию бактерий комплекса В. cepacia в процессе лечения, способствуют длительной персистенции возбудителя, приводя к быстрому переходу острой инфекции нижних дыхательных путей в хроническую

форму и значительным нарушениям функций легких. Больные, инфицированные B. cepacia complex, являются источником инфекции и представляют опасность для других пациентов [3]. Кроме того, колонизация нижних дыхательных путей бактериями B. cepacia complex до последнего времени была противопоказанием для пересадки легких, считающейся важной частью программы по увеличению продолжительности жизни у больных МВ. Данные последних публикаций и собственные исследования подтверждают значимость в развитии хронической инфекции других видов НФМО, среди которых особое значение в связи с большей частотой выделения по сравнению с другими микроорганизмами и фенотипическому сходству с бактериями B. cepacia complex приобретает Achromobacter spp. [4].

Пациентам с внебольничными пневмониями

иХОБЛ, лечение которых проводят в амбулаторных условиях, кроме рутинных микробиологических исследований, позволяющих выделить чистую культуру возбудителя, необходимо для подтверждения диагноза использовать и другие методы исследования, среди которых биохимические методы, MALDI-TOF масс-спектрометрия, молекулярно-биологические методы, специфическая диагностика с использованием ПЦР, мультилокусное секвенирование, полное геномное секвенирование [4–6]. Независимо от стартовой эмпирической антимикробной терапии и в первую очередь при хронической инфекции легких показано бактериологическое исследование мокроты с определением чувствительности к антибиотикам. Серодиагностика может понадобиться в период эпидемий (например, легионеллеза, микоплазменной инфекции) или по особым клиническим

иэпидемиологическим причинам, например, для уточнения идентификации.

Набор исследований, проводимый госпитализированным пациентам, определяется тяжестью заболевания, наличием эпидемиологических факторов риска, неэффективностью проводимой эмпирической терапии.

Биологические материалы для микробиологического исследования

Исследуют мокроту, промывные воды бронхов, транстрахеальный аспират, бронхиальный смыв и БАС, браш-биоптаты, плевральный экссудат, пунктат инфильтрата или абсцесса легкого, биоптат легочной ткани, кровь на гемокультуру, сыворотку крови для определения специфических АТ, мочу для определения легионеллезного и пневмококкового антигенов, мазки из носа, зева и смывы из ротоглотки при диагностике вирусных инфекций. Результативность исследования возрастает при изучении бронхиального смыва и БАС, полученных

инвазивными методами. Мокрота — наиболее доступный для анализа материал и по надежности результатов при организации мониторинга микрофлоры нижних дыхательных путей (НДП) не уступает инвазивным методам, хотя отмечается контаминация микрофлорой верхних дыхательных путей и ротоглотки.

Мокрота. Для исследования у больных собирают утреннюю порцию мокроты натощак в объеме 3–5 мл в стерильные флаконы с плотно завинчивающейся крышкой. Желательно предварительно почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой или раствором натрия гидрокарбоната (1 чайная ложка на стакан воды). Если пациент плохо выделяет мокроту или откашливает ее эпизодически и в скудном объеме, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты ему следует дать отхаркивающее средство. При подозрении на туберкулез, пневмоцистную и легионеллезную пневмонию необходимо применять раздражающие аэрозольные ингаляции [7, 8] путем вдыхания в течение 10–15 мин 30–60 мл подогретого до 42–45 °С раствора, приготовленного на стерильной дистиллированной воде, содержащего 150 г/л натрия хлорида и 10 г/л натрия бикарбоната. Получаемая индуцированная мокрота по качеству идентична откашливаемой мокроте [9].

Для диагностики острой бактериальной инфекции достаточно одного образца мокроты, при исследовании на туберкулез или грибковую инфекцию собирают утреннюю мокроту 3 дня подряд, при этом нежелательно накапливать ее объем свыше 12 ч из-за чрезмерной контаминации посторонней бактериальной флорой. Для диагностики хронической инфекции легких и идентификации микроорганизмов, характеризуемых длительной персистенцией в легких, необходимо проводить мониторинг микрофлоры НДП.

Сроки доставки мокроты в лабораторию не должны превышать 1,5–2 ч от момента ее получения (допускается хранение в холодильнике, но не более 6 ч), так как задержка ведет к аутолизу

Streptococcus pneumoniae, за счет размножения бак- терий-контаминантов меняется истинное соотношение микрофлоры бронхиального секрета.

Перед посевом мокроту промывают в стерильном физиологическом растворе, готовят мазки для микроскопии, разжижают муколитиками или гомогенизируют в асептических условиях со стерильными стеклянными бусами, производят десятикратные серийные разведения в бульоне, из которых делают дозированные высевы на питательные среды с последующей количественной оценкой каждого типа колоний выросших микроорганизмов.

Образцы, отправляемые в референс-лаборато- рию для посева на МБТ, перевозят в охлажденном состоянии, или их необходимо изначально обработать натрия хлоридом во флаконах или пробирках с плотно завинчивающимися крышками, которые затем помещают в металлический

сосуд со стенками из адсорбирующего материала и упаковывают в предназначенный для транспортировки контейнер. Образцы для вирусного культивирования должны быть охлажденными, но не замороженными, в то время как для культивирования на хламидии образцы для транспортировки помещают в сахарозо-фосфатную среду и замораживают.

При исследовании на МБТ для разжижения мокроты перед посевом ее обрабатывают муколитиком (например, ацетилцистеином в течение 24–48 ч) и проводят деконтаминацию 2% раствором каустической соды по Ганеману (не более 15 мин) от посторонних бактерий. После разжижения и деконтаминации образцы центрифугируют (3800 об/мин), осадок микроскопируют и производят посев. Перед посевом на легионеллы следует использовать муколитики для разжижения мокроты. На рис. 5.11 представлен алгоритм микробиологического исследования мокроты.

Промывные воды бронхов. Пациенту во время вдоха специальным шприцем в трахею вводят 7–10 мл стерильного изотонического раствора, вызывающего кашлевой рефлекс. Недостаток — значительное разведение трахеобронхиального содержимого, что снижает возможность выделения бактерий, а концентрация их падает примерно в 100 раз по сравнению с мокротой.

Транстрахеальный аспират. Аспират из трахеи и дренирующих бронхов, в том числе вблизи очага воспаления легочной ткани, получают с помощью бронхоскопа. Следует помнить, что при введении бронхоскопа происходит контаминация секрета нижних отделов дыхательного тракта флорой ротоглотки, это искажает истинные результаты. В отличие от мокроты, ТТА можно исследовать на анаэробы.

Бронхоальвеолярный смыв. БАС, при котором проводят промывание сегмента легких стерильным изотоническим раствором, имеет наибольшее значение при постановке диагноза «пневмония, вызванная микобактериями» [10], Pneumocystis jiroveci у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (диагностическая эффективность достигает 89–98%) [11], также ЦМВ у пациентов с иммунодефицитом или после трансплантации органов [12, 13]. БАС можно использовать для культуральной диагностики легионеллезной, хламидийной и вирусной инфекций и для изучения с помощью молекулярных методов [14]. Чувствительность и специфичность метода БАЛ при этиологической диагностике инфекций НДП широко варьируют и в среднем составляют соответственно 69±22 и 88±14%.

Браш-биоптат. Материал получают из бронхов специальной канюлей с защищенными щетками с помощью фиброоптического бронхоскопа. Принцип метода состоит в использовании системы выдвижных каналов, предохраняющих материал от контаминации микрофлорой ротоглотки при вве-

дении и удалении бронхоскопа из нижних отделов дыхательного тракта, это позволяет производить исследования на анаэробы [15, 16].

Плевральная жидкость. Минимальный объем плевральной жидкости, необходимый для выделения бактерий, — 1–5 мл, грибов или микобактерий — не менее 10 мл. Избыток плевральной жидкости или гной транспортируют в стерильных флаконах с плотно завинчивающейся крышкой. При большом количестве материала производят посев в аэробные и анаэробные флаконы со средой для гемокультур в объемном соотношении 1:3–1:10.

Пунктат инфильтрата или абсцесса легкого.

Образцы получают при трансторакальной пункции под рентгенологическим контролем. Материал из абсцесса включает не только гной, но и ткань капсулы, отграничивающей абсцесс. Гной собирают шприцем, в котором его доставляют в лабораторию, либо содержимое переносят в анаэробные системы для транспортировки. Использование тампонов для взятия гноя на анаэробное исследование запрещено.

Биоптат легочной ткани. Трансбронхиальная и открытая биопсия легкого — наиболее агрессивные инвазивные методы, применение которых необходимо для диагностики оппортунистических инфекций у больных иммунодефицитами. В результате появления результативных бронхоскопических методов к инвазивным методам стали прибегать значительно реже. Свежесрезанную поверхность используют для приготовления маз- ков-отпечатков с последующей окраской на легионеллы, пневмоцисты и грибы. Около 1/3 или 1/2 части образца размельчают в асептических условиях в ступке с абразивным веществом с помощью пестика либо в механическом гомогенизаторе. Размельченную суспензию или гомогенизированный экстракт используют для посева на легионеллы. Экстракт центрифугируют, из осадка готовят окрашенные мазки для выявления пневмоцист. Этот способ более чувствительный для выявления цист P. jirovecii по сравнению с мазка- ми-отпечатками или гистологическими препаратами целого легкого. Оставшуюся часть образца размельчают (или гомогенизируют) для последующего микроскопического изучения и культурального исследования суспензии (или экстракта) на бактерии, грибы, вирусы, микоплазмы, хламидии. Гомогенат также можно использовать для изучения молекулярно-генетическими методами.

Кровь на гемокультуру. Целесообразно исследовать в первые 3–4 дня от начала заболевания, когда можно выделить гемокультуры при острой бактериальной пневмонии в 3–37% наблюдений [9]. Необходим посев крови, взятой при двух раздельных венопункциях с интервалом в 30–40 мин, это снижает частоту ложноположительных результатов за счет бактерий-контаминантов кожи на 70%. Если в предшествующие 1–2 нед больному

Мокрота

Haemophillus influenzae

Рис. 5.11. Алгоритм микробиологического исследования мокроты

235

обследования Методы

проводилась антимикробная терапия, кровь на посев берут 2–3 раза в сутки в течение 3 дней. Не следует собирать кровь из внутрисосудистых катетеров, кроме случаев, когда предполагают сепсис катетерного происхождения. Посев осуществляют во флаконы с питательными средами для аэробного и анаэробного культивирования. Перед использованием флаконов визуально определяют прозрачность среды: любое помутнение свидетельствует о ее непригодности. Флаконы хранят в холодильнике, перед использованием (за 30–60 мин) — при комнатной температуре. Оптимальный объем крови для исследования у взрослых составляет 20–30 мл.

Моча. Пневмококки в моче можно выявить у 38% больных при пневмококковой пневмонии [17]. Для посева исследуют утреннюю среднюю порцию свободно выпущенной мочи в объеме 3–5 мл, используя стерильные емкости. Во избежание излишней ее контаминации при мочеиспускании нормальной микрофлорой нижних отделов мочевыводящего и урогенитального тракта необходимо произвести тщательный туалет наружных половых органов с мылом и кипяченой водой. Посев мочи следует проводить не позднее 2 ч после взятия материала либо в течение 8 ч при условии ее хранения в холодильнике. При проведении скрининговых исследований на микобактерию туберкулеза мочу (в объеме не менее 20 мл) исследуют 3 дня подряд. Для проведения вирусологических исследований (на аденовирусы, ЦМВ) мочу в замороженном виде в объеме 10–15 мл незамедлительно доставляют в лабораторию. Мочу также исследуют на наличие пневмококкового и легионеллезного антигенов.

Мазки из носа, зева и смывы из ротоглотки.

Образцы используют для выявления многих респираторных вирусов. Мазки из зева исследуют на наличие Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. методом ПЦР.

В работе Kabra et al. сравнивали результаты, полученные при посеве мазков из зева после кашля, мазков из зева до и после физиотерапии и мокроты. Чувствительность для выделения P. aeruginosa была 40, 42 и 82%, а для S. aureus — 57, 50 и 100% соответственно при посеве мазков из зева после кашля, мазков из зева до и после физиотерапии. Специфичность была высокая 99–100% как для P. aeruginosa, так и для S. aureus. Таким образом наиболее значимым исследованием для больных МВ является посев мокроты [18]. По данным Equi et al., чувствительность и специфичность результатов посевов мазка из зева после кашля по сравнению с результатами посевов спонтанной мокроты составляет 34 и 100% соответственно. Чувствительность показывает процент положительного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с положительным результатом, полученным при посеве мокроты. Специфичность показывает процент отрицатель-

ного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с отрицательным результатом, полученным при посеве мокроты [19].

Сыворотка крови. Образцы изучают с помощью серологических методов в острый период инфекции и у реконвалесцентов для диагностики пневмоний, вызванных Legionella pneumophila,

Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, вирусами и грибами.

Транспортировка и хранение. Установлено, что любая задержка, в частности хранение при комнатной температуре (20–25 °С), приводит к увеличению количества быстро растущих бактерий, что может привести к угнетению роста истинных патогенов, и наоборот, хранение в холодильнике (4 °С) может привести к гибели термофильных патогенных микроорганизмов. Результаты исследований ученых по данному вопросу противоречивы. Согласно Wong et al. (1984), Williams et al. (1978), хранение мокроты при температуре 4 °С в течение 48 ч не оказывает влияние на количественное содержание S. aureus, P. aeruginosa, H. influenzae или

S. рneumoniae. Gould et al. установили, что в 8,7% образцов клинического материала H. influenzae,

Moraxella catarrhalis и S. pneumoniae не выдерживают хранения при температуре 4 °С в течение 48 ч. Pye et al. показали, что в 24% образцов жизнеспособность P. aeruginosa была снижена в 10 раз. Согласно данным Pitt and Govan, бактерии В. cepacia погибают при хранении мокроты при температуре 4 °С [20].

Методы изучения образцов биологических материалов

Изучение образцов мокроты и других биологических жидкостей следует проводить, начиная от бактериологических методов, являющихся золотым стандартом, и дальнейшей идентификации микроорганизмов с помощью современных биохимических, физических (MALDI-TOF), мо- лекулярно-биологических (ПЦР, мультилокусное секвенирование, полное геномное секвенирование), серологических методов.

Бактериологическая диагностика. На основании проведенных исследований, многолетнего опыта лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России и анализа данных зарубежных авторов разработан алгоритм микробиологической диагностики хронической легочной инфекции у больных МВ (см. рис. 5.11). Разработанный алгоритм идентификации можно использовать для идентификации различных видов микроорганизмов не только в мокроте, но и в других биологических жидкостях. Алгоритм идентификации был апробирован при мониторинге хронической инфекции легких у больных МВ, который проводили совместно с Московским цен-

тром муковисцидоза и Институтом пульмонологии. Исследование проводили в два этапа. За период с 2008 по 2009 г. в динамике на протяжении 2 лет обследовано 84 ребенка, больных МВ жителей г. Москвы и Московской области. 40 детей проходили лечение в отделении медицинской генетики РДКБ, 44 ребенка находились на амбулаторном лечении в Московском центре муковисцидоза [2, 4]. За период 2012–2013 гг. было проведено микробиологическое исследование 369 образцов мокроты и мазков из зева от 167 детей с тяжелым течением МВ в стадии обострения, наблюдавшихся в РДКБ, и 26 образцов от 26 взрослых больных, наблюдавшихся в НИИ пульмонологии. У 99 детей образцы брали до и после антибиотикотерапии с интервалом 15–30 дней. У 20 из них был проведен также микробиологический мониторинг с интервалом от 4 до 15 мес.

Для идентификации S. aureus использовали желточно-солевой агар и 5% кровяной агар, тест на плазмокоагулазу, коммерческие тест-си- стемы Staphylotest 16 «Lachema» или BioMerieux API Staph. Определение бактерий P. aeruginosa проводили высевом на селективную среду — ци- тримид-агар, 5% кровяной агар, тест на оксидазу, наличие пигмента, характерного запаха (винограда или земляничного мыла), использование коммерческой тест-системы API 20NE «BioMerieux». Энтеробактерии идентифицировали высевом на агары Эндо, Макконки, Гектоен (Himedia). Для идентификации бактерий B. cepacia complex использовали разработанный алгоритм идентификации и типирования [4], включающий 2 последовательных этапа исследования: применение бактериологических, биохимических и других фенотипических методов (выявление гемолиза, способности образования биопленки) и молекулярно-биологических методов. Все штаммы были идентифицированы с помощью коммерческих тест-систем: API 20NE «BioMerieux», 24 NE «Lachema» в соответствии с инструкцией производителя. Рост на селективном агаре для Вcc (BCSA — Burkholderia cepacia selective agar) наблюдали при температуре 37 °С через 24 ч и 30 °С через 48 ч.

Чувствительность к антимикробным препаратам определяли в соответствии с МУК 4.2.1890-04 методом серийных разведений в бульоне, с использованием АТВ-стрипов для стафилококков и синегнойной палочки «BioMerieux». Антибиотики были выбраны в соответствии с рекомендациями для лечения заболеваний, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями [21]. Генотипирование штаммов проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, размером 10 нуклеотидов Sh1 (Short 1) — AATCGGGCTG. Для определения Bcc использовали ПЦР гена recA, специфичного для бактерий комплекса Bcc, с праймерами BCR1 — 5`TGACCGCCGAGAAGAGCAA и BCR2 5`CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC [22].

Определение геномовара проводили с помощью ПЦР с геномовар-специфическими праймерами согласно методам, описанным в работах A. Bauernfeind, I. Schneider, R. Jungwirth et al. (1999); E. Mahenthiralingam, J. Bishof, S.K. Byrne et al. (2000). Для идентификации Achromobacter xylosoxidans использовали праймеры на локус 16S рДНК AXF1 — 5’-GCAGGAAAGAAACGTCGCGGGT-3’ и AX-B1 — 5’-ATTTCACATCTTTCTTTCCG-3’ [23].

В отдельных случаях для подтверждения микробиологического диагноза использовали ПЦРреалтайм, мультилокусное секвенирование, полное секвенирование генома [5].

Обязательным для установления диагноза хронической инфекции, вызванной ассоциацией возбудителей, является неоднократное в течение 6 мес выделение чистой культуры микроорганизмов (золотой стандарт). Поэтому посев мокроты осуществляют на универсальные среды — 5% кровяной и шоколадный агары с накладыванием на поверхность дисков с гентамицином и оптохином для выявления Haemophilus influenza и Streptococcus pneumonia, и на селективные среды для выделения S. aureus, P. aeruginosa, Bcc, Candida spp.,

Enterobacteriacaee и НФМО (желточно-солевой агар, цетримидный агар, BCSA, Сабуро, Эндо).

При анализе данных бактериологических посевов, полученных с использованием разработанного алгоритма, установлено, что в группе детей с МВ до 1 года S. aureus выявляется только у 28,6% детей, а P. aeruginosa — у 19%, то в возрасте 5–7 лет золотистый стафилококк обнаруживают у 87,5% детей, а P. aeruginosa — у 31,2% детей. Таким образом, в возрасте до 1 года более чем у 1/3 больных МВ нижние дыхательные пути еще не обсеменены микроорганизмами, в возрасте 1–4 года нижние дыхательные пути обсеменены почти у всех больных (92,9%), а к 8–18 годам — у 100% больных. Хроническая стафилококковая, синегнойная или смешанная инфекция начинают диагностировать у 25% детей уже в возрасте 1–4 года, в возрасте 5–7 лет — у 50% больных, в возрасте 8–14 лет — у 65% и к 18 годам — у 80% больных МВ [3]. При этом установлено, что в 2/3 случаев хроническая инфекция легких осуществляется не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, причем у госпитализированных больных, в отличие от амбулаторных больных, эти ассоциации представлены, как правило, не двумя, а тремя и более видами микроорганизмов. За рубежом эти показатели в 2 раза ниже — в 35% иccледуемых образцов БАЛ выявляют рост двух микроорганизмов и в 10% случаев ассоциации представлены тремя и более видами микроорганизмов. Наиболее часто встречаемой ассоциацией является сочетание

P. aeruginosa + S. aureus (18,2%), P. aeruginosa +

Bcc (9,1%). В 18% случаев от больных в составе микробных ассоциаций выделяли одновременно мукоидный и немукоидный фенотип P. aeruginosa. В составе ассоциаций, кроме P. aeruginosa, часто

выявляются и другие представители неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов —

B. cepacia complex, S. maltophilia, A. baumanii, что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов микроорганизмов к легочной ткани. Полученные данные послужили основанием для заключения, что для больных МВ характерным проявлением инфекционных осложнений бывает смешанная инфекция. Таким образом, при анализе микрофлоры у детей, больных МВ, можно утверждать, что с увеличением возраста у больных формируются постоянные очаги хронической легочной инфекции, основными возбудителями которой являются P. aeruginosa и S. aureus [3].

Хроническая смешанная инфекция, как правило, представляет собой значительно большую проблему, чем моноинфекция, как для врачей, проводящих лечение инфекционного осложнения, так и для микробиологов и эпидемиологов. В экспериментах на мышах было показано, что смешанная инфекция, вызванная P. aeruginosa и Bcc, вызывает усиление вирулентных свойств возбудителей, и в течение суток наблюдается гибель всех животных, т.е. доза заражения из LD50 становится LD100 [24, 25]. Полученные данные позволили выдвинуть предположение, что симбиотические взаимоотношения исследуемых бактерий in vivo также выражаются в увеличении продукции факторов патогенности и утяжелении инфекционного процесса у животных. Взаимное усиление вирулентности in vivo бактерий видов P. аeruginosa и Bcc свидетельствует о возможности взаимного использования компонентов регуляторной системы «Quorum sensing» близкородственными бактериями. В этом случае бактерии выбирают стратегию развития острой инфекции, что может быть одной из причин ухудшения клинического состояния больных МВ, страдающих смешанной инфекцией. Нами впервые установлено, что более 83% клинических штаммов Bcc способны формировать биопленку, колонизировать поверхности органов и тканей, формировать постоянные резервуары инфекции в госпитальной среде. Способность бактерий к формированию биопленки считается маркером возбудителя, который может вызывать хроническую инфекцию. Биопленки являются клинически важными состояниями бактерий в легочной ткани, потому что в таком состоянии бактерии устойчивы к эрадикации фагоцитами и их элиминации при лечении антибиотиками (минимальная ингибирующая концентрация антибиотика увеличивается при этом в 100 раз и более) [26].

При учете посева материала на элективные питательные среды было установлено, что микроорганизмы в клиническом материале встречаются в ассоциациях. При этом доминирующими микроорганизмами у больных с тяжелым течением являются Pseudomonas aeruginosa, выделен у 51 больного ребенка (30,5%), Burkholderia cepacia complex у 48 (28,7%), Staphylococcus aureus — у 89

(53,3%) и Achromobacter xylosoxidans — у 15 (9%), грибы рода Candida — у 96 (57,5%), при этом грибы у 21 пациента были обнаружены только при вторичном посеве после антибиотикотерапии (что еще раз доказывает появление грибов после антибиотикотерапии).

Микроорганизмы почти в 100% случаях встречались в ассоциациях.

У8 больных высевали из материала одновременно Bcc, P. aeruginosa и S. aureus. Ассоциация

Bcc и P. aeruginosa была у 18 больных, ассоциация

P. aeruginosa и S. aureus — у 15 больных, Всс и S. aureus — у 12 больных.

Золотистый стафилококк. Идентификацию стафилококков проводили на селективной среде жел- точно-солевого агара. На основании фенотипических свойств — наличия пигмента и лецитиназной активности — 173 штамма стафилококков были отнесены к виду S. аureus. Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus необходимо использовать тест на коагулазу. Коагулаза (coagulase) — это фермент, образуемый определенными видами микроорганизмов рода Staphylococcus, который вызывает свертывание плазмы крови. Летициназоположительные стафилококки, характеризуемые положительным тестом на коагулазу, были отнесены к виду S. аureus. Коагулазу продуцируют также S. intermedius и S. hyicus, которые редко присутствуют в клиническом материале. В некоторых случаях идентификацию стафилококков до вида проводили с помощью коммерческой тест-системы Staph 16 (Lachema).

Убольных МВ встречаются атипичные формы золотистого стафилококка, которые трудно выделять и идентифицировать общепринятыми методами благодаря их замедленному росту и нетипичным для стафилококков свойствам. Такие атипичные формы называют штаммами с фенотипом мелких колоний (small-colony variant (SCV)). Бактерии медленно растут, в результате через 48 ч роста формируются очень маленькие без пигмента и гемолиза колонии, имеющие «fried-egg»-фенотип («яичницы-глазуньи») или точечный фенотип, редко — мукоидный фенотип. SCV-стафилококки имеют также другие атипичные, не характерные метаболически нормальным стафилококкам свойства. Могут быть лецитиназоотрицательными, слабо коагулазоположительными, характеризоваться отсутствием фермента маннитола, ауксотрофными по гемину, тимидину и менадиону, а также возможностью возврата в родительскую форму. Часто ассоциируются с персистентной инфекцией и обладают резистентностью к антибиотикам [27].

По данным Gómez-González et al., распространенность SCVs S. aureus в клинических экземплярах составляет приблизительно 1%, а среди больных МВ — до 17%. SCV S. aureus может часто высеваться от пациентов, которые получали гентамицин или другие аминогликозиды [28]. Часто золотистый стафилококк может не идентифициро-

ваться при смешанных инфекциях с Pseudomonas aeruginosa: длительный рост S. aureus в присутствии экзопродукта 4-гидрокси-2-гептилхинолон N оксид бактерий P. аeruginosa, ингибирующего рост стафилококков, приводит к образованию SCV. Чаще SCV выделяется из нижних дыхательных путей больных МВ старших возрастных групп в ассоциации с Pseudomonas aeruginosa [29].

При этом разные модели инфекции на животных показывают различный уровень вирулентности SCV по сравнению с типичным S. aureus. Моделирование септического артрита на мышах показывает, что SCV более вирулентны, чем типичные стафилококки. Модель эндокардита на кроликах не подтвердила различие вирулентности у типичных и SCV-стафилококков. На модели Caenorhabditis elegans было показано, что SCV менее вирулентны, чем первичные родственные изоляты [27].

Лабораторная диагностика, определение чувствительности к антибиотикам атипичных форм золотистого стафилококка может иметь существенное значение для выбора тактики антимикробной терапии стафилококковой инфекции у больных МВ.

В результате наших исследований были выделены 12 штаммов SCV. При этом в 6 случаях наблюдали смешанную инфекцию с Pseudomonas aeruginosa. 4 из выделенных штаммов были резистентны более чем к трем группам антибиотиков, у двух из которых выявлен ген MecA. Поэтому при выделении штаммов с SCV-фенотипом необходимо подтвердить принадлежность к виду S. aureus с использованием молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST), исследовать на антибиотикочувствительность.

Другим важным моментом в диагностике стафилококковой инфекции является идентификация метициллинрезистентных стафилококков (MRS), среди которых особый интерес представляют MRSA.

Определение антибиотикочувствительности 208 штаммов и выявление MRS проводили дис- ко-диффузионным методом, 82 штамма из этих образцов также проверяли с помощью ATB стрипов (BioMerieux). Результаты тестов показали, что 31 (15%) штамм устойчив к оксациллину. Тест на коагулазу показал, что 15 из них были коагулазоположительными, что позволило нам, учитывая также пигментообразование и лецитиназную активность, отнести их к MRSA, а остальные 16 штаммов — к метициллинрезистентным КОС.

Определение чувствительности к антибиотикам 82 штаммов стафилококков с помощью ATB показало что 29 из них были резистентны менее чем к трем антибиотикам, 31 — к 3–5 антибиотикам, 22 — более чем к 5 антибиотикам. 71 из 82 (88,7%) были устойчивы к гентамицину, 69 (84,1%) — к пенициллину, 50 (61%) — к эритромицину. К ванкомицину и линезолиду были чувстви-

тельны 100%, к рифампицину и фузидину — 97,9

и93,8% соответственно.

Склинической точки зрения важно дифференцировать штаммы, имеющие ген MecА, обусловливающий резистентность ко многим антибиотикам, от штаммов с другими редко встречаемыми механизмами резистентности. При стафилококковых инфекциях, вызванных штаммами, характеризуемых наличием гена MecA, терапия β-лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) неэффективна, кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин).

Спомощью ПЦР гена MecA было установлено, что у 29 штаммов резистентность к оксациллину обусловлена наличием гена MecA. Резистентность к оксациллину 2 остальных штаммов можно объяснить гиперпродукцией β-лактамазы BOR-SA (borderline S. aureus), или новой, модифицированной способностью связывания пенициллина (MOD-SA), или наличием гена MecC, т.е. нового варианта гена MecA, идентичность которого с MecA составляет примерно 70%.

Поскольку способность формирования биопленок является свойством штаммов, которые могут вызывать хроническую инфекцию, нами было изучено формирование биопленок у 106 штаммов стафилококков. По способности формировать биопленки были разделены на три группы: I — обладающие выраженной способностью к формированию биопленки; II — с умеренной способностью образовывать биопленки; III — с низкой способностью или отсутствием способности формирования биопленки. Установлено, что способность к формированию биопленки у исследованных штаммов оказалась различной. Из 106 изученных изолятов у 16 штаммов (16,9%) наблюдали выраженную способность к формированию биопленки, у 54 (57,2%) — умеренную, у 36 штаммов (38%) — низкую.

Основным экзополисахаридом, продуцируемым S. aureus и S. epidermidis, с помощью которого происходит межклеточное взаимодействие при образовании биопленок, является полисахарид межклеточной адгезии (PIA), также известный как поли-N-ацетил глюкозамин (PNAG). Синтез PIA/PNAG кодируется ica-опероном, состоящим из 4 генов icaA, icaB, icaC и icaD [30]. Ключевыми продуктами являются трансмембранные протеины IcaA и IcaD, которые участвуют в синтезе PNAG. В связи с этим одним из направлений дальнейшего изучения штаммов стафилококков, выделенных от больных МВ, будет исследование на наличие генов icaA и icaD.

Таким образом для точной идентификации видов стафилококков необходимо использовать комплекс бактериологических, биохимических, молекулярно-генетических методов.