- •Олигонуклеотиды как лекарственные средства
- •ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА Комплементарные взаимодействия
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА Неканонические структуры
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА Неканонические структуры
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА
- •ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ СТРУКТУРА, СВОЙСТВА
- •Пространственная организация молекулы олигонуклеотида зависит от:
- •Молекулярные мишени негативная регуляция экспрессии генов
- •Молекулярные мишени экспрессии генов
- •Молекулярные мишени негативная регуляция экспрессии генов
- •Молекулярные мишени негативная регуляция экспрессии генов
- •Молекулярные мишени негативная регуляция экспрессии генов
- •Молекулярные мишени негативная регуляция экспрессии генов
- •Молекулярные мишени МУТАГЕНЕЗ (генокоррекция)
- •Молекулярные мишени АПТАМЕРЫ (ненуклеотидные мишени)
- •АПТАМЕРЫ
- •АПТАМЕРЫ ДНК
- •АПТАМЕРЫ ДНК
- •АПТАМЕРЫ
- •АПТАМЕРЫ
- •Создание лекарственных средств на основе олигонуклеотидо
- •Модификации олигонуклеотидов
- •Модификации олигонуклеотидов
- •Системы доставки.
- •Биохимические
- •Структура белковых векторов - переносчиков ДНК
- •переносчиков ДНК
- •Постановка задачи
- •Постановка задачи
- •Структура вектора PGEk
- •Структура вектора PGEk Позиция модификации ЭФР
- •Структура вектора PGEk
- •Получение PGEk
- •Получение PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk СОСТАВ КОМПЛЕКСОВ
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk Комплекс PGEk-ДНК. Модели
- •Изучение свойств PGEk
- •Изучение свойств PGEk СОСТАВ КОМПЛЕКСОВ PGEk-ДНК.
- •Изучение свойств PGEk СОСТАВ КОМПЛЕКСОВ PGEk-ДНК.
- •Гипотетические механизмы транслокации олигонуклеотида в ядро при доставке с помощью PGEk
- •PGEk - белковый вектор для генотерапии
- •ИТАК….
Изучение свойств PGEk СОСТАВ КОМПЛЕКСОВ
Зависимости относительной удельной флуоресценции клеток линии А431 (кривые 1 и 2) и К562 (кривые 3 и 4) от молярного избытка PGEk в смесях с олигонуклеотидами TMS (кривые 1 и 3) и TMO (кривые 2 и 4). Концентрация олигонуклеотидов = 200 нМ.
Изучение свойств PGEk
In vitro
Универсальность и селективность
Изучение свойств PGEk
In vitro
Внутриклеточная локализация
Микрофотографии клеток линии SCOV3 после 24 часовой инкубации с комплексом PGEk- TMS-5'FAM.
- ядра - олигонуклеотид
СУПЕРПОЗИЦИЯ
Изучение свойств PGEk
In vitro
Эффективность
•Цитотоксическая активность комплексов PGEk с фосфотиоатными олигонуклеотидами-антисенсами в отношение В-клеточной лимфомы Namalva. Инкубация 120 час., 2-кратное добавление.
Изучение свойств PGEk
In vitro
Защита олигонуклеотидов от внутриклеточной деградации
•Определение цитотоксической активности комплексов антисенса AS-TMO-PO и его фосфотиоатного аналога (AS-TMO-PS) с PGEk в отношении культуры опухолевых клеток карциномы молочной железы человека (линия MCF-7).
Добавлено |
IC50 AS-TMO-PO, нМ |
IC50 AS-TMO-PS, нМ |
0 |
не найдено (>1000) |
не найдено (>1000) |
|
|
|
Липофектин |
не найдено (>1000) |
109 |
|
|
|
PGE-k, в |
~470 |
~470 |
молярном |
|
|
соотношении |
|
|
олигонуклеотид- |
|
|
белок 1:5 |
|
|
|
|
|
Изучение свойств PGEk Комплекс PGEk-ДНК. Модели
Модели взаимодействия PGEk с одноцепочечной и дуплексной ДНК (на основе расчета для ДНК- связывающего домена PGEk в вакууме.)
Изучение свойств PGEk
Комплекс PGEk-ДНК. Инструментальный анализ.
•Образование комплексов регистрировали независимыми методами, анализируя динамику процесса по данным КД-спектроскопии (Метод А), флуориметрии Trp- остатков PGEk (Метод B) и
поляризованной флуориметрии этидия (Метод C).
•PGEk быстро образует устойчивые комплексы с линейными, дуплексными и квадруплексными олигонуклеотидами.
•Кооперативный механизм связывания. Взаимодействие боковых поверхностей молекул вектора.
•Константы связывания олигонуклеотид- PGEk
•
|
|
Константы |
|
Тип |
Метод |
||
Олигонуклеотид |
связывания, 10-7, M-1 |
взаимодействия |
|
||||
|
|
|
T, oC |
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
37 |
|
|
ТМО(фосфодиэфир) |
|
|
|
|
|
Коопе- |
A,B,C |
|
3.5 |
0.1 |
|
3.1 |
0.1 |
ративный |
A,B,C |
|
|
A,B,C |
|||||
|
|
|
|
||||
ТМS (фосфоротиоат) |
|
|
|
3.0 0.1 |
|
|
|
|
3.2 |
0.1 |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
||
d(GT)12 |
|
|
|
|
|
|
|
(фосфодиэфир) |
0.15 |
0.02 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
•PGEk частично разворачивает четвертичную спираль G- квадруплекса, т.е. обладает некоторым хеликазным свойством по отношению к структуре внутримолекулярного G-квадруплекса.