3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Курс лекций по общей хирургии

1.Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2.Осмотреть стандартные гемагглютинирующие сыворотки, чтобы они не содержали осадка, не был просрочен срок годности, были правильно расположены по отношению друг к другу.

3.На пластинке (тарелке) написать фамилию больного.

4.Согласно обозначениям групп крови на тарелке, в каждую лунку нанести отдельной пипеткой по одной капле стандартной сыворотки - первой, второй и третьей группы двух серий образуя два ряда по три капли в каждом.

5.Взять кровь. Кровь для исследования берется из пальца или вены. При взятии крови из пальца в левую руку взять левую кисть больного, обработать спиртом дистальную фалангу IV пальца и проколоть стерильной иглой, при этом первую каплю крови удалить.

6.Шесть капель крови перенести стеклянной палочкой на терелку, размещая их рядом с каплей стандартной сыворотки. Можно на тарелку нанести одну большую каплю крови, а затем уголком предметного стекла перенести в капли сыворотки. Каждый раз кровь берут новым уголком стекла. Соотношение исследуемой крови и стандартной сыворотки должно быть 1:10.

7.Место укола пальца обработать спиртом.

8.Каждую каплю крови и сыворотки на пластинке смешать отдельной палочкой.

9.Пластинку осторожно покачивать в течение 5 минут, постоянно обращая внимание на лунки, где может наступить аггютинация (склеивание эритроцитов). По мере наступления агглютинации, но не раньше чем через три минуты в капли на пластинке (тарелке) добавить по одной капле изотонического раствора хлорида натрия.

10.Реакция агглютинации может быть положительной или отри-

цательной.

Агглютинация наступает обычно в течение первых 10-30 секунд. Визуально в капле появляются мелкие красные зернышки (агглютинаты), которые состоят из эритроцитов. Мелкие агглютинаты сливаются в более крупные. Сыворотка обычно частично обесцвечивается. Если агглютинация не происходит сыворотка остается окрашенной в красный цвет, агглютинатов в ней нет. Следует помнить, что кровь содержащая агглютиноген А2 дает позднюю агглютинацию (на 3-4 минуте).

Результаты исследования в одной и той же группе двух серий должны совпадать.

181

Оценка результатов

Стандартные сыворотки трех групп не вызывают агглютинации эритроцитов во всех лунках - группа крови О (I) первая;

Стандартные сыворотки О (I) и В (III) группы агглютинировали эритроциты в первой и третьей лунках, а не агглютинировали во второй - группа крови А (II) вторая;

Наличии агглютинации в первой и второй лунках и отсутствии в третьей - группа В (III) третья;

Стандартные сыворотки всех трех групп агглютинировали эритроциты во всех лунках - данная кровь относится к четвертой группе АВ(IV). Если исследуемая кровь оказалась АВ(IV), группы проводится дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ(IV) группы. При отсутствии агглютинации исследуемой крови с сывороткой АВ(IV) группы данную кровь можно отнести к четвертой группе.

Примечание: Во всех сомнительных случаях необходимо провести повторное исследование с гемагглютинирующими сыворотками другой серии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ КРОВИ ДВОЙНОЙ РЕАКЦИЕЙ (ПО СТАНДАРТНЫМ СЫВОРОТКАМ И СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИ-

ТАМ) (перекрестный способ)

Суть метода – с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток определяется наличие или отсутствие в исследуемой крови групповых антигенов А и В, а с помощью стандартных эритроцитов наличие или отсутствие в плазме групповых антител α и β. Стандартные эритроциты представляют собой 10-20 % взвесь эритроцитов 0(I), A(II) и B(III) групп в цитратно-физиологическом растворе. Их готовят из крови доноров с заранее известной группой крови, хр а- нят при +4-8°С. Срок годности 2-3 дня.

Материальное оснащение: стандартные сыворотки 0(I), А(II),

В(III), групп двух серий, стандартные эритроциты 0(I), А(II), В(III) групп, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

1.Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2.Взять 3-5 мл исследуемой крови в пробирку без стабилизатора. Кровь должна отстояться, или ее центрифугируют для получения

сыворотки.

3. На планшет нанести по две капли стандартных сывороток группы 0(I), А(II), В(III), двух серий.

182

4.Соответственно каждой группе сывороток расположить по одной капле стандартных эритроцитов группы 0(I), А(II), В(III), .

5.В стандартные сыворотки добавить по одной капле испытуемой крови, а в стандартные эритроциты - по две капли испытуемой сыворотки.

6.Капли перемешать углом предметного стекла, всякий раз изменяя угол так, чтобы не произошло смешивание разных сывороток и

разных эритроцитов.

7. Покачивая планшет в руках в течение 5 минут, следят за наступлением агглютинации.

Оценка результатов:

При трактовке результатов оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами)

1.Эритроциты группы О (I) являются контрольными, агглютинация с ними не происходит.

2.Агглютинация со стандартными эритроцитами А и В и нет агглютинации в трех стандартных сыворотках двух серий - в исследуемой сыворотке присутствуют оба агглютинина и , а в испытуемых эритро-

цитах нет агглютиногенов, т. е. кровь относится к группе O(I).

3.Агглютинация со стандартными эритроцитами группы B(III)

исо стандартной сывороткой группы O(I), B(III) - в исследуемых эритроцитах имеется агглютиноген А, а в сыворотке исследуемой

крови - агглютинин . Следовательно, кровь относится к группе A(II). 4. Агглютинация со стандартными эритроцитами группы A(II) и со стандартной сывороткой группы A(II), O(I) – в исследуемых эрит-

роцитах имеется агглютиноген В, а в исследуемой сыворотке - агглютинин . Следовательно, кровь относится к группе B(III).

5. Нет агглютинации со стандартными эритроцитами и есть агглютинация со стандартными сыворотками - в исследуемых эритроцитах имеются обаагглютиногена А и В, а в сыворотке исследуемой крови отсутствуют оба агглютинина, кровь относится к группе AB(IV).

Примечание. Результат перекрестного способа считается достоверным только в случае совпадения ответов о группе исследуемой крови и со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами. При несовпадении результатов обе реакции необходимо переделать.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ

Определение группы крови можно произвести с помощью моноклональных антител (МКА). Для определения агглютиногенов

183

эритроцитов используют стандартные реагенты цоликлоны анти-А и анти-В. Получают моноклональные антитела с применением гибридомной битехнологии. Гибридома – это клеточный гибрид, возникший в результате слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих “родителей”: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту. Цоликлоны анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами. Они предназначены для определения группы крови системы АВО человека взамен стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Цоликлоны анти-А (красного цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и в лиофилизированной форме в ампулах по 20,50,100,200 доз с растворителем, приложенным к каждой ампуле по 2,5, 10,20 мл соответственно. Лиофилизированный порошок разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием. Для каждого определения группы крови применяют по одной серии реагента анти-А и анти-В.

Материальное оснащение: цоликлоны анти-А и анти-В, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

1.Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2.Убедиться в пригодности цоликлонов, донорской крови.

3.На тарелке написать Ф. И. О. донора и реципиента.

4.Вскрыть ампулы с цоликлонами, растворителями, смешать все с помощью отдельных шприцев, разлить цоликлоны во флаконы с пипеткой (анти-А – красный, анти-В – синий).

5.Взять кровь реципиента и донора.

6.В две лунки под соответствующими надписями: анти-А или анти-В нанести по 1 капле (0,1мл) цоликлонов: в первую – цоликлон

анти-А, во вторую – цоликлон анти-В.

7.Отдельным концом стеклянной палочки или отдельной пипеткой для каждой лунки перенести каплю крови в 10 раз меньше капли цоликлона с предметного стекла в лунку и смешать с каплей цоликлона до гомогенного пятна.

8.Блюдце осторожно покачивать в течение 2,5 мин.

9.Оценить результат пробы без добавления изотонического

раствора натрия хлорида.

184

Оценка результатов:

-При отсутствии агглютинации с двумя цоликлонаи группа крови 0(I) – первая.

-При наличии агглютинации с цоликлоном анти-А группа крови А(II) – вторая.

-При наличии агглютинации с цоликлоном анти-В группа крови В(III) – третья.

-При наличии агглютинации с двумя цоликлонами группа крови АВ(IV) – четвертая.

ОШИБКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Ошибки при определении групповой принадлежности крови могут быть обусловлены тремя видами причин:

-техническими;

-неполноценностью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;

-особенностями испытуемой крови.

Технические причины:

-нарушение порядка расположения сывороток на планшете;

-нарушение соотношения сыворотки и эритроцитов;

-несоблюдение внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды)

-несоблюдение положенного для реакции агглютинации времени

-применение загрязненных кровью планшетов, пипеток, предметных стекол;

-неправильная запись исследуемой крови;

Применение неполноценных стандартных сывороток и стандартных эритроцитов:

-слабые стандартные сыворотки с титром ниже 1:32 или истекшим сроком годности могут вызывать позднюю и слабую агглютинацию;

-применение негодных стандартных сывороток или эритроцитов, нестерильно приготовленных и недостаточно законсервированных, ведет к возникновению неспецифической, «бактериальной» агглютинации.

Особенности испытуемой крови

-наличие в крови слабого агглютиногена А2,.

-кровь обладает свойством «панагглютинации» или «аутоагглютинации», т. е. дает неспецифическую агглютинацию со всеми сыворотками и даже со своей собственной сывороткой. Для устранения панагглютинации планшет помещают в тер-

185

мостат при температуре 37° на 5 минут, после чего панагглютинация исчезает, а истинная остается.

ТАКТИКА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППЫ КРОВИ

Непосредственно в отделении группа крови определяется врачом по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам или с помощью цоликлонов, после этого в серологической лаборатории производится проверка перекрестным методом. Если результаты совпадают, то группа крови считается определенной. В случае расхождения результатов, производятся повторные исследования.

В экстренных ситуациях можно ограничится реакцией с изогемагглютинирующими сыворотками или цоликлонами, но при возможности следует использовать перекрестный метод.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ФАКТОРА

Для определения резус-фактора применяют несколько методик. При этом используют специальные сыворотки, содержащие анти- резус-антитела, которые получают из крови резус-отрицательных людей, иммунизированных резус-фактором. Сыворотка антирезус должна принадлежать к той же группе крови по системе АВО, какая имеется у больного.

Метод агглютинации в солевой среде.

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод определения резус-фактора в пробирках с примене-

нием желатина. Реакцию проводят в центрифужных пробирках, в которые помещают равные объемы эритроцитов, сыворотки антирезус и 10 % раствора желатина. После встряхивания пробирки помещают в водяную баню при температуре +46-48˚С на 5 минут, после чего добавляют 5-8 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат реакции по наличию агглютинатов, видимых невооруженным глазом.

Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Наиболее чувствительная реакция для выявления неполных антител к ауто - и изоантигенам эритроцитов. Её применяют при возникновении трудностей в определении резус принадлежности крови,

186

связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на применении антиглобулиновой сыворотки (АГС).

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резусположительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь – резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D- моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА с образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстро наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная – агглютинация отсутствует.

Экспресс-методы определения резус-фактора. Эти методы удобны для практических врачей в экстренных случаях.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента. Представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), содержащую 33 % раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса “антиген-антитело” и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации

187

эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резусотрицательной принадлежности исследуемой крови.

Экспресс-метод определения Rh-фатора на плоскости без подогрева.

На белой пластинке со смачиваемой поверхностью пишут фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. На левом краю пластинки делают надпись “сыворотка-антирезус”, на правом - “контрольная сыворотка”. Последней служит разведенная альбумином сыворотка группы АВ(IV), не содержащая антител анти-резус. Соответственно надписям на пластинке помещают по 1-2 капли (0,05-0,1 мл) реактива анти-резус и контрольной сыворотки. К обеим каплям добавляют исследуемые эритроциты. Кровь размешивают с реактивом сухой стеклянной палочкой, размазывая на пластинке до образования капли диаметром 1,5 см. пластинку слега покачивают. Через 3-4 минуты для снятия возможной неспецифической агглютинации к каждой капле добавляют 5-6 капель физиологического раствора. Затем пластинку покачивают в течение 5 минут.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации невооруженным глазом.

Наличие хорошо выраженной агглютинации в капле слева указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации в этой капле (гомогенная окраска) говорит о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови (Rh-). Результат считается истинным лишь при отсутствии признаков агглютинации в правой (контрольной) капле.

ОШИБКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РЕЗУС-ФАКТОРА

Выделяют следующие причины возникновения ошибок при определении резус-фактора:

-технические погрешности.

-биологические особенности испытуемой крови Технические погрешности.

-неправильное соотношение между сывороткой и эритроцитами;

-преждевременная оценка результатов;

-оценка результатов по высыхающей капле;

-использование неактивных, инфицированных, загнивших и с истекшим сроком сывороток;

188

-определение резус-фактора в гемолизированном и длительно хранящемся образце крови.

Биологические особенности испытуемой крови:

-снижение агглютинабельности резус-антигена при некоторых заболеваниях печени, почек, системы крови;

-неспецифическая агглютинация испытуемых эритроцитов. При получении сомнительных результатов необходимо повто-

рить исследование, используя более чувствительные методы.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРУППОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ. УЧЕНИЕ О СОВМЕСТИМОСТИ

Группа крови любого человека индивидуальна. Выше указывалось о существовании множества антигенных систем крови. Любой эритроцитарный, лейкоцитарный, тромбоцитарный или плазменный антиген может быть причиной иммунологической совместимости. Однако основную роль при определении совместимости играют антигены системы АВО и Rh-Нr.

Несовместимость крови донора и реципиента наступает при вливании крови, содержащей антигены, на которые у реципиента в плазме имеются антитела. В таких случаях возникает агглютинация и гемолиз эритроцитов.

СОВМЕСТИМОСТЬ ПО СИСТЕМЕ АВО

В 1907 г. Grile, а в 1908 г. Ottenberg первыми выдвинули положение о переливании крови с учетом групповой совместимости. Они установили, что при переливании крови только одноименных групп, или в случае, когда сыворотка реципиента не агглютинирует эритроциты донора гемотрансфузия будет успешной. В случае, когда сыворотка реципиента агглютинирует эритроциты донора, развиваются тяжелые осложнения, обусловленные агглютинацией и гемолизом эритроцитов. На основании этих наблюдений, был сделан абсолютно правильный вывод: можно переливать только биологически совместимую кровь.

Оттенберг, изучая проблемы совместимости, сформулировал правило: агглютинируются эритроциты переливаемой крови, а не крови реципиента, так как аггглютинины донорской крови разводятся в крови реципиента, их титр становится низким и они не могут агглютинировать его эритроциты

По правилу Оттенберга можно переливать кровь, эритроциты которой не агглютинируются сывороткой реципиента, т. е можно переливать не только однгуппную кровь, но при совместимости кровь других групп.

189

Согласно правилу Оттенберга кровь других групп можно переливать по схеме.

Аβ(II)

Oαβ(I) ABO(IV)

Bα (III)

Кровь первой группы можно переливать людям всех остальных групп, так как эритроциты группы 0(I) не содержат агглютиногенов А и В,поэтому не могут дать агглютинацию ни с какими сыворотками.

Сыворотка группы AB(IV) не содержит никаких агглютининов, поэтому эритроциты других групп не будут агглютинироваться. Поэтому больным с группой крови AB(IV) можно переливать кровь любой группы. Учитывая такую совместимость групп крови, были введены понятия «универсальный донор» и «универсальный реципиент». Соответственно лица группы 0(I) отнесены к «универсальным донорам», а группы AB(IV) к «универсальным реципиентам».

Однако, необходимо помнить, что при переливании большого количества иногруппной совместимой крови больным с массивной кровопотерей агглютинины плазмы донора не получают достаточной степени разведения плазмой реципиента, и могут агглютинировать эритроциты больного, вызывая посттрансфузионный шок. Поэтому правило Оттенберга можно применять при трансфузии не более 1 литра крови.

СОВМЕСТИМОСТЬ ПО СИСТЕМЕ АНТИГЕНОВ RH-НR

Выше указывалось, что в крови людей содержатся только антигены этой системы, а антител по отношению ним в норме не имеется.

Однако в некоторых случаях у резус-отрицательных лиц может произойти сенсибилизация, т. е. могут образоваться изоиммунные антитела антирезус. Причинами выработки антител могут стать переливание резус-положительной крови резус-отрицательным реципиентам, беременность женщины с резус-отрицательной кровью резусположительным плодом.

Переливание резус-несовместимой крови.

При первом переливании резус-положительной крови резусотрицательному больному из-за отсутствия в его плазме антител реакции несовместимости не возникает. Однако происходит образование антирезусных антител. При повторной гемотрансфузии резус -

190