2 курс / Нормальная физиология / ТЕХНОЛОГИИ_ДИАГНОСТИКИ_И_КОРРЕКЦИИ_ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ_НАРУШЕНИЙ

ДИАГНОСТИКА

следующем этапе изображение подвергается процессу обработки. К наиболее важным операциям преобразования изображения относятся оцифровывание,

Рис. 108. Фотоархивы: А — лимфоциты с гранулами диформазана при реакции на α-глицерофосфатдегидрогеназу; В — лимфоциты с гранулами диформазана при определении СДГ

кодирование и сжатие данных, улучшение качества и восстановление, сегментация, анализ изображений. Для улучшения качества изображения проводятся цифровая фильтрация изображения (включает свыше 20 стандартных фильтров) и редактирование изображения (рис. 109).

Рис. 109. Последовательный компьютерный анализ активности (по цитохимическому препарату) сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови

290

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Далее проводятся измерения заданных параметров. Полученные количественные данные сохраняются в файле. После этого на экран дисплея компьютера выводятся данные, содержащие результаты измерения данного объекта. Таким образом, ферментативная реакция оценивается количественно. При стандартном микроскопическом увеличении пиксели переводятся в миллиметры, что позволило морфологические параметры результатов цитохимического анализа выражать в метрических величинах.

Вработе Грицинской В.Л. и соавт. (2003) продемонстрировано применение компьютерного морфоденситометрического анализа активности СДГ и αГФДГ в лимфоцитах с целью изучения метаболизма лимфоцитов крови у первоклассников в период адаптации к школе. Было установлено, что у детей в конце первого учебного года в лимфоцитах снижен уровень аэробных энергетических процессов, что проявляется на фоне преобладания симпатикотонического типа регуляции вегетативной нервной системы.

С помощью метода компьютерной морфоденситометрии также были исследованы уровни активности неспецифической эстеразы и αГФДГ в лимфоцитах крови у больных аутоиммунным тиреоидитом (Кадричева С.Г. и соавт., 2003). Было обнаружено, что в лимфоцитах у больных повышается активность αГФДГ (по увеличению оптической плотности гранул диформазана). Однако в связи с тем, что отсутствовало значимое повышение площади гранул, сформированных за счет специфической цитохимической реакции на αГФДГ, было сделано заключение об отсутствии повышения активности митохондрий. Кроме того, за счет увеличения значений оптических и морфологических характеристик гранул диформазана, сформированных при реакции на неспецифическую эстеразу, авторы сделали вывод об увеличении активности данного фермента, что отражает повышение деструктивных реакций лимфоцитов при аутоиммунном тиреоидите.

Эффективность гистохимических исследований для характеристики иммунометаболических процессов продемонстрировано в исследовании Arslan C. et al. (2022). Авторы изучали влияние инкапсулированной смеси эфирных масел на метаболический профиль сыворотки крови и лимфоцитов у кур. С помощью гистохимического анализа в лимфоцитах была исследована активность α-нафтила- цетатэстеразы и кислой фосфатазы. С помощью указанных методических приемов было установлено, что смесь эфирных масел улучшала метаболический профиль сыворотки крови и повышала количество лимфоцитов, положительных по α-нафтилацетатэстеразе и кислой фосфатазе (Arslan C. et al., 2022).

Вработе Botman D. et al. (2014) на примере исследования активности фос- фат-активируемой глутаминазы [(PAG), phosphate-activated glutaminase] предло-

жен метод количественной гистохимии. PAG (EC 3.5.1.2) катализирует

291

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

превращение глутамина в глутамат — первый этап глутаминолиза. Второй этап — превращение глутамата в α-кетоглутарат — осуществляется под действием глутаматдегидрогеназы. Глутаминолиз стал потенциальной терапевтической мишенью при некоторых видах опухолей различной локализации (Andersen J.V., Schousboe A., 2023; Jin H. et al., 2020). PAG считается митохондриальным, но активность данного фермента также была обнаружена в клеточных ядрах (Molenaar R.J. et al., 2018).

Глутаминолиз участвует в ряде клеточных процессов (рис. 110). α-Кето- глутарат, полученный из глутамина, может быть использован в TCA, анаплеротический процесс, который субстратно стимулирует основные обменные реакции в клетке, включая синтез АТФ в дыхательной цепи митохондрий (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012; Савченко А.А. и соавт., 2018).

С помощью изоцитратдегидрогеназ и аконитазы α-кетоглутарат может быть преобразован в цитрат, а затем в ацетил-коэнзим А (ацетил-КоА) для дальнейшего синтеза липидов (Коленчукова О.А. и соавт., 2008; Савченко А.А. и соавт., 1997, 2018). Глутамин может превращаться в пируват, а затем в малат с сопутствующим образованием НАДФН, который может использоваться для защиты клеток от стресса и в анаболизме липидов (Савченко А.А. и соавт., 2016, 2018; Wetzel T.J. et al., 2023). Глутамат, продуцируемый PAG, также является

Рис. 110. Внутриклеточные процессы, активность которых стимулируется продуктами глутаминолиза

предшественником глутатиона, который востребован в антиоксидантных процессах (Савченко А.А. и соавт., 2015, 2018). Аммиак, полученный в результате превращения глутамина, служит источником азота для синтеза нуклеотидов и белков (Jin J. et al., 2023). Следовательно, активность PAG важна для реализации пролиферативных процессов клеток иммунной системы.

292

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Метод количественной гистохимии реализован на принципе метаболического картирования активности PAG в нефиксированных криостатных срезах тканей и может быть использован на любом типе нефиксированных клеток (рис. 111). Между секцией криостата и предметным стеклом присутствует пленка экзогенной глутаматдегидрогеназы, которая непосредственно превращает глутамат, генерируемый PAG, в α-кетоглутарат. Одновременно глутаматдегидрогеназа восстанавливает в реакционной среде НАД+ до НАДН. НАДН восстанавливает переносчик электронов феназинметосульфат, который в свою очередь восстанавливает водорастворимый желтый нитросиний тетразолий в нерастворимый в воде синий формазановый осадок (Botman D. et al., 2014).

Рис. 111. Принцип метаболического картирования PAG с использованием соли тетразолия в качестве конечного акцептора электронов

(Botman D. et al., 2014): 1 — восстановленный феназинматосульфат; 2 — окисленный феназинметасульфат; НСТ — нитросиний тетразолий

В представленной методике для определения активности фермента в интактном клеточном микроокружении используются незафиксированные криостатные срезы без какой-либо химической фиксации, которая могла бы повлиять (обычно ингибировать) активность фермента. При избытке глутаматдегидрогеназы под секцией криостата формазан образуется внутри секции в местах, где активна PAG. Для обеспечения точной локализации ферментативной активности в инкубационную среду добавляют водорастворимый полимер — поливиниловый спирт, чтобы ограничить диффузию крупных молекул, таких как ферменты, из секции в среду. Напротив, небольшие молекулы, такие как коферменты, субстраты и соли тетразолия, могут свободно диффундировать в эту среду, содержащую поливиниловый спирт. Еще одним преимуществом указанного спирта является сохранение морфологии ткани. Все посттрансляционные модификации PAG и тканеспецифические условия остаются нетронутыми, что приводит к подлинному представлению активности фермента в его собственном клеточном окружении в конкретной ткани. Авторами данного метода было показано, что высокий уровень активности PAG выявляется в почках, головном мозге и печени мышей и демонстрирует различную кинетику в зависимости от того, какой тип PAG экспрессируется в данной ткани (Botman D. et al., 2014).

293

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Спектроскопия на протяжении вот уже десятков лет используется для структурных исследований и изучения химических превращений. Главное преимущество спектральных методов состоит в том, что возможно исследовать широкий спектр веществ как биологического происхождения, так и неорганической природы. Кроме того, методику исследований легко модифицировать и автоматизировать. Такие свойства спектроскопических методов делают их незаменимыми при исследовании, в том числе и биологических объектов. Спектроскопические методы позволяют обнаруживать незначительные количества вещества даже в довольно сложных системах.

При прохождении света через равномерно поглощающую среду его интенсивность I0 уменьшается до величины I. Отношение интенсивностей прошедшего и падающего света I/I0 называется пропусканием Т. Поглощение A или экстинкция Е — это величина, равная lg 1/Т = lg I0/I. Согласно закону ЛамбертаБэра, экстинкция пропорциональна концентрации поглощающего вещества и толщине образца, то есть

E = cd,

где — коэффициент молярной экстинции поглощающего вещества при длине волны , с — молярная концентрация раствора, d — оптический путь, или толщина образца в см.

Пропускание обычно измеряется в процентах и меняется от 0 до 100%. Экстинкция — величина безразмерная и изменяется от 0 до . Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Такие спектры для красителей в видимой области (400–700 нм) имеют иногда несколько максимумов. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм) и видимой областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле. Это обычно делокализованные -электроны двойных С=С связей и неподеленные пары азота и кислорода. Поскольку, как правило, электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем известных структур. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С = О.

Исследуемое вещество растворяют в соответствующем растворе и помещают в кювету. Для определения поглощения только исследуемого вещества используется кювета сравнения, идентичная кювете с образцом; в нее наливают только растворитель. Перед проведением измерений кюветы сравнивают.

294

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Поскольку стекло поглощает ультрафиолетовый свет, для проведения измерений необходимо использовать кварцевые кюветы.

Основное применение спектрофотометрии — точная колориметрия, то есть измерение количества хромофора, уже имеющегося в исследуемой пробе или образующегося в ходе реакции. Многие соединения, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими веществами дают окрашенные продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества. Такую цветную реакцию используют для обнаружения этих веществ. При некоторых стандартных условиях и определенных концентрациях вещества проводят реакцию, а затем измеряют поглощение смеси. В качестве сравнения используют ту же смесь, но без исследуемого вещества. После ряда измерений строят график зависимости поглощения образца от концентрации исследуемого вещества. Теперь, когда нужно определить количество вещества, в стандартных условиях проводят реакцию, измеряют поглощение образца и по градуировочной кривой определяют концентрацию исходного вещества. В биохимии этот способ применяется довольно часто, поскольку во многих случаях удается подобрать такие реакции, когда незначительные количества вещества дают сильное окрашивание.

При проведении цветных реакций необходимо помнить следующее:

1)исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме поглощения — этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, его следует определить. Такие предосторожности гарантируют получение хороших результатов даже на малочувствительном приборе;

2)в кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого вещества;

3)контрольный раствор должен быть приготовлен очень тщательно, поскольку от этого зависит получение правильного результата;

4)измерение концентрации необходимо проводить несколько раз и на кривую наносить все значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определения концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того, он позволяет сразу обнаружить неправильные измерения по их сильному отклонению от кривой;

5)калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реагента градуировочную кривую надо получить заново;

6)если поглощение образца лежит за пределами градуировочной кривой, надо заново приготовить раствор такой концентрации, чтобы попасть на градуировочную кривую. Можно поступить проще: разбавить образец, приготовленный для первого определения, одновременно разбавить точно так же и контрольную смесь. Эти операции правомочны, однако лишь в том случае, если поглощение образца подчиняется закону Ламберта–Бера.

295

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Наиболее часто спектрофотометрические методы используются для определения концентрации окисленной и восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД+ и НАДН соответственно) и его фосфорилированной формы — никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ+ и НАДФН соответственно). НАД+/НАДН и НАДФ+/НАДФН представляют собой две молекулы, присутствующие в каждой клетке и во всех организмах, и они играют ключевую роль в качестве кофакторов в фундаментальных катаболических и анаболических процессах соответственно (Савченко А.А. и соавт., 1996, 2012, 2017, 2020; Navas L.E., Carnero A., 2022). При этом данные молекулы являются коферментами для очень широкого класса ферментов — оксидоредуктаз (НАД(Ф)-зависи- мые дегидрогеназы). НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы являются ключевыми в биоэнергетических процессах и участвуют в направленной координации сопряженных метаболических потоков, что в значительной степени обусловливает адаптивные изменения клеточного обмена веществ (Инжеваткин Е.В., Савченко А.А., 2019; Куртасова Л.М. и соавт., 2002; Савченко А.А. и соавт., 2012).

Окисление НАДН с образованием НАД+ инициирует каскад реакций, в которых участвует сеть молекул коферментов и ферментов, как представлено на рис. 112. На схеме показаны два наиболее изученных пути, ведущих к синтезу НАД+.

Рис. 112. Окислительно-восстановительная сеть, связанная с восстановленным никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (по Veskoukis A.S. et al., 2018)

Примечание: черные прямоугольники обозначают биомаркеры, представленные в тексте; серые прямоугольники обозначают биомаркеры, представленные в работе

Veskoukis A.S. et al. (2016)

296

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Первый путь биосинтеза включает две стадии: первая представляет собой фосфорилирование никотинамида (Nam) в никотинамидмононуклеотид (NMN), катализируемое ферментом никотинамидфосфорибозилтрансферазой (NamPRT), а вторая — аденилирование NMN в НАД+ ферментом NMNаденилтрансферазой (NMNAT), который использует АТФ в качестве донора аденила (Савченко А.А. и соавт., 2012; Veskoukis A.S. et al., 2018). Второй путь биосинтеза НАД+ начинается с предшественника витамина B3 (никотинамидарибозид) (NR), с последующим его фосфорилированием до NMN с помощью АТФзависимой NR-киназы и аденилированием образовавшегося NMN до НАД+ с помощью NMNAT (Bieganowski P., Brenner C., 2004; Veskoukis A.S. et al., 2018). НАД+ последовательно фосфорилируется НАД+-киназа и превращается в НАДФ+. Затем НАД+ и НАДФ+ могут восстанавливаться с образованием НАДН и НАДФН соответственно. Окисление НАДФН является реакцией, подтверждающей центральную роль этой молекулы в фундаментальных окислительно-вос- становительных и метаболических путях. На рис. 113 показаны три основных окислительно-восстановительных пути, инициируемых реакцией восстановления с помощью трех ферментов, а именно: синтазы оксида азота (NOS), тиоредоксинредуктазы (TrxR) и глутатионредуктазы (ГР), с сопутствующим окислением НАДФН. НАДФН является необходимым донором электронов для NOS, которая образует оксид азота. Окисление НАДФН обеспечивает электроны для образования активной восстановленной формы TrxR из неактивной окисленной формы TrxR.

NADH — восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, NAD+ — окисленный никотинамидадениндинуклеотид, NADPH — восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат, NADP+ — окисленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат, NR — никотинамидарибозид, NR-киназа — никотинамидрибозидкиназа, NMN — никотинамидмононуклеотид, NamPRТ — никотинамидфосфорибозилтрансфераза, Nam — никотинамид, NMNAT — никотинамидмононуклеотидаденилтрансфераза, GRred — восстановленная форма глутатионредуктазы, GRox — окисленная форма глутатионредуктазы, GPxred — восстановленная форма глутатионпероксидазы, GPxox — окисленная форма глутатионпероксидазы, GST — глутатионтрансфераза, CAT — каталаза, SOD — супероксиддисмутаза, GSH — восстановленный глутатион, GSSG — глутатиондисульфид, Prxred — восстановленная форма пероксиредоксина, Prxox — окисленная форма пероксиредоксина, Prxoverx — сверхокисленная форма пероксиредоксина, Trxred — восстановленная форма тиоредоксина, Trxox — окисленная форма тиоредоксина, TrxRred — восстановленная форма тиоредоксинредуктазы, TrxRox — окисленная форма тиоредоксинредуктазы, Srx — сульфиредоксин, NO — оксид азота, NOS — синтаза оксида азота.

297

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Таким образом, НАДФН может восстанавливать (активировать) пероксиредоксин, чтобы нейтрализовать пероксиды и способствовать индуцированному сульфиредоксином восстановлению пероксиредоксина из его неактивного переокисленного состояния. Кроме того, окисление НАДФН также способствует трансформации ГР в восстановленное состояние, придавая клеткам высокий восстановительный потенциал. ГР индуцирует восстановление дисульфида глутатиона (GSSG) обратно до глутатиона (GSH), который в свою очередь активирует GPx — важный антиоксидантный фермент (Савченко А.А. и соавт., 2012).

Соответственно, в настоящее время разработан широкий протокол для спектрофотометрического определения количества НАДН и НАДФН, как в клетках, так и во внеклеточных средах, а также содержания различных соединений и активности ферментов, непосредственно связанных с данными молекулами: НАД+-ки- наза, НАДФН-оксидаза, пероксиредоксины, сульфиредоксины, тиоредоксины, TrxR и NOS.

Вчастности, для определения концентрации НАДФН наиболее широко используется протокол Wagner T.C., Scott M.D. (1994). НАДФ+ и НАДФН экстрагируются из лизата ткани, клеток или биологических жидкостей. Затем большая часть НАДФ+ разрушается при нагревании экстрактов при 60°С. Следовательно, экстракты содержат в основном НАДФН, а также следы НАДФ+, который остается стабильным, поскольку НАДФН может снова окисляться до НАДФ+ ex vivo. Принцип анализа основан на превращении глюкозо-6-фосфата (Г6Ф) в 6-фосфо- глюконат в реакции, катализируемой Г6ФДГ, с одновременным восстановлением оставшегося количества НАДФ+ до НАДФН (Wagner T.C., Scott M.D., 1994). В экстракты, содержащие НАДФН, добавляется НСТ. Смесь инкубируют

втемноте при 37 °С и измеряют поглощение на спектрофотометре при 570 нм (длина волны максимального поглощения диформазана). Концентрация НАДФН рассчитывается по закону Ламберта–Бера с использованием миллимолярного коэффициента экстинкции диформазана (13 л/ммоль/см). Аналогичным методом с помощью спектрофотометрического анализа определяют содержание НАДН. В данной методике в качестве фермента, осуществляющего восстановление НАД+ до НАДН, используется алкогольдегидрогеназа (Wagner T.C., Scott M.D., 1994).

Разработаны протоколы для определения активности ферментов, участвующих в метаболизме НАД+/НАДН и НАДФ+/НАДФН. В частности, разработан метод определения активности НАД+-киназы. НАД+-киназа катализирует производство НАДФ+ посредством фосфорилирования НАД+ (Tedeschi P.M. et al., 2016) (рис. 113).

Вцитозоле НАД+ может фосфорилироваться до НАДФ+ с помощью НАД+- киназы. Образовавшийся НАДФ+ затем превращается в НАДФН ферментами пентозофосфатного пути (PPP). Редуктазы, требующие НАДФН (например, TrxR

298

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 113. Схема образования восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата в цитоплазме и митохондриях

(по Outten C.E., Culotta V.C., 2003)

Примечание: стрелки, выделенные жирным шрифтом, указывают на ферментативные реакции, которые имеют решающее значение для устойчивости к окислительному стрессу

и ГР), затем могут использовать НАДФН в качестве кофактора, тем самым регенерируя НАДФ+ для пентозофосфатного цикла. В митохондриях существует другой путь первичной генерации НАДФН. НАДН, образующийся в TCA, может фосфорилироваться НАДН-киназой (Pos5p) с образованием НАДФН. После потребления НАДФН через антиоксидантные редуктазы НАДФ+-фосфатаза регенерирует НАД+ для рециркуляции обратно в цикл ТСА. Также НАДФ+-зависи- мая изоцитратдегидрогеназа (Idp1p) может регенерировать уровень НАДФН. Таким образом, НАД+-киназа является ключевым ферментом для регуляции внутриклеточных концентраций НАД+ и НАДФ+, осуществляя модуляцию метаболизма и функциональной активности клеток (рис. 114).

Активность НАД+-киназы регулируется окислительно-восстановительным состоянием клетки, поскольку она может модулировать клеточный и тканевой ответ на окислительный стресс, контролируя продукцию НАДФ+ и НАДФН. Outten C.E. и Culotta V.C. (2003) предложили следующий протокол по определению активности НАД+-киназы с помощью спектрофотометрического анализа. Тканевой или клеточный лизат добавляют к реакционной смеси, содержащей буфер трис-HCl (рН 7,8), НАД+ и АТФ, инкубируют в течение 5 минут при 30 °С.

299

https://t.me/medicina_free