Выделение чистой культуры аэробных бактерий
Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида. выращенная на питательной среде. Выделение чистой культуры аэробных бактерий достигается механическим разобщением исследуемого материала при посеве на питательные среды в присутствии кислорода.
Л.Пастер предложил для этой цели последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде, однако выделить чистую культуру этим методом очень сложно, т.к. при этом требуется очень большое количество разведений.
Проблему выделения чистых культур решил Р.Кох. Он предложил исследуемый материал последовательно разводить в пробирках с расплавленным и остуженным до температуры 45-50 °С МПА (количество разведении зависит от исходной обсемененности материала). Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри, которые помещают в термостат. На следующий день посевы изучают. Отбирают подозрительные колонии, изучают их макроскопически и микроскопически в окрашенных препаратах. Далее производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры визуально и микроскопически. В настоящее время метод Коха применяется, в основном, для подсчета количества микробов в исследуемом материале.
В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур используется метод Дригальского - поверхностный последовательный рассев исследуемого материала петлей или шпателем на три чашки (три сектора) с МПА. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. В случае необходимости исследуемый материал для посева разводят стерильным раствором 0,9% NaCl. Материал захватывают петлей и наносят на поверхность питательной среды. Движения петли должны производиться последовательно по всей поверхности среды, при этом крышку чашки Петри приоткрывают левой рукой ограниченно так, чтобы могла пройти только петля. После посева петлю прожигают в пламени спиртовки. Чашки подписывают на донышке и ставят вверх дном в термостат при температуре 37 °С на 18-24 часа.
Второй этап. На следующий день посевы просматривают и изучают изолированные колонии, описывая характер роста. Изучают морфологию бактерий исследуемых колоний путем приготовления мазка, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. Пробирки подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 часа.
Третий этап. На следующий день отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культуры характеризуется
однородным ростом. При микроскопическом исследовании мазка, приготовленного из чистой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки.
Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике иногда применяются и другие, например для выделения протея, обладающего «ползучим» ростом, используют метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА. Бактерии обладающие ползучим ростом из конденсационной воды вползают на поверхность агара. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры. Из верхнего края налета делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для выделения чистой культуры микробов с трудом культивируемых на питательных средах (например: пневмококков), используют биологический метод - заражение наиболее восприимчивых к данному виду возбудителя животных. После гибели или появления признаков заболевания животных забивают и производят посев крови и органов на питательные среды и микроскопическое исследование мазков-отпечатков из органов. Далее исследования проводят как в методе Дригальского.
Чистую культуру аэробных бактерий можно также получить, если на исследуемый материал воздействовать каким-либо физическим или химическим фактором, оказывающим избирательное антибактериальное действие. Например: для выделения чистых культур спорообразующих бактерий, исследуемый материал прогревают при температуре 80 °С в течение 20 минут или кратковременно кипятят для уничтожения вегетативных форм. Споры при этом сохраняются и при посеве материала на питательную среду прорастают. Далее чистую культуру получают обычным путем.
Для выделения чистой культуры возбудителя чумы посевы инкубируют при температуре 5 °С. Данный температурный режим подавляет рост сопутствующей микрофлоры.
Для получения чистой культуры кислотоупорных бактерий (микобактерии туберкулеза) исследуемый материал обрабатывают 2% серной кислотой, уничтожающей сопутствующую флору.