2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология 3
.pdf
Оглавление - нажми и вернешься |
31 |
Пример постановки реакции с целью сероидентификации («+» результат)
1) Исследуемый биоматериал фиксируется к поверхности предметного стекла и добавляется препарат - специфическая иммунная сыворотка (кроличья -СИКС), (или человеческая - СИЧС) – данный препарат состоит из 2 компонентов: специфические антитела в отношении антигена с одной стороны, а с другой стороны - глобулины человека или животного.
Если есть специфичность между антигеном и антителами – комплементарность, то происходит образование комплекса АГ-АТ и при этом в структуре препарата остается антиген человека или животного.
2)Планшет промывается водой, если образовался комплекс, то компоненты прочно соединены и не вымываются .
3)В планшету вносится антиглобулиновая сыворотка (АГС), меченная конъюгатой, содержащая антитела либо к человеческим, либо к кроличьим глобулинам. Если компоненты комплементарны – происходит образование сложного комплекса АГ-АТ и АГ-АТ конъюгата.
!!! 4) Проводится еще одно промывание водой
(Если произошло образование комплекса, то конъюгата прочно фиксирована к поверхности планшета)
5) Далее к комплексу добавляется субстрат – перекись водорода и хромогенное вещество. И после этого добавления происходит расщепление перекиси водорода до воды и активного кислорода. Активный кислород окисляет хромогенное вещество (аминосалициловой кислоты) с появлением коричневого окрашивания «+»
(Отрицательный результат «–« )
1)Если сыворотка, которая добавляется после фиксации искомого антигена не содержит специфических антител, значит образование комплекса невозможно.
2)Поэтому после промывания – вымывание компонентов На поверхности лунки остаются лишь фиксированные ранее антигены.
3)После добавляется антиглобулиновая сыворотка, ей взаимодействовать не с чем, поэтому образование комплекса невозможно.
4)После промывания водой во второй раз антиглобулиновая сыворотка (несвязавшийся компонент) из организма удаляется.
5)После добавления субстрата и хромогенного вещества – отсутствует окисление аминосалициловой кислоты - бесцветное вещество
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
32 |
3. Конкурентный метод ИФА
-немного похож на реакцию связывания с комплементом, т.к. там используется 2
системы АГ и АТ и происходит конкурентная борьба за взаимодействие с комплементом.
Искомый антиген (1) и меченный ферментом антиген (2) конкурировать друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе
Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе
Количество фермента, присоединившегося к твёрдой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител
Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.
Если искомый антиген и наносимая сыворотка комплементарны, то происходит образование комплекса антиген-антитело. В таком случае метка достаточно быстро расходуется, свободных меток не остаётся, соответственно после нанесения следующего компонента - специфического взаимодействия уже не происходит .
Используется: крайне редко из-за многоэтапности, нет необходимости в этом методе.
АППАРАТ:
Автоматический биохимический иммуноферментный анализатор
Соединяет в себе и метод биохимической идентификации, и серологический.
Выдает результат и процент вероятности, который определяется результатом, который был получен.
Не убирает необходимости получения чистой культуры - метод Дригальского.
4)Иммуноблоттинг
- комбинация иммуноэлектрофореза и методики иммуноферментного анализа.
Сначала происходит распределение искомого компонента по электрофоретической подвижности, вырезается лунка в структуре гелевого покрытия и наносится диагностическая сыворотка.
Потом ставится иммуноферментный анализ.
это самая чувствительная и специфичная методика!!! всегда достоверно
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
33 |
Используется для ВИЧ (1 этап - ИФА, если + то каждая положительная сыворотка переставляется в иммуноблоттинге).
Диагностические АГ препараты
1.Диагностикумы, содержащие заведомо известные АГ, применяющиеся в СР с целью поиска неизвестных АТ (серодиагностика).
Корпускулярные (целостные структуры м/о) — РА, ИФА, РИФ
Растворимые (частицы убитых м/о - АГ детерминанты) — РП, р. нейтрализации
Эритроцитарные: антигенные (РНГА, РНАТ) и антительные (РОНГА)
2.Вакцины - иммунобиологические препараты, изготовляемые из живых (аттенуированных) или убитых (инактивированных) микроорганизмов, токсинов, микробных антигенов и используемые для создания специфического активного искусственного иммунитета.
ЦЕЛЬ: применяют с профилактической целью (искусственный активный иммунитет), значительно реже с лечебной (при хронических, затяжных инфекционных заболеваниях).
Аттенуация - метод снижения вирулентности возбудителей инфекционных заболеваний (если вакцина живая, то она аттенуирована), а культуры с ослабленной вирулентностью - аттенуированными штаммами. То есть при введение такого м/о в макроорганизм не будет развиваться инфекция.
Способы аттенуации микроорганизмов
●Культивирование м/о при неблагоприятных условиях (например, повышение температуры) - как правило м/о сохраняют жизнедеятельность, но изменяются их биологические св-ва
Пример: В. anthracis при t=42,5-43,0°С - утрачивают способность к спорообразованию, теряют вирулентность.
●Культивирование при добавлении неблагоприятных веществ (Кальметт и Герен - желчь в картоф.агар)
Пример: БЦЖ (Вакцина против туберкулёза, приготовленная из штамма ослабленной живой бычьей туберкулёзной палочки - Mycobacterium bovis, которая практически утратила вирулентность для человека, будучи специально выращенной в искусственной среде)
Bacillus Calmette-Gurin (Бацилла Кальметта-Герена). 13 лет они занимались рекультивированием этой бактерии. Они её выращивали на картофельном агаре с желчью. Один и тот же штамм пересеивали на питательную среду. Итог: бактерия потеряла вирулентность, но сохранила АГ-свойства.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
34 |
Термин бацилла устарел, тк раньше так называли все гр+ палочки, а сейчас только если палочка образует споры.
●Облучение УФ-лучами (вакцина против листериоза)
●Многократные пассажи через организм невосприимчивых животных
(опыты Пастера с вирусом бешенства в организме кролика)
Кролики не страдают бешенством, но при регулярном прививании этого вируса из одного организма животного в другой, вирус все равно утрачивает свои свойства - вирулентность.
● Генно-инженерные методики
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
35 |
Подразделение вакцинных препаратов:
по назначению на профилактические и лечебные
Аттенуированные (живые)
ВЫЗЫВАЮТ КЛЕТОЧНЫЙ И ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
Бактериальные (БЦЖ) Бацилла Кальметта и Герена (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) -1921
Вирусные (корь, полиомиелит)
Риккетсиозные (сыпной тиф)
Живые вакцины готовят на основе ослабленных (аттенуированных) штаммов
микроорганизма со стойко закрепленной авирулентностью (безвредностью).
Вакцинный штамм после введения размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный инфекционный процесс, который у большинства привитых протекает без выраженных клинических симптомов.
Плюсы:
●Высокая иммуногенность (формируется длительный и напряженный иммунитет),
●Простота способа введения (как правило, однократно перорально, интраназально).
●Стойкий длительный иммунитет. накожно, внутрикожно,
Минусы:
●Получение живых вакцин - длительный и трудоемкий процесс.
●Особый режим хранения, очень чувствительный к его нарушению.
●Аллергические реакции - Не исключена опасность реверсии вакцинного штамма в вирулентный, как на стадии производства (поэтому необходим постоянный контроль), так и в организме вакцинированного. На практике реверсия возникает крайне редко. После вакцинации возможно развитие осложнений.
Инактивированные (убитые)
ВЫЗЫВАЮТ ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
Плюсы:
●Не трудно дозировать и очищать
●Выше безопасность
Минусы:
●Вероятность недостаточно выраженного иммунитета, т.е. требуется дополнительная ревакцинация.
●Могут иметь дополнительные компоненты из-за которых и бывает непереносимость.
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
36 |
3 группы:
1)Корпускулярные – содержат целостные структуры микроорганизмов в своем составе. ПРИМЕР: антирабическая (вакцина от вируса бешенства).
2)Химические – содержат в своем составе антигенные детерминанты, т.е. частицы убитых микроорганизмов. ПРИМЕР: менингококковые.
-создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки (содержат в своем составе строго определенные антигенные детерминанты).
-не содержат «балласта» и наименее реактогенны (вызывают минимальное кол-во побочных эффектов при введении в макроорганизм).
ПРИМЕРЫ: полисахаридные вакцины против менингококковой инфекции групп А и С (Менинго А+С), пневмококковой инфекции (Пневмо 23), ацеллюлярные коклюшные вакцины.
3) Анатоксины - ослабленные экзотоксины м/о. Утратили вирулентные свойства, но сохранили антигенную структуру.
ПРИМЕР: столбняк, ботулизм, газовая-гангрена, дифтерия, стафилококковая интоксикация и тд.
Получение анатоксина (по методике Рамона): Воздействие 0,4% р-ра формалина на протяжении 4 недель при температуре 40°C (подробнее см ниже)
!!! НЕ ПУТАТЬ анатоксин – содержит в своем составе антигены, антитоксин – содержит в своем составе антитела !!!
Анатоксины - препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммунологические свойства
Нативные анатоксины (по Рамону) |
Адсорбированные анатоксины |
|
|
1. Культивирование бактерий, |
Получают путем адсорбции токсических |
продуцирующих экзотоксины, в жидкой |
компонентов при помощи специальных в-в |
питательной среде |
(адъювантов): |
2. Фильтрование ч/з бактериальные |
Для очищения нативных анатоксинов |
фильтры для удаления микробных тел |
они подвергаются обработке различными |
3. Инкубирование с 0,3-0,4% р-ром |
физическими и химическими методами |
формалина в термостате при 37-40°C в |
(ионообменная хроматография, кислотное |
течение 3-4 недель |
осаждение и др.), в результате которых |
Высокое содержание компонентов |
получается концентрированный препарат, |
питательной среды, которые являются |
который адсорбируется на адъювантах |
балластными (не перевариваются в орг-ме |
(вво, исп-е для усиления иммунного |
|
|
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
37 |
человека) и могут способствовать развитию нежелательных реакций организма.
Методика имеет более историческое значение, нежели практическое
ответа).
Активность анатоксина определяется:
●В реакции флоккуляции и выражается в единицах флоккуляции, или
●В реакции связывания анатоксинов и выражается в единицах связывания (ЕС). Используются чаще в современной микробиологии.
Генноинженерные
Вакцина ENGERIX B (от вируса гепатита В) – первая генно-инженерная вакцина, которая была введена в клиническую практику.
● Полностью 100%-но синтетическая методика.
Основной принцип получения генно-инженерных вакцин:
из генома возбудителя инфекционного заболевания с помощью высокоспецефических ферментов – рестрикционых эендонуклеаз – вырезают гены, отвечающие за синтез протективных антигенов этого возбудителя.
Полученные гены встраивают в геном других, легкокультивируемых м/о (например, в E. Coli (киш. палочка) или в дрожжевые клетки)
Микроорганизмы, после внедрения в них этих генов, начинают продуцировать необходимый компонент, который используется в дальнейшем в вакцинном препарате.
Изучают экспрессию этих генов и отбирают наиболее эффективные клоны м/ов, продуцирующие новые протективные антигены.
Спутник V (противокоронавирусная вакцина, профилактика коронавирусной инфекции). Аденовирус не имеет клинических проявлений в макроорганизме, который (аденовирус) используется в качестве вектора для доставки в макроорганизм. Аденовирус очень нагружен геном, который ответственен за синтез белков S, которые входят в структуру суперкапсида коронавирусного патогена. Благодаря этому происходит выработка специфического иммунитета макроорганизма.
Методика получения генно-инженерных вакцин
Тут важны различные методики доставки в макроорганизм, которые связаны с использованием генетических аппаратов:
дрожжевых клеток,
непатогенных для человека бактерий (кишечная палочка),
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
38 |
непатогенных для человека инактивированных вирусов (аденовирус),
химерного вируса (создан искусственно и не имеет вообще никакого отношения к патогенности, но способен внедряться в макроорганизм с последующей репликацией, выступает в качестве вектора для доставки антигенной структуры в макроорганизм),
плазмидных структур (не очень широко используются),
растений - которые употребляются с пищей и так АГ поступают в организм
ассоциированные
Сюда относится АКДС – Адсорбированная Коклюшно-Дифтерийно-Столбнячная вакцина. Трехкомпонентный препарат, который содержит в себе 1 коклюшную ВАКЦИНУ и 2 АНАТОКСИНА (дифтерийный и столбнячный).
Основные требования к вакцинным препаратам:
Высокая иммуногенность и создание достаточно стойкого иммунитета;
Остаточная вирулентность для аттенуированных штаммов и стабильность их свойств при введении в макроорганизм;
Безвредность;
Ареактивность (отсутствие выраженных побочных реакций);
Гипоаллергенность (минимальное сенсибилизирующее действие);
Отсутствие в препарате контаминирующих микроорганизмов (компонентов, которые теоретически могли бы попасть в вакцину и которые не имеют отношения к профилактике инфекции, т.е. не нужны в препарате);
Доступность стоимости производства
Вакцины производимые в России
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
39 |
Аутовакцины – это вакцины, приготовленные из м/о, выделенных из организма больного человека и используемые для лечения данного пациента (Антиген выделяется из макроорганизма и вводится в тот же самый макроорганизм по нарастающей в титровых соотношениях).
(чаще при хронических вялотекущих процессов, затяжных инфекций (ослаблен естественный иммунитет) с целью активации вторичного иммунного ответа).
ПРИМЕР: гонококковая вакцина (для ЛЕЧЕНИЯ хронической гонореи). Вводится в уретру и подкожно по нарастающей в титровых соотношениях для активации реакции вторичного иммунного ответа. Хорошо выражен терапевтический эффект (комплексно с антибактериальными препаратами).
Аутовакцины – это редкий пример использования вакцинных препаратов не с целью профилактики, а с целью ЛЕЧЕНИЯ инфекционных заболеваний.
Национальный календарь профилактических прививок РФ
БЦЖ – 3 сутки после рождения (туберкулез)
Повторное введение АКДС (ревакцинация) – в 17 лет, в 27, 37, 47 и тд лет – введение поддерживающих препаратов (это уже не АКДС, а АДС(М) – вакцинный препарат, содержащий ослабленное уменьшенное кол-во дифтерийного и столбнячного анатоксинов). Поддерживающие вакцины необходимы для стойкого иммунитета.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
40 |
Инфекционные - появляются во время инфекционного заболевания. Количество их нарастает по мере развития заболевания.
Цель серодиагностики: Обнаружение инфекционных антител в сыворотке.
Образование АТ происходит в две фазы:
Индуктивная фаза - наступает сразу после введения АГ и продолжается 3-7 дней. Во время этой фазы выявить АТ в сыворотке НЕ возможно.
Продуктивная фаза - наступает спустя 3-7 дней после введения АГ и продолжается достаточно длительный промежуток времени. АТ в этой фазе МОЖНО выявить с помощью реакций иммунитета.
Рост количества АТ в сыворотке определяется титром АТ - это наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживаются АТ. Т.к. титр инфекционных АТ постепенно нарастает в ходе развития заболевания, то для оценки динамики инфекционного процесса используются метод парных сывороток - сыворотки одного и того же больного, взятые в разные сроки болезни:
1-ый забор сыворотки осуществляется на 5-8 день от начала заболевания 2-ой забор сыворотки на 10-16-й день (в этот срок количество инфекционных АТ в
сыворотке максимально). Таким образом, инфекционные АТ можно отличить от остальных видов АТ по нарастанию их в количестве в сыворотке с 5 по 16 день заболевания.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301