2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология 3
.pdf
Оглавление - нажми и вернешься |
21 |
-Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против дифтерийного токсина)
(птичка)
-Исследуемая сыворотка (?)
Проходит в 3 этапа:
1.На 1 этапе готовится классический эритроцитарный антигенный диагностикум, то есть на
поверхности эритроцитов сорбируются известные антигены.
2.На 2 этапе экзотоксин микроорганизма взаимодействует с антитоксической сывороткой.
Если есть комплементарность, происходит образование комплекса антиген-антитело. Сыворотка нейтрализует действие токсина и целиком расходуется на нейтрализацию
токсического фактора. Свободной сыворотки не остается.
3.На 3 этапе два компонента взаимодействуют между собой – эритроцитарный антигенный
диагностикум и смесь, образовавшаяся на втором этапе.
Для того чтобы образовался комплекс, требуются свободные антитела сыворотки. В этой
реакции их не остается, так как они израсходовались на нейтрализацию токсического фактора,
следовательно, образования комплекса не происходит. Тогда происходит выпадение
эритроцитов в осадок – как видимое проявление образуется «пуговка» – положительный результат.
Фазы при положительном результате:
.
Фазы при отрицательном результате:
на втором этапе экзотоксин НЕ комплиментарен антитоксической сыворотке
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
22 |
Виды антител:
1.Изоантитела – антитела к изоантигенам. Например, антитела к изоантигенам эритроцитов человека (ABo).
2.Нормальные (естественные) – антитела, обнаруживаемые в сыворотке крови без предварительного воздействия антигена. Способны инактивировать большинство антигенов первично попадающих в наш организм.
Естественные антитела – это любые АТ, содержащиеся в сыворотке практически здорового неиммунизированного человека.
Предполагаемые функции:
●Транспортная функция: удаление стареющих клеток и продуктов их распада.
●Регуляция иммунного ответа.
●Первичное распознавание антигенов.
●Патогенетическая в развитии аутоиммунных заболеваний.
3.Аутоантитела – антитела к молекулам веществ, входящих в состав собственных клеток и тканей организма.
4.Гетероантитела – антитела, образующиеся в ответ на введение гетероантигена.
5.Моноклональные– антитела одной специфичности, синтезируемые искусственно полученным клоном плазмоцитов.
Метод получения моноклональных антител состоит в слиянии сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы для получения клеточных гибридов (гибридом). Гибридомы обладают способностью синтезировать антитела определенной специфичности, но по сути представляют собой опухолевые клетки, способные к непрерывной пролиферации.
Получение гибридом включает этапы:
1.Получение миеломной линии.
2.Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма (плазмоциты, синтезирующие Ig определенной специфичности).
3.Создание в культуре определенных условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли слиться.
4.Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.
5.Отбор интересующего клона, его накопление. Накопление клона осуществляют in vitro или путем введения животным.
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
23 |
6. Введение лабораторным животным, у него вырабатываются необходимые нам антитела.
Использование моноклональные антител:
1.В научных целях для анализа структуры, генетики Ig, для изучения рецепторов лимфоцитов и их субпопуляций.
2.В диагностике и лечении онкологических, инфекционных заболеваний, коронавирусной инфекции в т.ч.
При коронавирусе - применяют препарат Тоцилизумаб у крайне тяжелых пациентов.
Подавляет активность интерлейкинов, вызывающих цитокиновый шторм.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ИММУННОГО ОТВЕТА
Специфичность – реактивность направлена только на определенный АГ.
Потенцирование – способностью производить усиленный ответ при постоянном поступлении в организм одного и того же антигена.
Иммунологической памятью – способностью распознавать и производить усиленный ответ против того же АГ при повторном его попадании в организм, даже если первое и последующие попадания происходят через большие промежутки времени.
Первичный иммунный ответ
- развивается медленно, слабо выражен и сохраняется короткий период времени, сначала продуцируется lgM, и лишь заметно позже lgG.
Название периода |
Продолжитель |
Краткая характеристика |
|
|
|
ность |
|
|
|
|
|
1. |
Латентный |
3-5 дней |
Скрытые процессы восприятия антигенного |
|
|
|
раздражения, завершающиеся поступлением в |
|
|
|
кровь lgM |
|
|
|
|
2. |
Логарифмический |
7-15 дней |
Концентрация антител в сыворотке крови резко |
(продуктивный) |
|
возрастает - титры lgM и G достигают |
|
|
|
|
максимума |
|
|
|
|
3. |
Стационарный |
15-30 дней |
Поддерживается максимальный стабильный |
(максимума и |
|
уровень lgM и G в крови |
|
стабилизации) |
|
|
|
|
|
|
|
4. |
Снижения |
14 и более |
Концентрация антител в крови постепенно |
|
|
дней |
снижается |
|
|
|
|
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
24 |
Вторичный иммунный ответ
- развивается быстро, выражен значительно и сохраняется продолжительный период времени. Подъем lgM практически незаметен, в основном синтезируются антитела класса lgG.
На этом основана двухэтапная вакцинация от коронавируса.
Особенности вторичного иммунного ответа:
1.Укороченный латентный период (от нескольких часов до 1-2 дней).
2.Синтезируются сразу lgG.
3.Более быстрый подъем концентрации антител.
4.Большие значения максимальной концентрации антител.
5.Высокая скорость образования антител.
6.Индукция меньшими дозами антигенов.
Сыворотки
(препараты АТ)
- диагностические
Содержат в себе заведомо известные антитела, значит их используют для поиска неизвестных АГ (СЕРОИДЕНТИФИКАЦИИ).
Получают путем многократной иммунизации лабораторных животных (кроликов) антигенами (м/о, токсинами, анатоксинами).
Классификация:
Агглютинирующие (РА, РНГА)
1.Адсорбированные
-поливалентные
-монорецепторные
Получение адсорбированных сывороток
Метод Кастеллани - способ удаления нежелательных (чаще групповых) АТ из нативных иммунных сывороток, основанный на их адсорбции (истощении) избытком соответствующего корпускулярного АГ.
Берется сыворотка со смесью АТ лабораторного животного, чтобы выделить антитела например со специфичностью 2. Мы добавляем в сыворотку АГ1, АГ2, АГ3. Инкубируем при стандартной температуре 37. Проводим центрифугирование. Образуется несколько
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
25 |
специфичных комплексов АГ-АТ. В осадке оказываются эти комплексы, а в надосадочной жидкости остаются АТ2. Это будет адсорбированная монорецепторная сыворотка (а если два вида антител, то поливалентная). Можем определить серогруппу возбудителя,
азатем и серовара.
2.Неадсорбированные
Преципитирующие (кольцепрецип, иммуноэлектрофорез)
Нейтрализующие (PH)
Лизирующие (РСК)
Флуоресцентные (РИФ)
Меченные ферментами (ИФА)
- лечебно-профилактические
Используются с целью лечения и профилактики заболеваний.
Классификация:
1.Гетерологичные - получают из организма животных. - содержат белки, чужеродные для человека
2.Гомологичные - получают от человека (от того же самого биологического вида)
Речь идет об искусственном пассивном иммунитете (тк в организм вводятся готовые антитела). Предпочтительнее вводить донорскую сыворотку, а не от животных, так как после введения донорской сыворотки иммунитет продолжается дольше, и меньше вероятность аллергических реакций (крапивницы, отека Квинке, сывороточной болезни, анафилактического шока и тд.)
Классификация лечебно-профилактических сывороток и примеры
1.Антибактериальные (практически не используются из-за наличия эффективных противобактериальных препаратов - бактериофагов)
2.Противовирусные (не действуют на вирусы, находящиеся внутриклеточно): противогриппозная сыворотка
3.Антитоксические (применяются широко, поскольку против бактериальных экзотоксинов не существует других более эффективных средств): противоботулинические (типа A, B и E). противостолбнячная, противостафилококковая, противогангренозная поливалентная и т.д.
Источники лечебно-профилактических сывороток
Для гетерологичных сывороток: многократная интенсивная иммунизация крупных животных (лошадей, коз, волов) соответствующими антигенами (бактериями, вирусами или анатоксинами)
Для гомологичных сывороток:
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
26 |
1.от переболевших лиц (реконвалесцентов)
2.от иммунизированных вакцинами доноров
3.из плацентарной крови (сейчас практически не применяется из-за возможности вирусоносительства некоторых опасных возбудителей)
Метод введения гетерологичных сывороток Дробное введение по методу Безредка
1 введение – подкожно 0,1 мл разведенной в 100 раз сыворотки 2 введение – через 20 мин п/к 0,1 мл неразведенной сыворотки 3 введение – через 30-60 мин – в/м полная доза
Получение и очистка антитоксических гетерологических сывороток
Лошадей подвергают гипериммунизации соответствующим анатоксином
Полученную сыворотку подвергают концентрации и очистке методом «Диаферм»:
1.высаливание альбумина сернокислым аммонием
2.ферментативное расщепление неиммунных глобулинов
3.диализ
Полученную сыворотку титруют с помощью реакции флоккуляции для определения ее антитоксический активности, измеряемой в международных единицах (МЕ).
Лечебно-профилактические иммуноглобулины
●Это более очищенные, активные и специфичные препараты, чем сыворотки
-очень дорого
●Их получают из пула человеческих сывороток (при смешивании сывороток от 1000-3000 лиц) при низкотемпературном фракционировании этанолом (метод спирто-водного осаждение на холоде)
Традиционный препараты иммуноглобулинов вводят внутримышечно или подкожно, тогда как препараты сывороток – внутривенно.
Ускоренные методы диагностики с использованием меченых АТ или АГ.
Отличительная черта этих методик:
●возможность получения более быстрого результата (несколько минут).
●универсальность (серодиагностика+сероидентификация)
●высокая чувствительность и специфичность
-РИФ (МИФ) – реакция иммунофлюоресценции/метод иммунофлюоресценции
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
27 |
-ИФА – иммуноферментный анализ, большинство иммунных диагностик (больше 70%) в лабораторной практике связано именно с ИФА
-РИА – радиоизотопный метод/радиоиммунное исследование. Используется в клинической практике не очень обширно, так как для РИА нужны радиоизотопные метки, специфическое оборудование, лаборатории с определенной техникой безопасности (обычные клинические при лечебных учреждениях не катят). Используется в научных исследованиях при научных институтах и лабораториях -
-Иммуноблотинг – самая специфичная и самая чувствительная из методик. Сложная, дорогая, используется не широко, хоть и активно. Для диагностики заболеваний, где есть возможность изменения структуры генома микроорганизма (мутации, например, ВИЧ, любое структурное изменение генома).
1)РИФ (МИФ) - реакция/метод иммунофлюоресценции
-основана на использовании сывороток, меченных специальными флюорохромными
красителями.
Фактически здесь комбинированы 2 метода исследования: микроскопия (бактериоскопия) + серологический метод (с целью серодиагностики/идентификации).
Результат оценивается в люминесцентном микроскопе (морфологическую структуру, расположение).
Люминесцирующие сыворотки готовят из иммунных диагностических (которые обычно получают из организмов кроликов). Диагностическую сыворотку метят специальным флюрохромным красителем - флуоресцеин -изотиоцианат.
Эти сыворотки наносят на предметное стекло на оцениваемые антигены.
положительный результат: Если АГ комплементарен АТ, то образуется комплекс АГ-АТ, в УФ-свете появляется зеленоватое свечение.
2 метода постановки:
Прямой метод РИФ - компоненты: флуоресцентные АТ+ исследуемые АГ
Этапы с целью сероидентификации:
1)Исследуемый биоматериал, доставленный в лабораторию, наносится на предметное стекло
2)К нему добавляется диагностическая сыворотка, содержащая антитела, меченные флюорохромным красителем. Например, если у пациента предполагается сальмонеллез, то для этого используется сальмонеллезная диагностическая сыворотка.
3)Затем после нанесения оценивается результат в УФ-свете.
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
28 |
положительный результат: Если АГ комплементарен АТ, то образуется комплекс АГ-АТ, в УФ-свете появляется зеленоватое свечение. (+возможна оценка морфологии - если сальмонеллез, то увидим палочки).
отрицательный результат: АГ не комплементарен АТ, комплекса нет, зеленоватого свечения нет.
Достоинство – быстрота, выполняется в течение пары минут.
Недостаток: к каждому возбудителю отдельная сыворотка. Многие возбудители в организме человека дают максимально схожие клинические проявления. Поэтому до постановки РИФ мы можем точно не знать на какого возбудителя делать тест.
Приходится делать набор сывороток. А это достаточно дорогостояще, т.к. каждая из сывороток должна быть помечена флюорохромным красителем
Непрямой метод РИФ
-универсальная антиглобулиновая (против глобулина) флюоресцирующая сыворотка к иммуноглобулинам
-АТ
-исследуемые АГ
Цель - сероидентификация
+- : Более сложен по технике исполнения, но отличается еще более высокой специфичностью и не требует набора флюоресцирующих сывороток из-за универсальности. Более длительно делается, но проще по получению результата.
Важные ЭТАПЫ при сероидентификации:
1)материал наносится на предметное стекло
2)наносится специфическая иммунная кроличья сыворотка, меченная флюорохромным красителем. (это сложный препарат, одновременно и АГ-препарат и АТ-препарат, тк содержит сразу 2 компонента - специфические АТ, АГ - кроличьи глобулины.
Если АГ комплементарен АТ (если сыворотка диспетчера содержит специфические АТ к искомому АГ) происходит обр-е комплекса АГ-АТ.
3)Затем антитела, не связавшиеся с антигенами микробов отмывают (тк комплекс ничего не тронет, он не смоется)
4)Выявляют антитела, которые остались на микробах, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой (АГС содержит в себе антитела к кроличьим глобулинам), меченной флюорохромами.
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
29 |
положительный результат: В результате образуется второй комплекс АГ-АТ (микроб + антимикробные кроличьи антитела + противокроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс, аналогично первому, наблюдают в люминесцентном микроскопе. Зеленый свет.
отрицательный результат: АГ не комплементарен АТ (сыворотка не содержит АТ к искомому АГ), комплекса нет, зеленоватого свечения нет.
2) РИА - радиоиммунный (радиоизотопный анализ)
Метод РИА очень похож на реакцию флуоресценции, но его отличие состоит в том, что вместо флуорохромных сывороток, используются сыворотки, меченные радиоизотопами.
Эту методику можно поставить, как прямым, так и не прямым методом, аналогично с методикой РИФ.
Также нужна специальная лаборатория.
Также Специфичный и высокочувствительный метод.
Применяется в науке, в медицине практически не применяется
3)ИФА - реакция иммуноферментного анализа
-самый распространенный метод в клинической практике.
-для серодиагностики и сероидентификации.
Метод основан на использовании антител с использованием фермента в качестве метки.
С помощью ИФА определяют наличие антигенов возбудителей различных инфекций, но значительно чаще метод применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG к антигенам различных возбудителей болезней.
Коронавирусную инфекцию выявляют именно этим методом, с целью выявления соответствующих иммуноглобулинов.
Содержание набора для метода:
●Стрипированный микропланшет
●Промывающий раствор
●Буфер для разведения конъюгата
●Хромогенное вещество - аминосалициловая кислота (при её окислении образуется специфическое коричневое окрашивание – появление этого окрашивания является положительным «+» результатом реакции)
●Субстрат H2O2 (перекись водорода)
●Конъюгата – фермент (пероксидаза хрена), который расщепляет перекись водорода
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
30 |
● Положительный и отрицательный контроли
ИФА можно поставить 3 методиками:
1. Прямой метод ИФА
-похож на метод РИФ, только используются не хромофорные сыворотки, а сыворотки, меченные ферментами.
-цель: серодиагностика или сероидентификация
ЭТАПЫ (сероидентификация)
1)К исследуемому биоматериалу (мы ищем неизвестные антигены) + добавляется диагностическая сыворотка, меченная ферментом (конъюгатой) => и в той ситуации, когда антиген и антитело комплементарны, идёт образование сложного комплекса антигенантитело конъюгата.
2)После этого лунка планшета промывается водой. И в той ситуации, если произошло образование этого специфического комплекса (антиген-антитело конъюгата) компоненты реакции с поверхности лунки уже не вымываются, т.е. комплекс остается активным.
3)Далее к комплексу добавляется субстрат – перекись водорода и хромогенное вещество. Поскольку конъюгата (фермент пероксидаза) не вымылась, пероксидаза воздействует на субстрат (перекись водорода – нестойкое соединение) и происходит распад на 2 вещества: воду и активный кислород. Появление активного кислорода обуславливает окисление аминосалициловой кислоты – появляется характерное
коричневое окрашивание. «+»
(Отрицательный результат “–”)
Если диагностическая сыворотка не содержит специфических антител, после промывания лунки водой происходит вымывание не связавшихся компонентов.
Затем добавляется субстрат (перекись водорода) и хромогенное вещество, т.к. конъюгаты нет, она вымылась, то ничего уже не воздействует на перекись водорода и не происходит окисление аминосалициловой кислоты. Лунка остается бесцветной.
Недостаток метода: необходимость иметь множество конъюгатов с сыворотками различной специфичности.
А вот непрямой метод ИФА этого недостатка лишён.
2. Непрямой метод ИФА
Определение антигена в сыворотке больного с адсорбированными диагностическими антителами.
Используется диагностическая сыворотка изначально меченная ферментом, благодаря этому можно получить положительный результат менее затратно.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301