2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология 3

Преципитат образуется при смешивании АГ и АТ в эквивалентных количествах (когда все Ат

и Аг связаны в комплексы),

избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Разновидности преципитации:

Кольцепреципитация:

Цель: сероидентификация (поиск неизвестного антигена).

Как делают: ставят в узких преципитационных пробиках. С помощью тонкой пипетки на дно пробирки помещают диагностическую иммунную сыворотку с заведомо известными антителами. Сверху наслаивают растворимый антиген.

Результат: При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципитации вследствие постепенной диффузии реагентов к границе жидкости

В геле по методике Оухтерлони:

Как делают: Растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2–3 мм.

В центральную лунку помещают неизвестные антигены, а в периферические - иммунные сыворотки (с известными антителами с различной специфичностью).

Чашка помещается в термостат. Содержимые лунок диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.

Результат: У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных — пересекаются.

Иммуноэлектрофорез

— сочетание метода электрофореза и иммунодиффузии.

Когда делать: Необходимость возникает при инфекциях, при которых изменяется структура антигена (ВИЧ, грипп).

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

Как делают: Берется исследуемая антигенная структура, помещается на специальную полоску агара и накладывается 2 электрона - анод и катод. Происходит распределение антигенной структуры по электрофоретической подвижности. То есть сложная антигенная структура распадается на простые антигенные элементы. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируют в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации

Реакции иммунного лизиса

Антиген: м/о или эритроцит !!!!!

Если АГ - бактерия, то реакция - бактериолиз. Если АГ - эритроцит, то реакция - гемолиз.

Механизм лизиса: активация компонентов комплемента СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА – важная эволюционная составляющая у млекопитающих, у

человека в том числе. Другое название - альфа-лизины (Присутствует в периферической крови, в секретах слизистых оболочек).

-Является частью иммунной системы, она осуществляет неспецифическую защиту от бактерий и других проникающих в организм возбудителей болезней.

Компоненты комплемента:

С1-С9, в норме неактивны, чтобы начали работу необходима протеолитическая каскадная активация и сборка в единое целое.

-синтезируются в печени и фагоцитирующими клетками.

-синтез начинается на 3-5 день жизни, а на 7 день - уровень как у взрослых.

3 пути активации комплемента:

Классический

первично-инициирующий фактор для сборки компонентов комплемента - появление комплекса антиген-антитело (к структуре иммуноглобулина как ключ-замок присоединяется антиГЕН). Как только образовался комплекс, под действием фермента С1-эстераза происходит фиксация компонента С1, затем С4, С2. Собрался этот первичный комплекс и активируется фермент С3-конвертаза, который обуславливает

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

распад компонента С3 на С3а и С3б. Это важно, т.к. каждый из этих субкомпонентов принимает участие в нейтрализации чужеродного фактора. Основная роль у С3б, так как он фиксирует С5, к которому присоединяется мембраноатакующий комплекс (компоненты С6-С9). Мембраноатакующий комплекс воздействует на оболочку/клеточную стенку/суперкапсидную оболочку чужеродного агента, нарушает проницаемость этой клеточной оболочки и происходит нейтрализация чужеродного вещества (антигена) - литическая реакция.

Реакция бактериолиза

- растворение бактерий в присутствии специфических антител - бактериолизинов и комплемента

Реакция бактериолиза может протекать:

in vitro - лабораторные условия in vivo - в живом организме

Бактериолиз in vivo:

1.моделирование инфекционного процесса в организме лабораторного животного

2.защитная реакция врожденного иммунитета в макроорганизме при бактериальных инфекциях.

Можно сказать, что бактериолиз - одна из составляющих видового иммунитета, который обусловлен активацией комплемента в ответ на попадание в макроорганизм чужеродных веществ. Часто протекает в нашем организме при активности каких-либо м/о, представляющих угрозу.

Бактериолиз in vitro:

Опыт: берется суспензия бактерий (АГ), суспензия по 1 мл добавляется в 2 параллельные пробирки. В первую пробирку добавляют нативную сыворотку (содержит только комплемент в неактивном состоянии), а во вторую пробирку добавляют иммунную сыворотку (содержит антитела и комплемент).

Получается, в первой пробирке образуется много колоний, а во второй происходит бактериолиз и образуется мало колоний (образование комплекса АГ-АТ-К).

Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, набухают, распадаются и, наконец, совсем растворяются.

Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (реакция иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) при сифилисе (реакция

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

иммобилизации бледной трепонемы), определения вибриолизинов в сыворотке; , при лептоспирозе (реакция агглютинации-лизиса).

*Иммобилизация - потеря подвижности в результате бактериолиза.

Реакции гемолиза in vitro

АГ (эритроциты барана 3-5% взвесь, дают самую выраженную литическую реакцию) + литическая сыворотка (АТ) + Комплемент = гемолиз, лаковая кровь (образование комплекса АГ-АТ-К).

Гемолиз - разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму.

Виды гемолиза:

физический (термический, механический, осмотический, химический);

биологический (результат гемолиза - “лаковая кровь”)

Применяется с целью постановки реакции с комплементом (гемолиз происходит только в присутствии антигенов, специфичных им антител и комплемента).

Ингредиенты реакции: изотонический раствор NaCl, гемолизин, 3% взвесь эритроцитов барана и 3% взвесь чужеродных эритроцитов, комплемент.

Если отсутствует хотя бы один из ингредиентов, то гемолиз задерживается.

Цель постановки реакции иммунного гемолиза - индикаторная реакция в реакции связывания комплемента - РСК (уникальный случай: ставится не с целью серодиагностики или сероидентификации).

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

РСК

- реакция связывания комплемента

Есть 2 системы АГ-АТ (основная и индикаторная)

1.Диагностикум (всегда содержит заведомо известные антигены) + исследуемая сыворотка (тестируем ее на наличие в ней специфических антител) + комплемент.

2.Реакция индикаторной системы — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы.

Именно реакция иммунного гемолиза

РЕЗУЛЬТАТЫ:::

Положительный результат:

В 1 реакции происходит образование комплекса АГ-АТ-К, и тогда во 2-й реакции гемолиз не произойдет, т.к. весь комплемент израсходован в 1 реакции.

Поэтому в индикаторной реакции будет наблюдаться выпадение эритроцитов в осадок, т.е. - задержка гемолиза.

(результат реакции) - говорит о том, что исследуемая сыворотка имеет специфические антитела.

Отрицательный результат:

Если происходит так, что исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, то образование комплекса АГ-АТ-К в основной системе не возможно, комплемент остается в неактивной состоянии, поэтому при добавлении индикаторной системы (которая изначально содержит два взаимно комплементарных компонента) происходит образование комплекса АГ-АТ-К. В индикаторной системе - видимое изменение - “лаковая кровь”).

РСК ставится с целью серодиагностики (определить специфические антитела и посмотреть их титр). Титр сыворотки - максимальное разведение, где еще наблюдают задержку гемолизу.

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

Реакция Вассермана

-качественная реакция в основе которой лежит РСК

-диагностика сифилитической инфекции

-Оценивается системой крестов

4 креста по Вассерману – безусловно положительный результат (пациент болен сифилитической инфекцией), полная задержка гемолиза От 3 до 1 креста – есть осадок на дне пробирке, разное прокрашивание надосадочной жидкости, в зависимости от того, насколько выражено произошел гемолиз Нет крестов – лаковая кровь, полный лизис эритроцитов (пациент здоров)

МИНУСЫ - особенности системы комплемента:

●Комплемент очень чувствителен к внешним факторам: очень лабилен (разрушается от различных химических и физических факторов: встряхивания, действие температуры до +56, действие кислот, щелочей, алкоголя)

●В лабораторных условиях используют сыворотку крови морских свинок

●Перед постановкой реакции РСК необходимо оттитровать рабочую дозу комплемента.

Рабочая доза подбирается в опыте титрования комплемента - это подготовительный этап РСК, с этим этапом наибольшее кол-во проблем (очень трудоемкий), поэтому от РСК постепенно начинают отходить. В настоящее время есть уже более чувствительные методики: ИФА, методика, связанная с иммуноблокингом).

Реакция нейтрализации (РН)

Антиген взаимодействует с антителом. Если комплиментарно, то антиген нейтрализуется.

Экзотоксины (белковые элементы) – вещества, которые способны синтезировать микробная клетка, выделяются в окружающую среду (обеспечивают токсичность -

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

влияние на макроорганизм, специфичность - проявление определенной клинической симптоматики, термолабильность - повышение температуры тела не всегда блокирует действие токсинов, иммуногенность – образуют анатоксины).

Анатоксин - инактивированный токсин, который утратил свои токсические свойства, но сохранил свои антигенные свойства. Когда они попадают в организм начинается массивная выработка антител. На этом построена вакцинация анотоксинами, которая предотвращает экзотоксическую инфекцию в нашем организме.

Тут клиническая картина связана не с присутствием микроорганизма в макроорганизме, а именно с наличием экзотоксинов, которые вырабатывают м/о (заболевания: газовая гангрена, ботулизм, столбняк, дифтерия, стафилококковая пищевая интоксикация)

Разновидности: in vivo, in vitro

Реакция нейтрализации токсина антитоксином In vivo на лабораторных животных (дальше опять картиночки, там все круто)

1. Если антиген комплементарен антителу, то происходит реакция нейтрализации - животное живет :)

происходит гибель животных :(

Реакция нейтрализации в условиях in vivo - удобно подбирать специфическую антитоксическую сыворотку.

К примеру, ботулиническая и столбнячная инфекции - экзотоксин имеет разную антигенную природу. Поэтому на первом этапе исследования вводятся поливалентные сыворотки, а дальше уже монорецепторные сыворотки (которые комплементарны действию того токсина, который вызвал патологическое состояние).

Чтобы подобрать специфическую сыворотку, в организм лабораторного животного вводят сразу несколько комплексов, и если животное выживает, то можно говорить о том, что конкретно эта сыворотка нейтрализовала экзотоксин. Это будет реакция нейтрализации экзотоксина АНТИтоксином.

Поэтому в организм человека с этим заболеванием введут точно такую же сыворотку.

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301

РН в организме человека - кожные пробы, ставят с целью выявления наличия и напряженности антитоксического иммунитета:

●Проба Шика (проверяется наличие антитоксического противодифтерийного иммунитета).

●Проба Дика (проверяется наличие антитоксического антискарлатинозного иммунитета).

Как проводят эти пробы: Внутрикожно вводят минимальное кол-во токсина. Если иммунитет есть, то антитела нейтрализуют и в месте введения ничего нет. Если же иммунитета нет, то в месте введения образуется папула (гиперергическая реакция, кожа краснеет, появляется жжение).

In vitro

Реакции на основе механизма преципитации: реакция флоккуляции, реакция нейтрализации в геле по Оухтерлони.

для того, чтобы прошла преципитация необходимы три условия: растворимый антиген, эквивалентность АГ и АТ (равные соотношения), физиологический раствор.

Если АГ комплементарен АТ, то происходит образование комплекса АГ-АТ (выпадает мелкодисперсный осадок - преципитат)

Флокуляция

- разновидность преципитации (основное отличие, что в реакции в роли растворимого АГ может выступать и экзотоксин, а в роли антитела антитоксическая сыворотка, разведенная в физиологическом растворе).

Пример: фолоккуляция происходит в одной из пяти пробирок. Тк в ней соблюдено главное условие - эквивалентность антигенных детерминант и активных центром иммуноглобулинов.

Значение: позволяет рассчитать количество единиц флоккуляции и на этом основании определиться с количеством антигена и антител.

Реакция флоккуляции используется НЕ с целью серодиагностики и сероидентификации, а с целью расчета силы действия анатоксина (Ме- международные единицы действия

соответствующего препарата) и силы действия антитоксической сыворотки (Лф - лечебная форма).

Реакция нейтрализации в геле по методу Оухтерлони

- тоже разновидность преципитации.

На центр агара накладывается фильтровальная бумага, пропитанная антитоксической сывороткой, разведенной в физрастворе, а по бокам от фильтровальной бумаги засеиваются исследуемые штаммы микроорганизмов.

В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301