6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / МЕХАНИЗМЫ_ВЛИЯНИЯ_ИНДУЦИРУЕМОЙ_АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗОЙ_ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ

31

1.3Терапия болезни Альцгеймера

Несмотря на проведенные многочисленные клинические испытания множества перспективных препаратов, и методов лечения БА (Schneider et al., 2014; Cummings et al., 2014), только три ингибитора холинэстеразы и блокатор НМДА рецепторов мемантин показали достаточную безопасность и эффективность для терапии БА. Эти препараты обладают, в основном,

холиномиметическим действием, улучшая при этом когнитивные способности

(Ott A et al., 1995).

За последнее десятилетие направление разработки препаратов сдвинулось в сторону поиска лекарств, модифицирующих заболевание. Целью такого лечения является воздействие на основные патологические процессы БА. Однако следует отметить, что пока ни один из кандидатов не прошел клинические испытания,

поскольку не продемонстрировал разницу с плацебо в ходе третей фазы клинических испытаний (Siemers et al., 2015).

Сегодня ведется разработка следующих групп препаратов:

1.Оказывающих холиномиметическое действие;

2.Действующих на формирование и отложение β-амилоида;

3.Предотвращающих нейротоксическое действие β-амилоида;

4.Действующих на формирование нейрофибриллярных переплетений;

5.Оказывающих противовоспалительное и иммуномодулирующее действие.

1.3.1 Применение ингибиторов холинэстераз

Холиномиметические препараты являются наиболее обширной группой препаратов, используемых для лечения пациентов с БА на легкой и умеренной стадиях. На сегодняшний день, холиномиметические препараты применяются в качестве общепринятых для терапии болезни. В рамках холинергической гипотезы, эффект этой группы достигается посредством увеличения уровня АХ

t.me/medicina_free

32

(обычно ингибированием АХЭ), за счет чего потенцируется активация холинергических рецепторов. К сожалению, эффективность препаратов снижается по мере развития болезни (Selkoe, 2002).

Первыми одобренными для лечения БА были ингибиторы холинэстераз физиостигмин и такрин (препараты первого поколения). Они обладали множеством побочных эффектов, что ограничивало их применение. Кроме того,

выраженным действием они не обладали, улучшая когнитивные функции пациентов лишь до 30%.

Изменение направления разработки препаратов в сторону увеличения их селективности к АХЭ, с целью улучшить переносимость, привело к появлению ингибиторов холинэстераз второго поколения. К сожалению, существеннного снижения побочных эффектов не произошло. На сегодняшний день Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрены три ингибитора АХЭ для лечения болезни Альцгеймера: ривастигмин,

галантамин (для лечения легкой и умеренной стадий болезни) и донепезил (для лечения болезни на всех стадиях) (Doody et al., 2013).

Ингибиторы холинэстераз, помимо холиномиметического действия, так же оказались способными влиять на патогенез БА, влияя на процессы амилоидоза.

Так, ингибирование АХЭ сопровождается активацией мускариновых рецепторов,

которые регулируют синтез БПА (Nitsch et al., 1992). Кроме того, АХЭ участвует в процессах перехода β-амилоида в агрегированную форму (Munoz and Inestrosa,

1999), а ингибиторы холинэстераз, в свою очередь, показали способность снижать скорость агрегации амилоида. Следовательно, существует вероятность, что такие препараты могут обладать нейропротекторным действием и замедлять развитие БА (Inestrosa et al., 1996).

Влияние ингибиторов АХЭ на уровень растворимого αБПА существенно отличается у разных типов клеток и зависит от препарата, продолжительности лечения и тестируемой дозы. Так, физиостигмин увеличил секрецию растворимого αБПА на срезах коры головного мозга крыс (Mori et al., 1995), но снизил секрецию растворимого БПА без влияния на уровень β-амилоида в клетках

t.me/medicina_free

33

SK-N-SH нейробластомы (Lahiri et al., 2000). Такрин ослабляет секрецию растворимого αБПА в глиальных клетках и клетках нейробластомы.

Дифференцированное влияние ингибиторов АХЭ на образование БПА, по-

видимому, не имеет отношения к селективности холинестеразы, но может зависеть от других механизмов, таких как влияние на синтез БПА, экспрессию,

или регуляцию ферментов, участвующих в образовании БПА (Lahiri et al., 2000; Shaw et al., 2001).

Что касается донепезила гидрохлорида, то его хроническое введение при высоких дозах (4 мг/кг) снизило количество как растворимого, так и нерастворимого β-амилоида в головном мозге и предотвратило потерю синапсов в молекулярном слое зубчатой извилины трансгенных мышей линии Tg2576.

Однако на количество синаптофизина в головном мозге введение препарата влияния не оказало (Dong et al., 2009).

1.3.2 Блокаторы ПАС АХЭ и другие препараты, действующие на формирование и отложение ß-амилоидного пептида

Учитывая роль амилоидной гипотезы, особое внимание направлено на разработку препаратов, влияющих на сокращение образования патологического β-

амилоида.

В частности, было показано что переход β-амилоидного пептида в олигомеризованную форму происходит в том числе за счет его взаимодействия с ПАС АХЭ. При этом образующийся комплекс фермента с Аβ1-40 так же отличается повышенной нейротоксичностью (Munoz and Inestrosa, 1999).

Первым исследованным блокатором ПАС АХЭ стал донепезила гидробромид. Поскольку после публикации данных рентгеноструктурого анализа со-кристалла АХЭ-донепезил стало очевидно, что донепезил частично окупирует ПАС. Донепезил так же продемонстрировал способность ингибировать на 22%

t.me/medicina_free

34

агрегацию Аβ1-40, индуцируемую АХЭ человека в условиях in vitro (Bartolini et al., 2003).

Один из первых примеров успешно синтезироанного ингибитора АХЭ,

наделенного дополнительными фармакологическими эффектами – разработка препарата Капроктамин. Препарат обладал афинностью как для каталитического сайта, так и для ПАС АХЭ, а так же для мускариновых рецепторов типа M2.

После появления Капроктамина, было разработано множество других блокаторов ПАС АХЭ, основная проблема которых заключалась в неспособности преодолевать гемато-энцефаллический барьер (Cavalli et al., 2008).

Ведется разработка и препаратов, блокирующих β и γ секретазы, которые задействованы в формировании β-амилоида. Так, уже было проведено несколько безуспешных клинических исследований фармакологических препаратов,

направленных на модификацию амилоидного каскада. Эти препараты воздействовали непосредственно на β-амилоид и на β, либо γ секретазы,

участвующих в расщеплении БПА (Ghezzi et al., 2013). Однако, клинические исследования ингибиторов γ-секретазы таренфлурбила и семагацестата были прекращены из-за отсутствия улучшения когнитивных функций по сравнению с плацебо (Doody et al., 2013; Green et al., 2009).

Показано, что использование антител к β-амилоиду может снизить количество эндогенного β-амилоида, что предотвращает образование амилоидных бляшек и снижает количество уже сформировавшихся отложений (Schenk et al.,

1999). Однако, клинические испытания моноклонального антитела к β-амилоиду бапинейзумаба хоть и показали снижение скорости накопления амилоида у носителей гена ApoЕ4, но не продемонстрировали никакого положительного влияния на когнитивные функции. Другое монокланальное антитело соланезумаб показало лишь незначительное улучшение когнитивных способностей по сравнению с плацебо. Ожидается третья фаза клинических исследование адуканумаба, еще одного антитела к β-амилоиду, показавшего дозозависимое снижение β-амилоида в головном мозге (Briggs et al., 2016).

t.me/medicina_free

35

Что касается других препаратов, препятствующих образованию β-

амилоидных отложений, возможно использование глюкозоаминогликанов,

способных блокировать образование β-амилоида и разрушать амилоидные отложения (Howlett et al., 1999).

1.3.3 Блокаторы НМДА рецепторов

Известно, что процесс обучения, включает необходимый этап формирования долговременной потенциации, опосредуемой, в том числе,

активацией глутаматом НМДА-рецепторов. Однако повышение уровня глутамата также связано с так называемой эксайтотоксичностью и гибелью нейронов. На сегодняшний день в клинике используется только один блокатор НМДА рецепторов – мемантин. Мемантин представляет собой неконкурентный антагонист НМДА рецепторов. Предполагается, что он уменьшает индуцированную глутаматом эксайтотоксичность. Кроме того, данный препарат способствует увеличению концентраций ацетилхолина и дофамина в головном мозге и оказывает нейропротекторное действие за счет стабилизации клеточных мембран.

В клинических испытаниях применение мемантина приводит к положительному влиянию на когнитивные функции и поведение при умеренных и тяжелых стадиях БА по сравнению с плацебо. Однако, эффект выражен только при длительном применении препарата. Под воздействием мемантина пациенты менее склонны к изменениям настроения, раздражительности, или бреду.

Мемантин хорошо переносится, однако известные побочные эффекты включают головокружение, спутанность сознания, сонливость, галлюцинации и тошноту

(Winblad et al., 2007; Thomas and Grossberg, 2009).

t.me/medicina_free

36

1.3.4 Другие фармакологические средства

Оказание иммуномодулирующего действия Применение различных противовоспалительных препаратов, как

стероидных, так и нестероидных на настоящий момент не показало значимой эффективности при терапии БА (Wilkinson, 2001). Разработанные препараты нового поколения – ингибиторы циклооксигеназ показали эффективность только в отношении замедления прогрессирования заболевания, но не оказали влияния на клинические проявления болезни (Grundman et al., 1988).

Оказание нейропротекторного эффекта Для оказания нейропротекторного эффекта используются препараты

различных фармакологических групп (препараты эстрогена, тестостерона).

Однако, применение препаратов не оказывает влияние на когнитивные функции,

лишь несколько снижая прогрессирование заболевания (Pike, 2017).

Уменьшение формирования тау-белка Несмотря на критическую роль тау-белка в развитии нейродегенеративных

заболеваний, методы влияния на него не получили развития, поскольку тау агрегаты находятся внутри нейронов, что затрудняет их взаимодействие с таргетными лекарственными средствами. Еще одной проблемой для разработки направленных на тау-белок лекарственных препаратов является отсутствие понимания того, какие именно формы тау-белка являются нейротоксичными

(Sigurdsson, 2009).

Внастоящее время проходят клинические испытания препараты,

направленные на предотвращения гиперфосфорилирования тау белка и формирования микротрубочек. Однако, клиническое испытание фазы II

метилтиониния, ингибитора агрегации тау, продемонстрировали лишь незначительные улучшения когнитивных функций у пациентов с легкой и умеренной стадией БА (Panza et al., 2016).

Таким образом, болезнь Альцгеймера, является одной из ведущих причин деменции во всем мире. В патогенез болезни вовлечены различные факторы

t.me/medicina_free

37

риска, включая семейный анамнез и генетику. Редкие формы семейной БА с ранним началом тесно связаны с мутациями генов. Напротив, спорадическая БА с поздним началом представляет собой многофакторное заболевание. Дегенерация нервных путей приводит к образованию аномально агрегированных белков, таких как β-амилоид и тау-белок, которые затем распространяются посредством клеточного переноса. Вариация путей распространения приводит к гетерогенности болезни, характерной для БА. В свою очерередь снижение когнитивных функций в основном является результатом избыточного отложения

β-амилоида, которые вызывают нейровоспаление, что в конечном итоге приводит к гибели клеток. При этом имеющиеся на сегодняшний день гипотизы БА:

холинергическая гипотеза, амилоидная гипотеза и «тау-гипотеза» не способны полностью объяснить все аспекты заболевания.

t.me/medicina_free

38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объект исследования

Мыши линии CD-1 и трансгенные мыши, экспрессирующие химерный мышиный/человеческий белок - предшественник β-амилоида и мутантный человеческий пресенелин-1 – линия B6C3-Tg(APP695)85Dbo.

2.2 Моделирование болезни Альцгеймера Фармакологическая модель болезни Альцгеймера

Фармакологическая модель БА была получена посредством внутрибрюшинных инъекций водного раствора скополамина гидробромида

(антагониста мускариновых ацетилхолиновых рецепторов) в дозе 1 мг/кг мышам линии CD-1 (Питомник «Пущино», Московская область) обоих полов весом 25-30

г. за 40 минут до начала эксперимента. Ингибиторы холинэстераз вводились через

20 минут после введения скополамина гидробромида. Группа животных,

получавших только инъекцию скополамина гидробромида, была определена как группа отрицательного контроля. В качестве положительной контрольной группы использовались мыши, получавшие только эквивалентное количество воды для инъекций.

Трансгенная (генетическая) модель болезни Альцгеймера Эксперименты проводились на трансгенных мышах (Питомник «Пущино»,

Московская область) обоих полов весом 25-30 г, экспрессирующих химерный мышиный/человеческий белок - предшественник β-амилоида и мутантный человеческий пресенелин-1 – линия B6C3-Tg(APP695)85Dbo (далее APP/PS1).

Наряду с прогрессирующим нарушением пространственной памяти модель характеризуется отложениями β-амилоида в головном мозге. Ингибиторы

t.me/medicina_free

39

холинэстераз вводились за 20 минут до начала эксперимента. Трансгенные

APP/PS1 (Tg+) животные и животные дикого типа (Tg-), получавшие эквивалентное количество воды для инъекций были определены как группы положительного и отрицательного контроля соответственно.

2.3 Поведенческие тесты

Эксперименты проводили на мышах линии CD-1 обоих полов весом 25-30 г.

и трансгенных мышах обоих полов весом 25-30 г., экспрессирующих химерный мышиный/человеческий белок - предшественник β-амилоида и мутантный человеческий пресенелин-1 – линия B6C3-Tg(APP695)85Dbo (далее APP/PS1).

Наряду с прогрессирующим нарушением пространственной памяти модель характеризуется отложениями β-амилоида в головном мозге.

2.3.1 Тест в «открытом поле»

Установка «открытое поле» (Open Science, Москва) состояла из белой круглой арены высотой 32 см и диаметром 62 см. Арена установки была разделена на 37 частей. Животное помещалось в центр арены на 2 минуты.

Оценивалось количество пересеченных квадратов, вертикальных стоек,

заглядываний в «норки», актов груминга, и дефекации (фекальных болюсов)

(Laetitia and Catherine, 2003). После окончания тестирования каждого животного арена промывалась 70% раствором этанола.

2.3.2 Тест в Т-лабиринте

Выводы о состоянии пространственной памяти были сделаны на основании тестирования мышей в Т-образном лабиринте (Open Science, Москва) в модели

«вознаграждаемое чередование» (Deacon et al., 2006).

t.me/medicina_free

40

За неделю до начала тестирования мышей подвергали пищевой депривации и приучали к лабиринту в течение четырех дней перед началом эксперимента.

Эксперимент длился 14 дней. Каждое животное ежедневно выполняло по 6 пар тестов. Каждая пара испытаний включала принудительный и свободный выбор направления. Животное должно было обучиться чередовать рукава лабиринта,

направляясь к приманке. Критерием обученности в тесте являлось выполнение минимум 5 из 6 правильных заходов в рукав с приманкой при свободном выборе направления в течение трех дней подряд (Рисунок 2).

Рисунок 2 – схема проведения эксперимента в Т-образном лабиринте.

В работе использовались две экспериментальные схемы тестирования животных в условиях трансгенной модели БА. В первом варианте введение препаратов осуществлялось в течение 18 дней во время поведенческого эксперимента в Т-лабиринте. Во втором варианте проведены эксперименты с

«отменой терапии»: препараты вводили в течение 18 дней, а поведенческий тест начинали после отмены введения препаратов (Рисунок 3).

t.me/medicina_free