2. Показання для дослідження чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Дослідженню на чутливість до АБП підлягають чисті культури мікроорганізмів або ізольовані колонії із щільних поживних середовищ (далі - ПС) первинного посіву клінічного матеріалу. Визначення чутливості з використанням клінічного матеріалу (без виділення чистої культури) можливо тільки у виключних випадках за умови підтвердження однорідності культури і високого ступеня обсіменіння при мікроскопії мазків забарвлених за Грамом. При такій ситуації дослідження слід повторити після виділення чистої культури мікроорганізму.

При виявленні на щільних ПС первинного посіву змішаної культури, досліджувати антибіотикочутливість до ідентифікації і оцінки етіологічної значимості окремих мікроорганізмів недоцільно.

Разом з тим, визначення чутливості виділених мікроорганізмів до АБП виправдано далеко не в усіх випадках, виявлення показів для такого дослідження є обов'язком лікаря-бактеріолога. Слід пам'ятати, що:

- визначати чутливість до АБП представників нормальної мікрофлори людини з природних місць знаходження, бактерій виділених з об'єктів довкілля, за винятком випадків проведення досліджень для епідеміологічного типування, недоцільно;

- підтвердження природної чутливості або резистентності мікроорганізму до АБП не є завданням практичних лабораторій;

- не слід в рутинних дослідженнях вивчати мікроорганізми, для яких в даний час не стандартизовані методи визначення чутливості і відсутні критерії інтерпретації результатів. Такі результати не можуть бути підставою для призначення антибактеріального препарату;

- проводити визначення чутливості до препаратів у мікроорганізмів, що проявляють універсальну чутливість до них, тобто коли випадків резистентності не описано (наприклад, усі штами Streptococcus pyogenes, N.meningitidis чутливі до пеніциліну), недоцільно.

3. Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Серед стандартизованих методів визначення чутливості мікроорганізмів до АБП розрізняють методи серійних розведень та дифузійні. Крім того, в даний час все більш широкого розповсюдження набувають автоматичні методи.

Методи серійних розведень базуються на прямому визначенні мінімальної інгібуючої (подавляючої) концентрації (далі - МІК) препарату, що характеризує мікробіологічну активність АБП.

МІК - мінімальна концентрація препарату, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному поживному середовищі.

Для визначення величини МІК певні концентрації АБП вносять у поживне середовище, яке потім засівають культурою досліджуваного мікроорганізму і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого росту.

Розрізняють методи серійних розведень в агарі або в бульйоні. В залежності від об'єму використаного бульйону, розрізняють методи серійних макро- і мікророзведень. В автоматизованих системах для визначення чутливості мікроорганізмів використовується метод, заснований на використанні тільки двох концентрацій АБП, які відповідають граничним значенням МІК.

В основу дифузійних методів визначення чутливості покладена дифузія АБП із носія у щільне ПС до концентрації препарату, яка перевищує МІК, і пригнічує ріст досліджуваної культури в цій зоні. Існують дві основні модифікації дифузійного методу: диско-дифузійний та Е-тест.

В диско-дифузійному методі у якості носія АБП використовують паперовий диск. Утворення зони пригнічення росту відбувається в результаті дифузії АБП з носія в ПС. Диско-дифузійний метод дозволяє лише опосередковано зробити висновок про величину МІК, а результатом дослідження є віднесення мікроорганізму до однієї з категорій чутливості (чутливий, помірно-стійкий або резистентний).

Е-тест - це вузька полімерна смужка (0,5 x 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій АБП (від мінімальних до максимальних). Пригнічення росту мікроорганізму навкруги смужки Е-тесту відбувається тільки в тій зоні, де концентрація АБП, що дифундує з носія, вище МІК, при цьому утворюється краплеподібна зона інгібіції. Значення концентрацій АБП на кожній ділянці носія нанесені на зовнішній (зверненій до дослідника) поверхні Е-теста. Величину МІК враховують в тому місці, де межа зони пригнічення росту впритул підходить до носія. Детальні інструкції про визначення чутливості з використанням Е-тестів додаються виробником до набору.

3.1. Основні етапи проведення тестування. Для вивчення антибіотикочутливості мікроорганізму, незалежно від методу дослідження, необхідно послідовно виконати такі етапи:

- приготувати поживні середовища;

- приготувати суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма);

- внести нокулюм в поживне середовище;

- інкубувати посіви визначений проміжок часу при відповідних температурних параметрах;

- облік результатів та їх інтерпретація, формулювання рекомендацій щодо лікування.

Дифузійні методи включають також етап накладення дисків або смужок Е-тесту на щільне ПС.

3.1.1. Приготування поживних середовищ для визначення чутливості.

Для оцінки чутливості використовують спеціально призначені для цього ПС, дозволені до застосування в Україні в установленому порядку. Вид ПС для оцінки чутливості залежить від обраного методу проведення дослідження (агар або бульйон), а також мікроорганізму, що підлягає тестуванню.

Міжнародно визнаними поживними середовищами для визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків є агар або бульйон Мюллер-Хинтона і середовища, приготовані на їх основі. Доведено, що середовище АГВ непридатне для визначення чутливості до багатьох сучасних антимікробних препаратів. ПС, що застосовуються, за своїми характеристиками повинні задовольняти вимогам наведеним в розділі 4.2.

Обране ПС для визначення чутливості готують із сухого середовища промислового виробництва відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування ПС розливають в стерильні пробірки або чашки Петрі. При необхідності колби з ПС поміщають на водяну баню при 48-50 град. С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять термолабільні поживні добавки та/або робочі розчини антибіотиків, а потім розливають в пробірки або в чашки Петрі. Товщина агару у чашках повинна бути 4 мм, а тому на чашку діаметром 100 мм потрібно 25 куб.см агару, на чашку діаметром 90 мм - 20 куб.см. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Приготовані таким чином чашки Петрі бажано використовувати негайно. Допускається зберігання їх в запаяних поліетиленових пакетах в холодильнику при 4-8 град. С не більше 5 діб.

    3.1.2. Приготування    мікробної    суспензії    (інокулюма).

Приготування  мікробної  суспензії  досліджуваного  мікроорганізму

певної  густини є загальною і принципово важливою вимогою для усіх

                                                                8

методів тестування.  Її концентрація повинна становити 1,5  х  10

колонієутворюючих одиниць (далі - КУО)/куб.см,  що при візуальному

контролі   відповідає  стандарту  мутності  0,5  за  МакФарландом.

Контроль  оптичної  густини  суспензії  може  також  здійснюватися

денситометрично,  наприклад за допомогою денсіламетра.  Бактерійну

суспензію можна готувати з бульйонної або з агарової культури.

Приготування інокулюма з агарової культури. Для приготування інокулюма відбирають 3-5 однотипних, чітко ізольованих колоній, що виросли на неселективних щільних ПС після 16-24 годин інкубації. Петлею переносять незначну кількість матеріалу з верхівок колоній в пробірку із стерильним фізіологічним розчином або поживним бульйоном, доводячи густину інокулюма точно до 0,5 за стандартом МакФарланда. При наявності накопиченої біомаси чистої культури беруть повну петлю зливного росту і аналогічним чином суспендують в 4-5 куб.см стерильного фізіологічного розчину/поживного бульйону. Інокулюм слід використовувати не пізніше 15 хв. після приготування.

Не можна використовувати як інокулят не розведені бульйонні культури або не стандартизований інокулюм!

Приготування інокулюма з бульйонної культури. При визначенні чутливості бактерій із звичайними поживними потребами, які швидко ростуть, для приготування інокулюма можна використовувати 5-6-годинну бульйонну культуру мікроорганізму. Для цього відбирають декілька однотипних ізольованих колоній, петлею переносять незначну кількість матеріалу в пробірку з 4,0-5,0 куб.см рідкого неселективного ПС. Інкубують при 35 град. С. Через 5-6 год. інкубації густина мікробної суспензії приблизно відповідає необхідній, і її точно доводять до 0,5 за МакФарландом додаючи стерильний бульйону або фізіологічний розчин.

3.1.3. Приготування стандарту 0,5 за МакФарландом Стандарт МакФарланда може бути придбаний або приготований в лабораторії.

    До 0,5 куб.см розчину BaCl  в концентрації 0,048  моль/куб.дм

                              2

(1,175% розчин BaCl  х 2H О) повільно при ретельному перемішуванні

                  2     2

додати 99,5 куб.м розчину H SO  в  концентрації  0,18  моль/куб.дм

                          2  4

(1%) до отримання гомогенної суспензії.

Тестування стандарту мутності проводять за допомогою фотометра. Поглинання при використанні кювети 1 см повинне становити 0,08-0,10 при довжині хвилі 625 нм.

Отриману суспензію розливають по 4-6 куб.см в пробірки з кришками, що герметично закриваються. Пробірки повинні бути такого ж діаметра, як і для приготування бактерійного інокулюма. Зберігають пробірки з суспензією в темному місці, при кімнатній температурі не більше 6 міс.

Перед використанням пробірки ретельно струшують і оцінюють однорідність суспензії. При появі видимих частинок пробірки не використовують. Стандарт мутності поновлюють або перевіряють його оптичну густину щомісячно.

3.2. Методи серійних розведень

3.2.1. Приготування розчинів АБП для методів серійних розведень. Надзвичайно важливим етапом для всіх методів серійних розведень є приготування розчинів АБП. Розрізняють "основні розчини" АБП (придатні для зберігання) і "робочі", які необхідно використовувати "ex tempore" для приготування ПС.

Основні розчини препарату готують із субстанції АБП з відомою активністю, лікарські форми для цього не придатні. Для зважування субстанцій використовують електронні лабораторні терези з точністю до 4-го знаку, для вимірювання об'ємів - калібровані дозатори і піпетки.

Основні розчини АБП готують в концентрації 1000,0 мкг/куб.см і вище. Враховуючи активність АБП готують його наважку для базового розчину. Розрахунок наважок АБП для приготування базового розчину роблять за формулою:

                        C (мгк/куб.см) x V      (куб.см)

                                          теор.

       m АБ      (мг) = ---------------------------------,

           теор.           А (вміст АБП в мкг/куб.см)

    де

    m АБ      - розрахункова (теоретична) наважка АБП;

        теор.

С - необхідна концентрація АБП;

V - об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки;

теор.

А - активність АБП (кількість активної речовини, що міститься в субстанції).

Зважити точно розрахункову кількість порошку практично неможливо, тому готують близьку до розрахункової наважки, а потім перераховують кількість необхідного розчинника.

                         m АБ       (мг) x V      (куб.см)

                             практ.         теор.

      V       (куб.см) = ----------------------------------,

       практ.                     m АБ      (мг)

                                      теор.

    де

    V       - об'єм розчинника для розчинення практичної наважки;

     практ.

    m АБ       - отримана наважка АБП;

        практ.

    m АБ      - розрахункова (теоретична) наважка АБП;

        теор.

V - об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки;

     теор.

АБП істотно розрізняються за розчинністю, тому виникає необхідність використовувати різні речовини для первинного розчинення препаратів (розчинники) і для доведення їх до заданої концентрації (разбавлювачі). У випадках, коли розчинники і розбавлювачі є різними речовинами, для розчинення АБП необхідно використовувати мінімальну кількість розчинника. Відмінні від води розчинники і розбавлювачі для окремих АБП наведені в табл. 1.

Основні розчини зберігають при температурі не вище -20 град. С, але терміни зберігання окремих АБП при цій температурі істотно відрізняються. Оптимальними умовами для зберігання основних розчинів АБП є температура -60 град. С і нижче, тривалість - не більше 6 міс. Основні розчини бета-лактамних АБП можуть втрачати активність і в більш ранні терміни.

Діставши флакони з готовими основними розчинами із холодильника, необхідно довести їх до кімнатної температури для запобігання конденсації вологи. Повторне заморожування основних розчинів не допускається.

З робочих розчинів готують двократні розведення АБП. При розрахунках за основу беруть кінцеву концентрацію АБП в ПС, яка дорівнює 1,0 мкг/куб.см (більш високі - 2, 4, 8 і т.і.; більш низькі - 0,5; 0,25; 0,125 і т.і.). При цьому реальні концентрації розчинів повинні враховувати фактор розбавлення розчину АБП при приготуванні чашок з щільним ПС або при інокуляції. Діапазон двократних серійних розведень АБП залежить від виду мікроорганізму, що підлягає тестуванню, активності АБП і мети дослідження.

3.2.2. Метод серійних розведень в бульйоні. Метод серійних розведень в бульйоні використовують у двох основних варіантах: макрометод (пробірочний) і мікрометод (кінцевий об'єм 0,2 куб.см і менше). Макрометод може використовуватись для оцінки чутливості одиничних штамів, оскільки має низьку продуктивність.

    Макрометод. Тестування  проводиться в об'ємі 1 куб.см кожного

розведення   АБП   з   кінцевою    концентрацією    досліджуваного

                                 5

мікроорганізму приблизно  5  х  10   КУО/куб.см.  Поживний бульйон

розливають по  0,5  куб.см  в  кожну пробірку.  Кількість пробірок

визначається необхідним діапазоном розведень АБП і збільшується на

одну для постановки "негативного контролю".

Робочий розчин АБП готують з основного розчину з використанням рідкого ПС. Концентрацію робочого розчину розраховують, виходячи з необхідної максимальної концентрації у ряді серійних розведень, враховуючи, що при подальшій інокуляції препарат буде ще розбавлений. Робочий розчин в кількості 0,5 куб.см за допомогою мікропіпетки із стерильним наконечником вносять в першу пробірку, що містить 0,5 куб.см бульйону. Ретельно перемішують і новим стерильним наконечником переносять 0,5 куб.см розчину АБП в бульйоні в наступну пробірку з 0,5 куб.см бульйону. Цю процедуру повторюють, поки не буде приготований весь необхідний ряд розведень. З останньої пробірки 0,5 куб.см бульйону видаляють.

Таким чином, отримують ряд пробірок з розчинами АБП, концентрації яких відрізняються в сусідніх пробірках в 2 рази. Одночасно готують додаткові ряди серійних розведень АБП для тестування контрольних штамів. Серія розведень обов'язково повинна включати граничні концентрації і допустимі діапазони МІК для контрольних штамів.

    Для інокуляції     використовують     мікробну     суспензію,

еквівалентну 0,5 за стандартом МакФарланда,  розведену в 100 разів

на  поживному  бульйоні,  після чого концентрація мікроорганізму в

                           6

ній становитиме приблизно 10  КУО/куб.см.  По 0,5 куб.см інокулюма

вносять в кожну пробірку,  що містить по  0,5  куб.см  відповідних

розведень АБП,  і  в одну пробірку з 0,5 куб.см поживного бульйону

без антибіотика як  "негативний  контроль".  Кінцева  концентрація

мікроорганізму  в  кожній  пробірці досягне необхідної - приблизно

     5

5 х 10  КУО/куб.см.  Інокулюм повинен  бути  внесений  в  пробірки

з розведеннями АБП не пізніше 15 хв. з моменту його приготування.

Пробірки закривають стерильними пробками, і всі, крім пробірки з "негативним контролем", інкубують в звичайній атмосфері при температурі 35 град. С протягом 16-20 або 20-24 год. (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Пробірка з "негативним контролем" поміщається в холодильник при 4 град. С до обліку результатів.

Для визначення наявності росту мікроорганізму пробірки з посівами переглядають у проходячому світлі. Ріст культури у присутності АБП порівнюється з "негативним контролем", що містить початковий інокулюм, який зберігався у холодильнику. МІК визначається за найменшою концентрацією АБП, яка пригнічує видимий ріст мікроорганізму.

Мікрометод. Тестування проводиться в об'ємі 0,2 куб.см і менше, що дозволяє значно скоротити кількість витратних матеріалів. Його перевагами є висока продуктивність і можливість тривалого зберігання заздалегідь приготованих планшет. Методика не має технічних відмінностей від макрометоду, але вимагає оснащення лабораторії багатоканальними піпетками, стерильними 96-лунковими планшетами з кришками для імунологічних досліджень (з плоским дном). Після внесення робочих розчинів антибіотиків в лунки, запаяні в поліетилен планшети можуть зберігатися при температурі -60 град. С і нижче до моменту використання. Повторне заморожування - відтавання не допускається.

Перед проведенням дослідження планшети витримують до досягнення ними кімнатної температури, після чого їх інокулюють приготованою суспензією досліджуваного мікроорганізму. Підчас інкубації для запобігання висихання вмісту лунок планшет обов'язково повинен бути закритий кришкою.

Облік результатів проводять візуально або спектрофотометрично, порівнюючи ріст мікроорганізму у присутності АБП із ростом культури у лунці без АБП. За МІК приймають мінімальну концентрацію, що забезпечує повне пригнічення видимого росту досліджуваного штаму.

При використанні комерційних тест-систем для дослідження антибіотикорезистентності методом серійних мікророзведень, дозволених до застосування в Україні в установленому порядку, слід користуватися інструкціями виробників.

При постановці методів серійних розведень в бульйоні необхідно проводити контроль росту культури в середовищі без АБП, чистоти суспензії мікроорганізму (шляхом висіву на неселективні середовища). Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референтних) штамів.

3.2.3. Метод серійних розведень в агарі. Метод серійних розведень в агарі дозволяє одночасно визначити МІК партії штамів (до 30 клінічних штамів). Для дослідження висівають штами мікроорганізму на чашки Петрі з агаром, що містить послідовні подвійні розведення антибіотику. Паралельно тестують відповідні контрольні штами, а також контролюють ріст мікроорганізмів на чашках без АБП і чистоту культури.

Для приготування серійних розведень АБП з основного розчину досліджуваного препарату готують робочий розчин в концентрації, яка в 10 разів перевищує використану максимальну для конкретного дослідження. Потім готують серію двократних розведень робочого розчину. Для приготування серії розведень використовуються стерильні хімічно інертні лабораторні ємкості з кришками об'ємом не менше 10 куб.см (для зручності розмішування).

Поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування колби з ПС поміщають на водяну баню при 48-50 град. С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять 1 частину робочого розчину АБП на 9 частин розплавленого агару і, при необхідності, термолабільні поживні добавки. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.

Можна готувати чашки Петрі з агаром, що містить розведення АБП, змішуючи ПС і розчин препарату безпосередньо в чашці Петрі. Для цього чашки заздалегідь маркують, вказавши препарат і його концентрацію. У стандартні пластикові чашки діаметром 90 мм вносять 2 куб. см розчину АБП і додають 18 куб.см нагрітого до 50 град. С рідкого агару. Ретельно перемішують агар плавними різноспрямованими круговими рухами чашки. Після приготування чашок агар повинен затвердіти в горизонтальному положенні. Не можна різко пересувати, переносити чашки до повного застигання агару. Паралельно з чашками Петрі, що містять розчини антибіотиків, для контролю росту готують чашки Петрі без антибіотиків. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання і підсушування на 10-12 год.

Приготовані таким чином чашки Петрі слід використовувати негайно, проте допускається зберігання в запаяних поліетиленових пакетах при 4-8 град. С до 5 діб (крім чашок, що містять бета-лактамні антибіотики).

Стандартну мікробну суспензію, яка відповідає стандарту 0,5 за МакФарландом розводять у 10 разів. Отриману суспензію необхідно інокулювати на поверхню агару протягом 15 хв. з моменту приготування, при цьому утворюється пляма діаметром 5-8 мм. Для контролю якості приготування суспензій періодично проводять підрахунок реальних КУО шляхом висіву зразка приготованого інокулюма на неселективні поживні середовища.

Після інокуляції чашки залишають при кімнатній температурі для підсихання, перевертають їх і інкубують при температурі 35 град. С протягом 18-24 год. (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму).

Облік результатів проводять, помістивши чашку на темну поверхню, що не відбиває світло. Концентрація, що викликала повну інгібіцію видимого росту, є МІК. Для диференціювання ніжного росту від нальоту, що залишився після інокулята, доцільно використовувати стереомікроскоп. Наявність однієї колонії на чашці з концентрацією на 1 розведення вище, ніж явна МІК, можна не враховувати.

При постановці методів серійних розведень в агарі обов'язково проводять контроль росту культури на чашці Петрі з поживним середовищем, яке не містить АБП і чистоти культури. Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референсних) штамів.

Методи серійних розведень є найточнішими і найінформативнішими, проте їх постановка в практичних лабораторіях пов'язана зі значними методичним труднощами: необхідність використання субстанцій антибіотиків з відомим рівнем активності, суворого дотримання режимів зберігання, ретельного виконання контролю якості поживних середовищ, трудомісткості приготування робочих розчинів антибіотиків.

Використання тест-систем на основі методу мікророзведень дозволяє уникати трудомістких процедур стандартизації підготовчих етапів, і при цьому забезпечує отримання достовірних кількісних результатів щодо рівня антибітикорезистентності.

3.3. Диско-дифузійний метод (далі - ДДМ). Метод оснований на здатності АБП дифундувати з просочених ними паперових дисків в поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів посіяних на поверхні агару.

Для визначення чутливості ДДМ використовують поживні середовища такі ж, як і для методу розведень в агарі, а тому використовуються і ті ж методи контролю їх якості. Щільне поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника, розливають у чашки Петрі шаром товщиною 4,0 +- 0,5 мм, попередньо виставивши їх на горизонтальну поверхню (вивірену рівнем, без западин і опуклостей). Це вкрай важливо, оскільки розмір і форма зони пригнічення росту залежать від глибини і рівномірності агарового шару. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Зберігати чашки можна запаяними в поліетиленові пакети при 4-8 град. С протягом 5 діб. Перед інокуляцією чашки підсушують у термостаті при 35 град. С з привідкритою кришкою протягом 10-20 хв. Конденсату рідини на внутрішній поверхні кришок не повинно бути.

Диски з антибіотиками. Для визначення чутливості ДДМ використовують тільки стандартизовані якісні диски. Виготовлення дисків з АБП для визначення чутливості диско-дифузійним методом в лабораторних умовах не допускається.

Достовірність результатів дослідження залежить також від умов зберігання готових комерційних дисків, оскільки вміст в них антибіотиків може знизитися нижче допустимого рівня до закінчення терміну придатності. Зберігати диски з АБП тривалий термін слід в герметичній упаковці в морозильній камері при температурі -18 град. С і нижче. Невеликі партії дисків, що використовуються в повсякденній роботі, можна тримати в холодильнику при температурі 4-8 град. С, щільно закупореними, щоб гарантувати неможливість попадання у флакон вологи, крім того, для додаткового захисту від вологи флакони (картриджі) з дисками комерційного виготовлення містять спеціальний вологопоглинач (силікагель). Флакони (картриджі) з дисками слід витримувати перед використанням герметично закритими до досягнення ними кімнатної температури протягом 1 години, що запобігає утворенню конденсату на дисках після відкривання флаконів.

    Приготування бактерійної    суспензії   і   інокуляція.   При

визначенні чутливості ДДМ використовують стандартний інокулюм,  що

відповідає 0,5 за стандартом МакФарланда,  тобто містить приблизно

        8

1,5 х  10   КУО/куб.см.  Інокулюм  слід  використовувати  протягом

15 хвилин  з  моменту приготування.  Для інокуляції чашок з агаром

можна використовувати два способи.

1. Стерильний ватний тампон (комерційного виготовлення) занурюють у підготовлену суспензію мікроорганізму, надлишок інокулюма відтискають об стінки пробірки. Інокуляцію проводять штриховими рухами у трьох напрямах, повертаючи чашку Петрі на 60 град.

2. Стандартний інокулюм наносять піпеткою на поверхню чашки Петрі з поживним середовищем в об'ємі 1-2 куб.см, рівномірно розподіляють по поверхні похитуванням, надлишок інокулюма видаляють піпеткою. Привідкриті чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 10-15 хв.

На поверхню ПС наносять диски з АБП. Аплікацію дисків проводять за допомогою стерильного пінцета або автоматичного диспенсора. Відстань від диска до краю чашки і між дисками повинна бути 15-20 мм, тобто на одну чашку діаметром 100 мм слід поміщати не більше 6 дисків з АБП. Диски повинні рівномірно контактувати з поверхнею агару, для чого їх слід акуратно притиснути пінцетом.

Відразу після аплікації дисків чашки Петрі поміщають в термостат догори дном і інкубують при температурі 35 град. С протягом 18-24 год. (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Збільшення інтервалу часу між нанесенням дисків на поверхню середовища і початком інкубації, а отже і початком росту досліджуваної культури, приводить до "переддифузії АБП" в агар і до збільшення діаметра зони пригнічення росту.

Облік результатів. Після інкубації чашки поміщають догори дном на темну матову поверхню так, щоб світло падало на них під кутом 45 град. (облік у відбитому світлі). Діаметр зон затримки росту виміряють з точністю до 1 мм (бажано користуватися штангенциркулем або кронциркулем).

При вимірюванні зон затримки росту орієнтуються на зону повного пригнічення видимого росту. Не слід звертати увагу на дуже дрібні колонії, які виявляються в межах зони затримки росту тільки за особливих умов освітлення або збільшення, і ледь помітний наліт біля краю зони. Винятком є результати визначення чутливості стафілококів до оксациліну, коли необхідно враховувати і найдрібніші колонії, виявлені в межах чіткої зони пригнічення росту.

Крупні колонії в межах чіткої зони пригнічення росту свідчать про наявність сторонньої мікрофлори або про гетерорезистентность популяції мікроорганізмів, в цьому випадку необхідно повторити ідентифікацію мікроорганізму, що формує цю колонію, і визначення чутливості цього штаму.

При визначенні чутливості ДДМ штамів протеїв, що рояться, зона пригнічення росту може бути затягнутою тонкою вуалеподібною плівкою, яка не заважає встановленню межі зони і не враховується при реєстрації результатів.

При визначенні чутливості до сульфаніламідів і їх комбінації з триметопримом межу зони пригнічення росту враховують на рівні пригнічення росту на 80%. Це пов'язано з тим, що під дією цих препаратів перед повним пригніченням росту можливо завершення 1-2 циклів проліферації мікроорганізму.

Для ідентифікації і тестування чутливості мікроорганізмів до антибіотиків можна використовувати мікробіологічні аналізатори, зареєстровані і дозволені до використання в Україні

Вибір між диско-дифузійним і автоматичним методами можна зробити у відповідності до таких критеріїв, як кількість антибіотикограм, які треба здійснити; види бактерій, що підлягають тестуванню; затрачений час та вартість. Обидва методи мають порівнювані результати при правильному використанні. Кожен із зазначених методів має свої сильні та слабкі сторони, які подані в таблиці, що наводиться нижче:

------------------------------------------------------------------

|   Метод    |     Слабкі сторони      |     Сильні сторони      |

|------------+-------------------------+-------------------------|

|Автоматичний|Ризик виходу з ладу      |Можливість комп'ютерної  |

|            |                         |обробки результатів      |

|            |                         |(надійність залежить від |

|            |                         |експертної системи, що   |

|            |                         |використовується)        |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Висока вартість          |Економія часу та         |

|            |                         |зменшення кількості      |

|            |                         |маніпуляцій              |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Відсутність візуальної   |Резистентність краще     |

|            |перевірки                |проявляється в бульйоні  |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Втрата "задоволення" від |Стандартизація           |

|            |класичноїї бактеріології |                         |

|------------+-------------------------+-------------------------|

|Автоматичний|Недостатня візуалізація  |Відтворюваність          |

|            |синергії та антагонізмів |                         |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Недостатня гнучкість при |Краще управління         |

|            |виборі антибіотиків      |запасами, що зберігаються|

|            |                         |на складі                |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Залежність від одного    |Простота у використанні  |

|            |постачальника            |                         |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Ефективність змінюється в|Швидке отримання         |

|            |залежності від організму |результатів              |

|            |(особливо для бактерій,  |                         |

|            |що повільно ростуть)     |                         |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Зберігання реагентів     |Гнучкість і можливість   |

|            |                         |адаптації при            |

|            |                         |використанні             |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Недостатня               |"Задоволення" від        |

|            |відтворюваність          |класичної бактеріології  |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Складнощі при веденні    |Можливість тестування    |

|            |складського обліку       |повного діапазону        |

|            |                         |антибіотиків             |

|------------+-------------------------+-------------------------|

|   Ручний   |Потребує ретельних,      |Детекція синергізму та   |

|            |точних маніпуляцій       |антагонізму              |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Повільність в одержанні  |Виявлення нових          |

|            |результатів              |механізмів               |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Стандартизація варіює    |Незалежність від         |

|            |                         |постачальників,          |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Тривалість               |Контроль чистоти (легко  |

|            |                         |виявляти контамінанти)   |

|            |-------------------------+-------------------------|

|            |Погана дифузія деяких    |Низька вартість          |

|            |антибіотиків             |                         |

------------------------------------------------------------------