6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Стандартизация_аналитических_технологий_лабораторной_медицины_Выпуск

3.5.Очистка пробы клеточной суспензии от элементов, уменьшающих информативность клеточного материала (для некоторых систем)

Внекоторых системах перед перенесением клеточного материала на предметное стекло он подвергается перемешиванию со специальным реагентом. Далее эта клеточная суспензия центрифугируется (режимы центрифугирования могут различаться для разных систем), в результате чего происходит физическое разделение суспензии на слои, содержащие по отдельности диагностически важный клеточный материал и материал, который на предметном стекле затрудняет правильную интерпретацию препарата (это могут быть эритроциты, элементы воспаления, детрит). Удаление соответствующих слоев позволяет получить более чистый и легко интерпретируемый препарат.

3.6.Приготовление монослойных препаратов

3.6.1.Приготовление монослойных мазков на цитоцентрифуге

Для приготовления монослойных препаратов используют ме-

тоды седиментации (осаждения) или центрифугирования материала на цитоцентрифуге (в отличие от обычной центрифуги клеточный материал осаждается сразу на стекле). Метод ЖЦ основан на осаждении клеток на поверхности стекла за счет силы тяжести или центробежной силы для образования монослоя с применением абсорбционных фильтров или клеящего раствора.

Цитоцентрифуги различаются между собой количеством держателей для цитокамер в роторе (от 4 до 12), принципом работы центрифуг, устройством цитокамер (с фильтрами для впитывания жидкости или без них), размером участков осаждения материала на стекле. Цитокамера со стеклом собирается в соответствии с инструкцией.

Условия центрифугирования определяются в лаборатории в зависимости от типа материала и центрифуги. При проведении центрифугирования необходимо строго следовать инструкции производителя. После центрифугирования оставшуюся жидкость сливают, цитокамеру разбирают. Стекло высушивают на открытом воздухе. При необходимости можно приготовить несколько (до 25, в зависимости от системы и от клеточности полученного материала) адекватных монослойных препаратов, на которых клеточный материал сконцентрирован в одном небольшом «окошке». Из них 1 или более препаратов окрашивают для цитологического исследования, остальные могут быть сохранены и/или использованы для других видов анализа.

Выпуск 2

3.6.2.Автоматизированные системы для приготовления,

окрашивания и первичной сортировки препаратов

При использовании автоматизированного цитологического процессора, пробоподготовку цитологического материала следует проводить в соответствии с рекомендациями изготовителя. Существуют системы, с помощью которых проводят только приготовление тонкослойного мазка, системы, позволяющие проводить пробоподготовку и окрашивание, а также системы, осуществляющие автоматизированный скрининг мазков, первичную сортировку препаратов на норму и патологию.

Автоматизированные системы оказывают врачу-цитологу помощь

винтерпретации препаратов. Прежде всего они контролируют адекватность препаратов (клеточность, наличие в препаратах как плоских, так и железистых клеток, качество окраски). Системы предоставляют информацию, позволяющую цитологу оценить вероятность наличия

вконкретном препарате измененных клеток. Автоматизированные системы обеспечивают экономию трудозатрат при интерпретации препарата, позволяя ограничиться при просмотре только теми полями зрения, где с наибольшей вероятностью могут находиться клетки с атипией. Наиболее развитые приборы оценивают вероятность наличия измененных клеток не только во всем препарате, но и в отдельных полях. Они предъявляют цитологу поля для просмотра, начиная с наиболее опасных.

3.7.Фиксация и окрашивание материала

3.7.1.Общие правила фиксации и окрашивания препаратов,

полученных методом жидкостной цитологии

Фиксация и окрашивание монослойных препаратов могут выполняться вручную или автоматически с помощью специальных устройств, в которые загружаются нефиксированные препараты. Последующее автоматическое дозирование фиксатора-красителя и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску.

Применение любой методики фиксации и окрашивания препаратов требует точного соблюдения последовательности процедур при приготовлении растворов и временных промежутков в течение процесса фиксации и окрашивания.

Фиксация мазков выполняется либо как предварительный этап перед окрашиванием, либо одновременно с окрашиванием, если по технологии используются растворы готовых красителей.

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

Подготовительная работа для выполнения фиксации и окрашивания препаратов состоит: в приготовлении буферного раствора, основных и рабочих растворов красителей, подготовке оборудования. Приготовление буферного раствора описано, например, в стандартизованной технологии: «Цитологическое исследование аспирата из полости матки».

3.7.2.Методика фиксации и окрашивания препаратов,

полученных методом жидкостной цитологии

Препараты, полученные методом жидкостной цитологии, можно окрашивать любым из методов, используемых в цитологической диагностике: различными модификациями метода Романовского (по Паппенгейму, Лейшману и др.), методом окрашивания по Папаниколау.

Примечание. Если материал собирают в транспортную среду, содержащую этанол или другую фиксирующую жидкость, приготовленные препараты желательно окрашивать по Папаниколау или гематок- силин-эозином. Естественные жидкости организма можно окрашивать любым методом: по Романовскому (в любой модификации после «сухой» фиксации – высушивание препарата на воздухе), Папаниколау (с обязательной немедленной фиксацией приготовленных препаратов – «влажная фиксация»), гематоксилин-эозином.

Фиксация мазков (для различных модификаций метода Романовского)

Реактивы:

•фиксатор-краситель Мая-Грюнвальда (модификация окраски Романовского по Паппенгейму) или фиксатор-краситель Лейшмана.

Примечание. Все фиксаторы содержат метанол, что требует соблюдения соответствующих правил обращения с химическими реагентами, содержащими ядовитые вещества.

Оборудование:

•кюветы для фиксации и окраски мазков со штативом-контейнером (или лотки со специальными «рельсами» для окраски мазков) либо автоматические приборы для фиксации и окрашивания мазков;

•химические стаканы (низкие) для разведения красителей.

Последовательность процедур:

•высушивают препараты на воздухе;

•сухие нефиксированные препараты помещают в штатив-контейнер для окраски стекол или располагают горизонтально на специальные «рельсы»;

Выпуск 2

•штатив-контейнер опускают в кювету с раствором фиксатора-кра- сителя на 3–5 минут, или наливают по 3–4 мл фиксатора-красителя на каждый из препаратов, находящихся на рельсах;

•вынимают контейнер из фиксирующего раствора, или стряхивают фиксатор-краситель со стекол, находящихся на «рельсах» в лоток;

•промывают контейнер с препаратами или препараты, находящиеся на «рельсах», дистиллированной водой;

•стряхивают избыток воды.

Окрашивание препаратов (для различных модификаций метода Романовского)

Оборудование:

•колбы и бутыли для приготовления и хранения основных растворов красителей;

•кюветы для окраски препаратов со штативом-контейнером (или лотки со специальными «рельсами» для окраски мазков);

•химические стаканы низкие (для разведения красителей).

Приготовление реактивов:

––основной раствор красителя азур II: 1,0 г азура II растворяют в 1000 мл кипящей воды, охлаждают;

––основной раствор красителя водорастворимого эозина К или Na: 1,0 г эозина К или 2,0 г эозина Na растворяют в 1000 мл кипящей воды, охлаждают.

Примечание. Рабочий раствор азур-эозина готовят ex tempore, способ приготовления зависит от методики окраски.

Схема окрашивания мазков по методу Паппенгейма:

•докрашивают азур-эозином: штатив-контейнер опускают в кювету с раствором азур-эозина на 20 минут, или наливают по 3–4 мл краски на каждый из препаратов, находящихся на рельсах (рабочий раствор красителя готовят перед работой ex tempore): 2 части основного раствора азура, 1 часть основного раствора водорастворимого эозина и 3 части дистиллированной воды рН 6,8-7,2);

•вынимают контейнер из краски, или стряхивают краситель со стекол, находящихся на «рельсах» в лоток;

•промывают контейнер с препаратами или препараты, находящиеся на «рельсах», водопроводной водой;

•стряхивают избыток воды;

•окрашенные и промытые препараты высушивают на воздухе.

Схема окрашивания препаратов по методу Лейшмана:

•докрашивают азур-эозином: штатив-контейнер опускают в кювету с раствором азур-эозина на 20–40 минут, или наливают по 3–4 мл

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

краски на каждый из препаратов, находящихся на рельсах (смесь красителей готовят перед работой ex tempore): 40 мл основного раствора азура II, 30 мл основного раствора водорастворимого эозина, 70 мл дистиллированной воды;

•вынимают контейнер из краски, или стряхивают краситель со стекол, находящихся на «рельсах» в лоток;

•промывают контейнер с препаратами или препараты, находящиеся на «рельсах», водопроводной водой;

•стряхивают избыток воды;

•окрашенные и промытые мазки высушивают на воздухе.

Окраска мазков по методу Папаниколау

Окраска препаратов проводится готовыми красителями Папаниколау (EA 50, EA65). Состав красителя EA 50 приведен в табл. 1.

Окраска препаратов по Папаниколау может выполняться ручным и автоматическим способами.

Последовательность процедур при ручном окрашивании препаратов:

1.Поэтапная регидратация (насыщение водой) цитологических препаратов в спиртах нисходящей крепости (80, 70, 50%), дистиллированной воде. Время воздействия каждого раствора 30 секунд.

2.Окрашивание мазков гематоксилином в течение 10 минут.

3.Препараты промываются водопроводной водой до появления синей окраски.

4.Дегидратация в спиртах восходящей крепости (50, 70, 80%). Время воздействия каждого раствора 30 секунд.

5.Окрашивание препаратов оранжевым G в течение 30–100 секунд.

6.Трехкратное промывание в 95% растворе этилового спирта.

7.Окрашивание раствором красителя EA 50 в течение 1,5 минут.

8.Трехкратное промывание в 95% растворе этилового спирта.

Выпуск 2

9.Двукратное поэтапное обезвоживание в растворах: 100% этилового спирта; этилового спирта и ксилола в пропорции 1:1 и ксилоле.

10.Заключение препарата синтетическим бальзамом под покровное стекло.

Микроскопическое изучение препарата проводится по правилам,

приведенным в тексте документа п. 6.4.

Автоматическое окрашивание препаратов способом Папаниколау проводится с помощью автоматов, средняя производительность составляет 124 препарата за 30 минут. Автоматическое окрашивание препаратов по методу Романовского возможно проводить, используя автоматы-цитоцентрифуги, обрабатывающие более 100 стекол в час. Процесс включает в себя фиксацию, промывку и высушивание. Качество окрашивания не уступает ручным методам.

Выпускаются цитоцентрифуги со съемным ротором для окрашивания препаратов. Стекла помещают в устройство карусельного типа, которое вращается в камере для окрашивания. Монослойные препараты, полученные данным методом, сохраняют все типы клеток используемой суспензии, что сложно достичь при применении ручных методик.

3.8.Микроскопическое исследование морфологии клеток

Для получения правильной информации необходимо последовательное микроскопическое изучение всего цитологического препарата. Обзор цитологической картины проводят под малым увеличением (×10), детализацию выбранных объектов – под увеличением (×40) и/или под иммерсионным объективом (×100). Препарат исследуют методом «систематического перекрестного двухразового шага», который позволяет практически без пропуска изучить каждый миллиметр площади препарата. Цель исследования монослойных препаратов, полученных методом ЖЦ, – правильно оценить цитологическую картину, установить отсутствие или наличие патологических изменений, определить характер патологических изменений.

3.9.Описание цитограммы

Оценка цитологической картины состоит из описания соответствующих параметров и заключения, которое должно соответствовать утвержденной приказом Минздрава России форме направления на цитологическое исследование материала.

(Форма № 203/у–02 «Направление на цитологическое диагностическое исследование и результат исследования», утверждена приказом Минздрава России от 24.04.2003 г. № 174).

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

3.10. Установление цитологического диагноза

Результатом цитологического исследования материала, полученного методом ЖЦ, является обнаружение и характеристика клеточных элементов в препарате и формирование цитологического заключения (диагноза) в соответствии с общепринятыми стандартами [9].

Цитологическое заключение должно содержать следующие пункты:

•Метод приготовления препарата: указать, каким из способов ЖЦ приготовлен препарат (цитоцентрифуга, цитологический процессор, указать какой).

•Качество материала.

•Цитологическое заключение в соответствии с классификацией или,

вслучае невозможности постановки диагноза по имеющемуся материалу, описательное заключение или заключение в форме предположения.

•Примечание (при необходимости).

•Рекомендации (при необходимости).

Втрудных для диагностики случаях прибегают к консультации специалиста-морфолога профильного лечебно-профилактического учреждения.

3.11. Оценка правильности цитологического заключения

3.11.1.Сравнение цитологического заключения с гистологическим

Оценка правильности цитологического исследования проводится по совпадению цитологического заключения с гистологическим (патологоанатомическим) диагнозом. Результат цитологического исследования учитывается независимо от того, выражен он в утвердительной или предположительной форме. Это означает, что совпадением считается, если утвердительное или предположительное цитологическое заключение, совпадает с гистологическим. При новообразованиях совпадением считается установление цитологического диагноза по основной форме, даже если не указана или не совпадает степень дифференцировки опухоли.

Примечание. В ряде случаев утвердительный или предположительный цитологический диагноз может правильно верифицировать поражение, хотя гистологическое исследование не подтверждает цитологический диагноз (материал для гистологического исследования получен неудачно: не из очага поражения, материала недостаточно для полноценного гистологического исследования и т. п.).

Учитывается терминологическое соответствие или несоответствие установленного диагноза принятым цитологическим классификациям.

Выпуск 2

3.11.2.Контроль качества цитологического исследования препаратов, полученных методом жидкостной цитологии

Контроль качества цитологического исследования препаратов, полученных методом ЖЦ, выполняется путем участия в системе внешней оценки качества и внутрилабораторной оценки правильности заключения, которая должна осуществляться в лаборатории систематически. В настоящей технологии приводятся несколько способов контроля качества исследования.

А) 10% препаратов, полученных методом ЖЦ, пересматриваются разными специалистами других учреждений, результаты сравниваются, обсуждаются возникшие расхождения оценки цитологической картины. Такой подход уменьшает вероятность ошибок, связанных с субъективными факторами.

Б) В цитологической лаборатории проводится исследование контрольных препаратов, полученных методом ЖЦ, приготовленных экспертами ФСВОК. Сравниваются цитологические заключения сотрудников лаборатории и экспертов. При ошибочных заключениях обсуждение контрольного мазка проводится за микроскопом. В обсуждении участвуют отвечающий за качество исследований сотрудник и врач, проводивший исследование.

При необходимости (сложный диагностический случай) препараты, полученные данным методом, консультируют у специалиста-ци- топатолога профильного лечебно-профилактического учреждения. В обсуждении принимает участие заведующий лабораторией и все сотрудники.

В) Катамнестический контроль правильности проводят путем сопоставления заключения цитологической лаборатории с диагнозами, установленными пациентам при дальнейшем клиническом обследовании: при гистологическом исследовании; анализе историй болезни за несколько лет – для выявления расхождений окончательного клинического диагноза и цитологического заключения.

3.12. Регистрация заключений

Заключения регистрируют на бумажных и электронных носителях, которые хранят в лаборатории в течение 20 лет. Бланки с результатами цитологического исследования вклеивают в историю болезни, при использовании информационно-вычислительных систем (компьютерной техники) заключения вводят в электронную историю болезни.

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

3.13. Архивирование и утилизация цитологических препаратов

Препараты без патологических изменений сохраняются в течение 5 лет, после чего подвергаются специальной обработке (дезинфицирующими растворами) по правилам биологической безопасности. Препараты с патологическими изменениями или при подозрении на патологические изменения архивируются и хранятся в течение 20 лет, препараты с цитологической картиной злокачественного поражения – пожизненно. Архив цитологических препаратов формируют в соответствии с решением заведующего лабораторией. Препараты из архива должны выдаваться по письменному запросу лечащего врача или другого ответственного сотрудника лечебно-профилактическо- го учреждения. Контейнеры хранятся в течение времени, указанного производителем консерванта.

4.Трудозатраты на выполнение технологии

Таблица 2

Трудозатраты в УЕТ на выполнение стандартизованной аналитической технологии «Метод жидкостной цитологии» (1 УЕТ =10 мин)

*Затраты времени врача на цитологическое диагностическое исследование при приготовлении препарата методом жидкостной цитологии любого

Выпуск 2

другого материала (кроме материала гинекологических профилактических осмотров) равны утвержденным расчетным нормам времени (приказ МЗ РФ № 380 от 25.12.1997 г.) на исследование одного и каждого последующего препарата для соответствующего материала, затраты времени лаборанта для этих исследований включают только регистрацию и всю подготовительную работу (без микроскопии).

Литература

1.ГОСТ Р ИСО 15189-2009 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.

2.ГОСТ Р ИСО 52095-2007 (ИСО 15190:2003) Лаборатории медицинские. Требования безопасности.

3.«Правила устройства, техники безопасности и производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР», 1981 г.

4.Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения, МЗ РФ №МУ-287-113 от 30.12.1998 г.

5.СанПиН 2.1.3.2630-10 Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 18 мая 2010 г. № 58. «Санитарноэпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность».

6.Чепурная Ю. Ю. Клиническое значение жидкостной цитологии в диагностике заболеваний шейки матки. Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. Москва, 2004.

7.Савостикова М. В. Использование питательной среды накопления и применение жидкостной системы приготовления цитопрепаратов в цитологических и иммуноцитохимических исследованиях. Справочник «Заведующего КДЛ». № 8. 2010. С. 24.

8.Шабалова И. П., Касоян К. Т., Савостикова М. В. Жидкостная цитология в клинической практике (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. 2011. № 12. С. 25–32.

9.Шабалова И. П., Петровичев Н. Н. Сирьянен К. Ю. Оптимизация цитологической диагностики. Интерактивные программы и молекулярные исследования. Palmarium academic publishing, Германия, 2012.

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины