6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Стандартизация_аналитических_технологий_лабораторной_медицины_Выпуск

тером), дату и время сбора, характеристика образца (утренний или случайный), наличие в пробах консерванта (если его использовали, то указывают название реагента и его концентрацию), предварительный клинический диагноз, использованные АМП для лечения пациента, ФИО лечащего врача, назначившего исследование.

Сопроводительный документ. К каждой партии образцов мочи прилагают сопроводительный документ, в котором перечисляют количество направляемых в лабораторию образцов, их маркировку

исоответствие заявкам на исследование.

3.3.Оценка пригодности образца для исследования

После доставки образца мочи в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на исследование, маркировку посуды (код или фамилия больного и другие данные должны быть идентичны данным, указанным в бланке-направлении), ее целостность и зарегистрировать поступивший материал.

Не пригодными для исследования являются образцы:

––немаркированные или несущие неверную маркировку,

––без указания даты, времени и метода сбора мочи;

––собранные ранее 24 часов от момента доставки в лабораторию;

––при нарушении целостности и/или герметичности посуды (в т. ч. пролитые образцы);

––направленные с целью выделения анаэробных бактерий, за исключением образцов, полученных методом надлобковой пункции.

Вслучае непригодности доставленного образца мочи необходимо уведомить врача, назначившего исследование, и рекомендовать повторное взятие материала с соблюдением всех перечисленных выше правил. Образцы могут храниться в холодильнике (+4–6 °С) не более 24 часов до получения уточнений, не более 24 ч с момента взятия мочи.

Если повторное взятие таких образцов материала невозможно, при оформлении результата бактериологического исследования необходимо отразить возможность влияния нарушения правил преаналитического этапа на полученный результат.

3.4.Аналитический лабораторный этап

3.4.1.Методы предварительной оценки наличия бактерий в моче пациента

Данный метод используются для быстрого получения информации о наличии количества и типа бактерий в моче. К ним относятся: микроскопические методы и методы обнаружения продуктов метаболизма бактерий. Выполняются по заявке (запросу) лечащего врача

Выпуск 2

вэкстренных ситуациях как первый этап диагностического поиска, а также в качестве скрининга отдельных категорий пациентов и определения показаний для дальнейшего обследования. При рутинном бактериологическом анализе они не обязательны. Экспресс-методы не требуют участия высококвалифицированного персонала и специализированного оборудования, и могут выполняться как непосредственно

вЛУ, в клинико-диагностических лабораториях, так и в микробиологических лабораториях для оценки предварительных данных до получения результатов классического бактериологического исследования. Детальное описание методов представлено в Приложении 2.

3.4.2.Методы бактериологического (культурального) исследования мочи

Целью бактериологического исследования мочи является: выделение и идентификация возбудителя инфекции и определение его концентрации в образце мочи (степени бактериурии). Если сопоставление полученных результатов с данными анамнеза и клинического обследования пациента позволяет констатировать этиологическую значимость выделенного микроорганизма в развитии ИМП, далее определяют его чувствительность к АМП.

Для выделения бактерий из мочи применяют универсальные, селективные и дифференциально-диагностические питательные среды.

1.Техника посева Несекторный метод

––Для получения количественной интерпретации результатов бактериологического исследования мочи на чашку Петри с неселективной питательной средой нанести строго определенный объем исследуемого образца – в большинстве случаев 0,01 мл (табл. 1).

––Тарированную на соответствующий объем стерильную микробиологическую петлю, держа вертикально, поместить в хорошо перемешанный (но не центрифугированный!) исследуемый образец так, чтобы погруженной в жидкость оказалась только петля. В качестве альтернативы можно использовать микродозатор переменного объема и стерильный наконечник.

––Распределить материал по поверхности агара в центральной области в виде одной или нескольких прямых линий, а затем перпендикулярными им горизонтальными штрихами, отстоящими друг от друга на небольшое расстояние. В качестве альтернативы пробу можно распределить по поверхности среды шпателем Дригальского (вручную или в процессе вращения чашки Петри на платформе).

2.Дополнительным количеством материала инокулировать диффе- ренциально-диагностические среды для выделения энтеробакте-

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

рий и энтерококков и распределить по поверхности агара методом секторных посевов для получения изолированных колоний.

Примечание. Количественный посев для подсчета выросших колоний производится только на чашке Петри с неселективной средой. Селективные среды используются для получения изолированных колоний и первичной идентификации выросших микроорганизмов, но не для количественной оценки. Поэто-

му образец наносится на них не мерно.

3.Инокулированные чашки Петри инкубировать в условиях обычной атмосферы при 35–37 °С в течение 18–24 часов.

4.Учет результатов проводится после 18–24 часов инкубации. В следующих ситуациях следует продлить инкубацию до 48 часов:

––образец получен с использованием инвазивных методов (напр., надлобковой пункции);

––обнаруживается слабый рост микроорганизмов, не позволяющий оценить количество морфологических типов, произвести выделение чистой культуры и т. п.;

––результат не соответствует информации, полученной при микроскопии мазков, клиническим данным и пр.;

––исследуемый образец получен от пациентов с тяжелыми нарушениями иммунной системы (напр., у реципиентов при трансплантации органов);

––если одной из задач исследования является обнаружение грибов.

5.При обнаружении роста микроорганизмов произвести подсчет морфологических типов и количества выросших колоний для каждого типа с учетом объема исследуемой мочи (табл. 1).

Таблица 1

Определение степени бактериурии при использовании несекторного метода посева образца

Выпуск 2

6.Оценить этиологическое значение выросших микроорганизмов (п. 3.4.3).

7.Дальнейшая идентификация проводится только для вероятных уропатогенов. Для идентификации используются стандартные методы, внедренные в повседневную практику работы лаборатории, включающие: изучение культуральных, тинкториальных, биохимических и агглютинационных свойств в формате ручных методов или коммерческих панелей для визуального учета или для автоматических микробиологических анализаторов, а также масс-спектрометрический анализ белковых профилей выделенных микроорганизмов (MALDI TOF масс-спектрометрии) [13].

Минимальные идентификационные критерии для основных изолятов бактерий, обнаруживаемых при исследовании мочи, приведены

вПриложении 3.

3.4.3.Интерпретация результатов бактериологического

исследования мочи

При интерпретации результатов бактериологического исследования мочи следует учитывать следующие критерии:

––наличие клинических проявлений ИМП;

––соблюдение стандартных процедур взятия, транспортировки образца, культурального исследования (объем инокулированного образца и техника посева);

––результаты отдельных лабораторных исследований – количество патогенов (моноили смешанная культура), уропатогенность отдельных видов, частоту их выделения из мочи.

ИМП могут протекать в форме моно- и смешанных инфекций, при которых из мочи выделяют 1 или 2 вида патогенных бактерий соответственно. Обнаружение 3 и более различных морфологических типов колоний микроорганизмов должно рассматриваться как признак случайной контаминации исследуемой пробы. В таких случаях следует повторить исследование с максимально возможным соблюдением правил проведения всех этапов.

Возбудители ИМП

Патогенные бактерии, способные вызывать ИМП, подразделяют на 3 группы:

1.Первичные возбудители ИМП (группа I): Е. coli и S. saprophyticus, лептоспиры, сальмонеллы и микобактерии. Эти бактерии способны самостоятельно вызывать поражения органов мочевой системы. Е. coli выделяют в подавляющем большинстве случаев

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

ИМП (>75%). Частота изоляции S. saprophyticus значительно ниже (< 10%), но эта бактерия является основным возбудителем острого неосложненного цистита и пиелонефрита женщин. Лептоспиры, сальмонеллы и микобактерии обнаруживаются спорадически.

2.Вторичные возбудители ИМП (группа II): Enterobacter spp., Klebsiella spp., P. mirabilis, P. aeruginosa, P. vulgaris, S. aureus, Citrobacter spp., Morganella spp., Serralia spp., C. urealylicum, Haemophilus spp. и S. pneumoniae. Проявляют патогенные свойства преимущественно на фоне других инфекций, ослабления иммунитета, после инвазивных диагностических и лечебных процедур. Частота изоляции в таких случаях первых 4 из упомянутых бактерий варьирует от 1 до 10%, P. vulgaris, S. aureus, Citrobacler spp, Morganella spp, Serratia spp. – не превышает 1%, C. urealylicum, Haemophilus spp и S. pneumoniae – менее 0,1% (причем последние

2группы бактерий поражают преимущественно детей).

3.Сомнительные возбудители ИМП (группа III): коагулазонегативные стафилококки (за исключением S. saprophyticus), S. agalactiae, Acinetobacler spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia. Вызывают ИМП очень редко.

Обнаружение при бактериологическом исследовании мочи представителей нормальной микрофлоры уретры и периуретральной области – Gardnerella vaginalis, a-гемолитические стрептококки, лактобациллы, бифидобактерии и дифтероидные палочки не имеет диагностического значения.

Диагностически значимым титром патогенных бактерий в моче считают (табл. 2):

А. При исследовании 1 мкл проб, полученных при свободном мочеиспускании от пациентов с симптомами ИМП:

––для первичных патогенов (группа I) при изоляции их в моноили смешанной культуре с еще одной бактерией – ≥103 КОЕ/мл;

––для вторичных патогенов (группа II) при изоляции их от мужчин и женщин в монокультуре – 103 и 104 КОЕ/мл соответственно;

––для вторичных патогенов (группа II) при изоляции их в смешанной культуре с еще одной бактерией и сомнительных патогенов

(группа III) – ≥105 КОЕ/мл.

Б.При исследовании 10 мкл проб, полученных при свободном мочеиспускании от пациентов с симптомами ИМП:

––для первичных патогенов (группа I) при изоляции монокультуры – ≥102 КОЕ/мл.

Выпуск 2

В.При исследовании 100 мкл проб, полученных надлобковой пункцией (независимо от того, выражены или отсутствуют у пациентов симптомы ИМП):

––для всех групп бактерий, выделенных в моноили смешанной

(не более 2 видов) культуре – ≥101 КОЕ/мл;

Г.При исследовании 10 мкл проб, полученных цистоскопией или катетеризацией (независимо от того, выражены или отсутствуют у пациентов симптомы ИМП):

––для всех групп бактерий, выделенных в моноили смешанной (не более 2 видов) культуре – ≥102 КОЕ/мл.

Д.При исследовании 1 мкл проб, полученных из постоянного катетера:

––для всех групп бактерий, выделенных в моноили смешанной (не более 2 видов) культуре от пациентов с симптомами ИМП – ≥104 КОЕ/мл;

––для всех групп бактерий, выделенных в моноили смешанной (не более 2 видов) культуре от пациентов без клинических проявлений ИМП – ≥105 КОЕ/мл.

Таблица 2

Интерпретация результатов бактериологического анализа мочи

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

3.4.4.Определение чувствительности выделенных возбудителей к АМП

Проводят в соответствии с действующими нормативными документами (МУК 4. 2. 1890–04) [12].

4.Регистрация результатов бактериологического анализа мочи

Результаты бактериологического анализа мочи регистрируют в лаборатории в унифицированной форме бланка. Она должна содержать название лаборатории и медицинской организации; информацию о пациенте, достаточную для его идентификации; название биологического материала и всех исследуемых показателей; дату получения пробы и, если это необходимо, время получения; результаты исследования; референтные интервалы; фамилию и подпись сотрудника, выполнившего исследование. Порядок выдачи результатов должен быть определен инструкцией, утвержденной руководителем медицинской организации. Все отказы от выполнения исследования мочи необходимо регистрировать (с указанием их причин).

5.Обеспечение качества бактериологического анализа мочи

5.1.Программы обеспечения качества

Программы обеспечения качества включают последовательный мониторинг каждого аспекта процедуры для гарантии получения достоверных и воспроизводимых результатов бактериологического анализа мочи. Такие программы должны включать все этапы работы и устанавливать связь между всеми составляющими процесса (пациент, лаборатория, клиницист). Проведение контроля качества лабораторных исследований, заключающегося в тестировании контрольных материалов (внутрилабораторный контроль качества и участие во внешней оценке), является только одним из аспектов обеспечения качества. Контроль необходим на этапах сбора, хранения, доставки и ручной обработки проб мочи, ведения регистрации, выдачи документов. Техническая компетентность персонала нуждается в контроле, непрерывном продолжении образования. Для успешного осуществления всех контрольных мероприятий необходимо следовать правилам, изложенным в стандарте ГОСТ Р ИСО 15189–2006 «Медицинские лаборатории – частные требования к качеству и компетентности» [14].

Выпуск 2

В соответствии с требованиями этого стандарта в лаборатории составляется «Руководство по качеству», в котором должны быть отражены все мероприятия, обеспечивающие качественный бактериологический анализ мочи.

В бактериологических лабораториях определяют обоснованные критерии приема и отказа в приеме проб, требования по их регистрации, обработке, маркировке и хранению до анализа. Аналитический этап проводят в соответствии с методиками исследований. На постаналитическом этапе необходимо разработать правила оценки приемлемости результатов анализа, включающие проверку их аналитической достоверности по данным внутрилабораторного контроля качества, оценку возможного влияния лекарственных препаратов, сравнение результатов с референтным интервалом, проверку правильности регистрации. Форму выдачи результатов утверждает руководство учреждения после согласования с лечебными отделениями.

5.2.Контроль качества бактериологических исследований

5.2.1.Контроль качества материалов и оборудования

Контроль качества материалов и оборудования должен охватывать:

––условия хранения и соблюдение сроков годности реактивов, диагностических полосок, питательных сред, приспособлений для бактериологического анализа мочи, что предотвращает использование испорченных или просроченных средств и материалов, являясь важной составляющей обеспечения качества;

––наличие на рабочем месте инструкции по применению приспособлений и эксплуатации необходимой для проведения исследований аппаратуры;

––наличие журналов регистрации сервисного обслуживания и ремонта оборудования.

5.2.2.Внутрилабораторный контроль качества бактериологического анализа мочи

Существует два основных вида контроля качества лабораторных исследований: внутрилабораторный контроль и внешняя оценка качества. Внутрилабораторный контроль представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых в лаборатории результатов. Контроль качества микроскопических исследований выполняют в тот же день, когда проводят исследования. Для контроля

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

воспроизводимости результатов исследований тестируют дубликаты тех же проб мочи.

Внешняя оценка качества необходима для подтверждения правильности результатов лабораторных исследований и сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях. Все бактериологические лаборатории обязаны участвовать во внешней оценке качества. Специальными организациями, имеющими лицензию на проведение межлабораторной оценки качества выполнения лабораторных исследований, в т. ч. анализа мочи, между лабораториями периодически (несколько раз в год) распределяются контрольные образцы с установленным содержанием бактерий для контроля правильности проводимых анализов. Полученные результаты регистрируют и заключения возвращают в лаборатории для сравнительной оценки правильности выполнения исследований. В случае неудовлетворительной оценки результатов лаборатория должна принимать соответствующие меры для исправления ошибок.

5.3.Образование специалистов

Квалификация персонала бактериологической лаборатории должна соответствовать сложности выполняемого исследования. Весь персонал лаборатории должен периодически (раз в пять лет) проходить обучение на циклах усовершенствования, которые проводятся медицинскими образовательными учреждениями, имеющими соответствующую лицензию. Специалистам следует регулярно заниматься самообразованием. В лаборатории должна быть доступна для пользования современная литература, в т. ч. справочники, периодические издания по лабораторной диагностике и атласы. Специалистам лаборатории необходимо участвовать в конференциях и семинарах.

Все этапы бактериологического анализа мочи должен выполнять только специально обученный персонал.

6.Требования к режиму труда и отдыха, диете и ограничениям при подготовке пациента

к сбору мочи для проведения бактериологического анализа мочи

На результаты бактериологического анализа мочи могут влиять прием пациентом лекарственных препаратов, соблюдение правил сбора мочи и ряд других факторов. Поэтому условия подготовки пациента к сбору проб мочи должны быть стандартизованы и подробно описаны в соответствующей инструкции для пациента.

Выпуск 2

7.Затраты труда на выполнение технологии «Бактериологический анализ мочи» учитываются в соответствии с нормативами, утвержденными приказами Минздрава РФ от 19 января 1995 г. № 8 и от 25 декабря 1997 г. № 380

Приложение 1

Применение специальных приспособлений для бактериологического анализа мочи. Эти приспособления по способу посева проб делят на погружные (дипслайды) и штриховые (дипстрики, диаслайды). Они состоят из 1–2 подложек, покрытых с обеих сторон 2–3 питательными средами. Подложки хранят, транспортируют и инкубируют в стерильном контейнере. В качестве питательных сред в них используют CLED, МакКонки, колумбийский CNA агар, Uriselect 3 или другую хромогенную среду. Их комбинация в одном приспособлении обеспечивает выделение и идентификацию находящихся в моче бактерий с одновременной полуколичественной оценкой их титра.

Дипслайд не имеет специального посевного механизма – подложку с питательными средами погружают в тестируемую пробу мочи, а затем возвращают в контейнер. При высокой (>106 КОЕ/мл) концентрации бактерий такой посев не позволяет избежать сливного («газонного») роста, что затрудняет или делает невозможными определение морфологии выросших колоний и дифференциацию моноинфекций от смешанных инфекций.

В дипстрике реализован штриховой метод посева с помощью работающего автоматически посевного приспособления. Он состоит из кольца с 6 зубцами (по 3 с каждой стороны подложки). При погружении в мочу нижней части зубцов на каждом из них остается по 1,0– 1,2 мкл мочи. Во время возвращения подложки в контейнер кольцо фиксируется на его горловине, обеспечивая дозированный штриховой посев.

Диаслайд основан на том же принципе, но имеет другую конструкцию. Он представляет собой плоский прямоугольный контейнер, на раскрывающихся створках которого залиты питательные среды. Посев осуществляют пластинкой с погружаемыми в пробу усиками – для этого ее вытягивают из контейнера, что сопровождается штриховым посевом.

Наиболее точные результаты получают при помещении этих приспособлений в термостат сразу же после посева. При отсутствии такой возможности (при проведении посева мочи в месте ее сбора

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины