6 курс / Клинические и лабораторные анализы / ИФА_диагностика_сифилиса_Ткачёв_В_К_,_Вяткина_Т_Г_

ЗАО «Вектор-Бест»

В.К. Ткачёв Т.Г. Вяткина

ИФА-диагностика сифилиса

Информационно-методическое пособие

3-е издание, переработанное и дополненное

Кольцово

2005

ББК 28

Т48

Уважаемые коллеги!

Впоследниегодыиммуноферментныйанализзанял устойчивое положение среди других методов серологи- ческой диагностики сифилиса и прочно вошел в пов- седневную медицинскую практику во многих регионах России. В данной брошюре мы попытались ответить на некоторые вопросы, которые наиболее часто возни- кают у специалистов, занимающихся­ диагностикой сифилиса.

Ткачёв Вячеслав Константинович, директор по производству ЗАО «Вектор-Бест»

Вяткина Тамара Геннадьевна, начальник отделения ИФА сифилиса ЗАО «Вектор-Бест»

630128, г. Новосибирск, а/я 102, ЗАО «Вектор-Бест»тел.: (383) 2276-030, 3328-134тел./факс: (383) 3329-444

Т48 Ткачёв В.К., Вяткина Т.Г.

ИФА-диагностика сифилиса. Информационно-методическое пособие. 3-е издание, переработанное и дополненное – г. Новосибирск: ЗАО «Вектор-Бест». 2005. – 48 с.

© ЗАО «Вектор-Бест», 2005

ВВЕДЕНИЕ

Забо­ ле­ ва­ е­ мость­ инфек­ ци­ я­ ми­ , пере­ да­ ва­ е­ мы­ ми­ поло­ вым­ путем­ (ИППП), среди­ кото­ рых­ нема­ лая­ доля­ при­над­ ле­ жит­ сифи­ ли­ су­ , во всем мире­ продол­ жа­ ет­ расти­ . Россия­ в этом смыс­ле­ не явля­ ет­ ся­ иск­ лю­ че­ ни­ ем­ . Дос­та­ то­ ч­ но­ вспомнить­ 1997 год, ко­гда­ уровень­ забо­ ­ лева­ е­ мо­ сти­ сифи­ ли­ сом­ в РФ дос­тиг­ ката­ ст­ ро­ фи­ че­ с­ких­ разме­ ров­ . В пос­ле­ ду­ ю­ щие­ годы­ наме­ ти­ лись­ неко­ то­ рые­ поло­ жи­ тель­ ные­ тен­ денции­ : забо­ ле­ ва­ е­ мость­ сифи­ ли­ сом­ нача­ ла­ снижать­ ся­ , дос­тиг­ нув­ в 2002 году­ 119,5 случа­ ев­ на 100 тыс. на­селе­ ния­ . Одна­ ко­ эпиде­ ми­ ­ оло­ ги­ че­ с­кая­ ситу­ а­ ция­ по сифи­ ли­ су­ по-преж­ не­ му­ оста­ ет­ ся­ трево­ ж­ ­ ной. При этом в пос­лед­ ние­ деся­ ти­ ле­ тия­ во всём мире­ отме­ ча­ ет­ ся­ увели­ че­ ние­ доли­ бессим­ птом­ но­ го­ сифи­ ли­ са­ и сифи­ ли­ са­ со стёртой­ клини­ че­ с­кой­ карти­ ной­ , что в коне­ ч­ ном­ итоге­ приво­ дит­ к рос­ту­ поздних­ форм забо­ ле­ ва­ ния­ , таких­ как вис­це­ раль­ ный­ сифи­ лис­ и нейро­ си­ фи­ лис­ .Втаких­ усло­ ви­ ях­ по-преж­ не­ му­ акту­ аль­ ной­ оста­ ет­ ся­ проб­ ле­ ма­ эффе­ к­ тив­ ной­ диаг­ но­ сти­ ки­ данно­ го­ забо­ ле­ ва­ ния­ . Особая­ рольприэтомдолж­ на­ отво­ дить­ ­сямето­ ­даммассо­ ­вого­ про­фила­ к­ ти­ че­ ­ ско­ го­ обсле­ до­ ва­ ния­ насе­ ле­ ния­ (скринин­ га­ )сцелью­ ранне­ го­ выяв­ ле­ ­ ния инфек­ ции­ , что дик­ ту­ ет­ необ­ хо­ ди­ мость­ повы­ ше­ ния­ требо­ ва­ ний­ к чувст­ ви­ тель­ но­ сти­ скринин­ го­ вых­ тес­тов­ на сифи­ лис­ . Кроме­ того­ , в связи­ со слож­ ным­ эконо­ ми­ че­ с­ким­ поло­ же­ ни­ ем­ в стране­ опас­ная­ ситу­ а­ ция­ сложи­ лась­ вслужбе­ крови­ :опла­ та­ крово­ да­ чи­ стиму­ ли­ ру­ ет­

вовле­ че­ ние­ в контин­ гент­ доно­ ров­ группы­ лиц с по­вышен­ ным­ ри­с­ ком забо­ ле­ ва­ ний­ , пере­ да­ ю­ щих­ ся­ поло­ вым­ путем­ . Пре­дуп­ ре­ ж­ де­ ние­ пере­ да­ чи­ возбу­ ди­ те­ ля­ сифи­ ли­ са­ с компо­ нен­ та­ ми­ крови­ – важ­ ная­ состав­ ная­ часть проб­ ле­ мы­ профи­ ла­ к­ ти­ ки­ гемо­ тран­ с­мис­ сив­ ных­ ин­ фекций­ . В на­стоя­ щее­ вре­мя в пра­кти­ ке­ служ­бы кро­ви ши­роко­ ис­ пользу­ ют­ ся­ высо­ ко­ чув­ ст­ ви­ тель­ ные­ испеци­ фи­ ч­ ные­ диаг­ но­ сти­ че­ с­кие­ тес­ты­ на сифи­ лис­ . Ак­туаль­ ной­ зада­ чей­ сего­ д­ няш­ не­ го­ дня оста­ ет­ ся­ повсе­ ме­ ст­ ное­ внедре­ ние­ тех же тес­тов­ в пра­кти­ ку­ серо­ ло­ ги­ че­ с­ких­ лабо­ ра­ то­ рий­ дерма­ то­ ве­ не­ ро­ ло­ ги­ че­ с­кой­ службы­ .

Суще­ ст­ ву­ ю­ щие­ на отече­ ст­ вен­ ном­ рынке­ диаг­ но­ сти­ че­ с­ких­ средств им­муно­ фер­ мент­ ные­ тест-си­сте­ мы­ для выяв­ ле­ ния­ анти­ ­ трепо­ нем­ ных­ анти­ тел­ в сыво­ рот­ ке­ (плазме­ ) крови­ и лик­ во­ ре­ сего­ ­ дня­ прихо­ дят­ на смену­ либо­ встают­ в один ряд с тради­ ци­ он­ ны­ ми­ класси­ че­ с­ки­ ми­ мето­ да­ ми­ серо­ ди­ аг­ но­ сти­ ки­ сифи­ ли­ са­ .

3

АНТИТЕЛООБРАЗОВАНИЕ ПРИ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

Дина­ ми­ ка­ анти­ те­ ло­ об­ ра­ зо­ ва­ ния­ при сифи­ ли­ се­ изуче­ на­ дос­та­ то­ ч­ но­ хо­рошо­ .Первы­ ­мипо­сле­ зара­ же­ ­ниявы­раба­ ­тыва­ ­ют­сяим­му­ног­лобу­ ­ли­ ны М, вы­явля­ е­ мые­ в опре­ де­ ля­ е­ мых­ ко­личе­ ст­ вах­ на второй­ неде­ ле­ идос­ти­ га­ ю­ щие­ мак­ си­ маль­ ной­ концен­ т­ра­ ции­ вкрови­ на6—9неде­ ле­ [1]. Затем­ концен­ т­ ра­ ция­ их да­же без ле­чения­ на­чина­ ет­ снижать­ ся­ вследст­ вие­ заме­ ны­ их имму­ ног­ ло­ бу­ ли­ на­ ми­ класса­ G, дос­ти­ гая­ с те­ чени­ ем­ време­ ни­ подпо­ ро­ го­ во­ го­ уровня­ . Реци­ див­ забо­ ле­ ва­ ния­ или пов­ тор­ ное­ зара­ же­ ние­ приво­ дят­ кново­ му­ нара­ с­та­ нию­ концен­ т­ра­ ции­ IgM, причем­ в слу­чае реци­ ди­ ва­ ан­тите­ ла­ этого­ клас­са час­то­ выра­ ­ баты­ ва­ ют­ ся­ даже­ в бо­лее высо­ ких­ концен­ т­ ра­ ци­ ях­ , чем при пер­ви­ чном­ инфи­ ци­ ро­ ва­ нии­ . Пос­ле­ прове­ де­ ния­ эффе­ к­ тив­ но­ го­ лече­ ния­ концен­ т­ ра­ ция­ IgM быст­ ро­ па­дает­ , и, обы­чно­ , через­ 3—9 меся­ цев­ они пере­ ста­ ют­ опре­ де­ лять­ ся­ в сыво­ рот­ ке­ крови­ [2].

Имму­ ног­ ло­ бу­ ли­ ны­ G в опре­ де­ ля­ е­ мых­ коли­ че­ ст­ вах­ поя­ в­ ля­ ­ ются­ в крови­ через­ 3—4 неде­ ли­ от момен­ та­ инфи­ ци­ ро­ ва­ ния­ . Кон­ цент­ ра­ ция­ их нара­ с­та­ ет­ , на 6-ой неде­ ле­ начи­ на­ ет­ преоб­ ла­ дать­ над концен­ т­ ра­ ци­ ей­ IgM, и, дос­ти­ гая­ ма­кси­ му­ ма­ , сохра­ ня­ ет­ ся­ на опре­ де­ лен­ ном­ уров­не в тече­ ние­ длитель­ но­ го­ вре­мени­ . Пос­ле­ про­ веде­ ния­ эффе­ к­ тив­ но­ го­ лече­ ния­ концен­ т­ ра­ ция­ имму­ ног­ ло­ бу­ ли­ нов­ посте­ пен­ но­ снижа­ ет­ ся­ , но проис­ хо­ дит­ это гора­ з­до­ мед­ лен­ нее­ , чем в случае­ с IgM. Как прави­ ло­ , IgG в опре­ де­ ля­ е­ мых­ ко­личе­ ст­ вах­ мо­ гут обна­ ру­ жи­ вать­ ся­ спус­тя­ год и более­ пос­ле­ прове­ ден­ ной­ тера­ пии­ , а в отдель­ ных­ случа­ ях­ – даже­ спус­тя­ деся­ ти­ ле­ тия­ .

У ново­ ро­ ж­ ден­ но­ го­ первые­ анти­ те­ ла­ так­же отно­ сят­ ся­ к клас­су иммуног­ ло­ бу­ ли­ нов­ М [3]. Изве­ ст­ но­ , что при инфи­ ци­ ро­ ва­ нии­ пло­ да они могут­ синте­ зи­ ро­ вать­ ся­ , на­чиная­ с 3 меся­ ца­ бере­ мен­ но­ сти­ , а ин­фици­ ро­ ва­ ние­ может­ произой­ ти­ на лю­бой стадии­ ; пассив­ но­ же пере­ не­ сен­ ные­ через­ плацен­ ту­ мате­ рин­ ские­ имму­ ног­ ло­ бу­ ли­ ны­ G у здоро­ ­во­го неин­ фи­ ци­ ­ро­ван­ного­ ре­бен­ка ка­табо­ ­ли­зиру­ ­ются­ и исче­ ­ зают­ только­ через­ 12—18 меся­ цев­ [4]. Принци­ пи­ аль­ ных­ отли­ чий­ в дина­ ми­ ке­ анти­ те­ ло­ об­ ра­ зо­ ва­ ния­ при си­фили­ се­ у детей­ в ли­тера­ ­ туре­ не встреча­ ет­ ся­ .

4

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СЕРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Дейст­ ­ву­ю­щий приказ­ Мини­ ­стер­ст­ва Здраво­ ­ох­ра­не­ния РФ № 87 от 26 мар­та 2001 года­ «О совер­ ­шен­ст­во­ва­нии серо­ ­ло­ги­че­с­кой ди­ агно­ ­сти­ки сифи­ ­ли­са» пред­ ­у­сма­т­ри­ва­ет исполь­ ­зо­ва­ние для серо­ - и лик­ ­вор­ди­аг­но­сти­ки сифи­ ­ли­са следу­ ­ю­щих реак­ ­ций:

• Мик­ ­ро­ре­ак­ция преци­ ­пи­та­ции (МР) с карди­ ­о­ли­пи­но­вым анти­ ­ге­ ном.

• Имму­ ­но­фер­мент­ный анализ­ (ИФА).

• Реак­ ­ция пассив­ ­ной гемаг­ ­г­лю­ти­на­ции (РПГА).

• Реак­ ­ция имму­ ­ноф­лю­о­рес­цен­ции (РИФ) в моди­ ­фи­ка­ци­ях.

• Комп­ ­лекс серо­ ­ло­ги­че­с­ких реак­ ­ций на сифи­ ­лис (КСР), состо­ ­я­ щий из реак­ ­ции связы­ ­ва­ния комп­ ­ле­мен­та (РСК) с трепо­ ­нем­ным и карди­ ­о­ли­пи­но­вым анти­ ­ге­на­ми и МР.

• Реак­ ­ция иммо­ ­би­ли­за­ции бледных­ трепо­ ­нем (РИТ).

При этом не­трепо­ ­нем­ные тес­­ты (МР и РСК с кар­дио­ ­ли­пи­но­ вым анти­ ­ге­ном) исполь­ ­зу­ют­ся лишь как отбо­ ­ро­ч­ные, в то время­ как трепо­ ­нем­ные тес­­ты служат­ для подтвер­ ­жде­ния их резуль­ ­та­тов. Трепо­ ­нем­ные тес­­ты обла­ ­да­ют более­ высо­ ­ки­ми чувст­ ­ви­тель­но­стью (РИФ) и специ­ ­фи­ч­но­стью (РИФ, РИТ), но техни­ ­че­с­ки слож­ ­ны, поэ­­то­му их при­мене­ ­ние огра­ ­ни­че­но рамка­ ­ми специ­ ­а­ли­зи­ро­ван­ ных учре­ ­ж­де­ний. Реак­ ­ции с карди­ ­о­ли­пи­но­вым анти­ ­ге­ном при прос­­то­те их поста­ ­нов­ки, отно­ ­си­тель­ной деше­ ­виз­не, удобст­ ­ве для иссле­ ­до­ва­ния большо­ ­го коли­ ­че­ст­ва образ­ ­цов имеют­ суще­ ­ст­вен­ное огра­ ­ни­че­ние–низ­­куючувст­ ­ви­тель­ностьприперви­ ­ч­ном,трети­ ­ч­ном и позднем­ ла­тентном­ сифи­ ­ли­се, а так­же на­личие­ ло­жно­ ­по­ло­жи­ тельных­ резуль­ ­та­тов [5]. По имею­ ­щим­ся литера­ ­тур­ным данным­ чувст­ ­витель­ ­ность кар­дио­ ­липи­ ­но­вых тес­­тов при пер­вич­ ­ном си­ фили­ ­се, напри­ ­мер, соста­ ­в­ля­ет около­ 70% [6]. Высокий­ процент­ лож­ ­но­по­ло­жи­тель­ных резуль­ ­та­тов карди­ ­о­ли­пи­но­вые тес­­ты дают­ при обсле­ ­до­ва­нии бере­ ­мен­ных женщин­ , по неко­ ­то­рым данным­ – до 27% от обще­ ­го коли­ ­че­ст­ва поло­ ­жи­тельных резуль­ ­та­тов [7]. Кроме­ того­ , лож­ ­но­по­ло­жи­тель­ные результа­ ­ты могут­ быть вызва­ ­ ны забо­ ­ле­ва­ни­я­ми соеди­ ­ни­тель­ной ткани (таки­ ­ми как сис­­тем­ная крас­­ная волчан­ ка­ ), диа­ ­бе­том, возрас­ ­тными­ изме­ ­не­ни­я­ми, онко­ ­ло­ гиче­ ­с­ки­ми забо­ ­ле­ва­ни­я­ми и другими­ [8].

Трепо­ ­нем­ныетес­­ты(РИФи,особен­ ­но,РСК)также­ могут­ давать­ лож­ ­но­по­ло­жи­тель­ные ре­зульта­ ­ты, обу­слов­ ­лен­ные пере­ ­крё­ст­ны­ми реак­ ­ци­я­ми.Пока­ ­за­но,напри­ ­мер,чтовРИФонимогут­ бытьсвяза­ ­ны

5

сборре­ ­ли­о­зом, гени­ ­таль­ным простым­ гер­песом­ [9, 10]. Кроме­ того­ , причи­ ­ной лож­ ­но­по­ло­жи­тель­но­го резуль­ ­та­та может­ быть нали­ ­чие в ис­следу­ ­е­мом об­разце­ ан­тител­ к общим­ анти­ ­ге­нам спиро­ ­хет, так как неко­ ­то­рые спиро­ ­хе­ты явля­ ­ют­ся частью­ нормаль­ ­ной чело­ ­ве­че­с­ кой флоры­ [11].

Суще­ ­ст­вен­нымнедо­ ­с­тат­комвсехпере­ ­чи­с­лен­ныхкласси­ ­че­с­ких тес­­тов (в оте­чест­ ­вен­ном ва­риан­ ­те) явля­ ­ет­ся то, что они не уни­фи­ циро­ ­ва­ны. Приоб­ ­ре­тая или полу­ ­чая разли­ ­ч­ные компо­ ­нен­ты, необ­ ­ ходи­ ­мые для про­веде­ ­ния ана­лиза­ , специ­ ­а­ли­сты диаг­ ­но­сти­че­с­кой лабо­ ­ра­то­рии выну­ ­ж­де­ны само­ ­сто­я­тель­но «подти­ ­т­ро­вы­вать» их, подби­ ­ратьсоот­ ­вет­ст­ву­ю­щиеконт­ ­роль­ныесыво­ ­рот­киит.д.Приэтом точ­ ­ность прово­ ­ди­мо­го анали­ ­за зави­ ­сит от множе­ ­ст­ва фак­ ­то­ров, на­ чиная­ от каче­ ­ства­ приоб­ ­ре­тённых­ реа­ ­ген­тов и закан­ ­чи­вая уровнем­ квали­ ­фи­ка­ции персо­ ­на­ла ла­бора­ ­то­рии.

Единст­ ­вен­ныйпутьпреодо­ ­ле­нияданно­ ­гонедо­ ­с­тат­ка–выпуск­ коммер­ ­че­с­ких тест-сис­­тем. За рубе­ ­жом в меди­ ­цин­ской практи­ ­ке давно­ иус­пешно­ исполь­ ­зу­ют­сяком­мерче­ ­с­киена­боры­ дляпо­станов­ ­ ки ре­акций­ RPR и VDRL (ана­логи­ нашей­ МР), а также­ FTA-ABS (аналог­ РИФабс). Сов­ ­сем недав­ ­но поя­ ­ви­лась пер­вая отече­ ­ст­вен­ная коммер­ ­чес­­кая тест-сис­­тема­ для опре­ ­деле­ ­ния анти­ тре­ по­ ­немных­ ан­ тител­ в реак­ ­ции имму­ ­ноф­лю­о­рес­цен­ции в моди­ ­фи­ка­ци­ях РИФабс и РИФ200 (ЗАО «Вектор-Бест»), кото­ ­рая нахо­ ­дит­ся на реги­ ­ст­ра­ции в МЗ РФ.

Внасто­ ­я­щее время­ в отече­ ­ст­вен­ной прак­ ­ти­ке, кроме­ пере­ ­ чис­­лен­ных выше­ реак­ ­ций, широ­ ­ко приме­ ­ня­ют­ся и другие­ тес­­ты, в част­ ­но­сти – реак­ ­ции, осно­ ­ван­ные на гемаг­ ­г­лю­ти­на­ции (реак­ ­ция пассив­ ­ной гемаг­ ­г­лю­ти­на­ции (РПГА) или её за­рубе­ ­ж­ные анало­ ­ги – the T. pallidum hemagglutination assay (TPHA) и др.), а также­ имму­ ­но­фер­мент­ный анализ­ (ИФА). Явля­ ­ясь специ­ ­фи­че­с­ки­ми трепо­ ­нем­ны­ми тес­­та­ми и обла­ ­дая высо­ ­ки­ми чувст­ ­ви­тель­но­стью и специ­ ­фи­ч­но­стью, они легко­ выпол­ ­ня­ют­ся, не требу­ ­ют высо­ ­кой про­ фесси­ ­о­наль­ной подго­ ­тов­ки персо­ ­на­ла и могут­ быть исполь­ ­зо­ва­ны при обсле­ ­до­ва­нии боль­шого­ коли­ ­че­ст­ва об­разцов­ . За ру­бежом­ эти тес­­тыширо­ ­коиуспеш­ ­ноисполь­ ­зу­ют­сядляскринин­ ­гаидиаг­ ­но­сти­ки сифи­ ­ли­са.Одна­ ­комногие­ иссле­ ­до­ва­те­лиотмеча­ ­ютболее­ низ­­куюпо сравне­ ­ниюсРИФабсчувст­ ви­ ­тель­ностьРПГАнаранних­ стади­ ­яхза­ боле­ ­ва­ния[1;2].Ещеодним­ недо­ ­с­тат­комэтого­ мето­ ­да,посравне­ ­нию

сИФА,явля­ ­ет­сясубъе­ ­к­тив­ностьвоценке­ резуль­ ­та­тов.Попыт­ ­киав­ тома­ ­ти­зи­ро­ватьучетрезуль­ ­та­товприве­ ­дутксниже­ ­ниюдос­­туп­но­сти

6

этого­ тес­­та для мел­ких лабо­ ­ра­то­рий. По чувст­ ­ви­тель­но­сти и специ­ ­ фич­ ­но­сти прово­ ­ди­мо­го анали­ ­за ИФА-тес­­ты наи­более­ прибли­ ­жены­ к РИФабс, кото­ ­рая до сих пор счита­ ­ет­ся «золо­ ­тым стандар­ ­том» при испы­ ­та­нии новых­ мето­ ­дов диаг­ ­но­сти­ки сифи­ ­ли­са. В то же вре­мя, рабо­ ­тасИФА-тест-сис­­те­ма­минетребу­ ­етвысо­ ­койпрофес­ ­си­о­наль­ной подго­ ­тов­ки специ­ ­а­ли­стов, так как диаг­ ­но­сти­че­с­кие набо­ ­ры, пред­ лага­ ­е­мые произ­ ­во­ди­те­ля­ми, уком­пле­ ­к­то­ва­ны всеми­ мате­ ­ри­а­ла­ми и реа­ ­ген­та­ми, не­обхо­ ­ди­мы­ми для поста­ ­нов­ки реак­ ­ции, в отти­ ­т­ро­ ванном­ ви­де. Кроме­ того­ , все ИФА-тест-сис­­те­мы предусматривают авто­ ­ма­ти­че­с­кий учёт ре­зульта­ ­тов, что ис­клю­ ­ча­ет субъ­ек­ ­тив­ность в ихоценке­ .Отно­ ­си­тель­наядеше­ ­виз­на,прос­­то­тапоста­ ­нов­киреак­ ­ции, удобст­ ­во исполь­ ­зо­ва­ния для обсле­ ­до­ва­ния большо­ ­го коли­ ­че­ст­ва образ­ ­цов поз­­во­ля­ют приме­ ­нять тест-сис­­те­мы для серо­ ­ди­аг­но­сти­ки сифи­ ­ли­са ме­тодом­ ИФА как скри­нинго­ ­вые, обла­ ­да­ю­щие, в то же время­ , высо­ ­ки­ми диаг­ ­но­сти­че­с­ки­ми каче­ ­ст­ва­ми.

Приказ­ № 87 предпи­ ­сы­ва­ет приме­ ­не­ние МР лишь в каче­ ­ст­ве отбо­ ­ро­ч­но­го тес­­та при обсле­ ­до­ва­нии насе­ ­ле­ния на сифи­ ­лис, а в ко­ личе­ ­ст­вен­ном вари­ ­ан­те и для конт­ ­ро­ля эффе­ ­к­тив­но­сти лече­ ­ния, заме­ ­нив ею ко­личе­ ­ст­вен­ную поста­ ­нов­ку РСК с кар­дио­ ­ли­пи­но­вым анти­ ­ге­ном. В каче­ ­ст­ве отбо­ ­ро­ч­ных тес­­тов для профи­ ­ла­к­ти­че­с­ко­го обсле­ ­до­ва­ния насе­ ­ле­ния мож­ ­но также­ исполь­ ­зо­вать КСР и специ­ ­ фиче­ ­с­кие трепо­ ­нем­ные реак­ ­ции – ИФА и РПГА.

РИТ, РИФ, ИФА и РПГА, явля­ ­ясь высо­ ­ко­чув­ст­ви­тель­ны­ми и высо­ ­ко­спе­ци­фи­ч­ны­ми реак­ ­ци­я­ми, приме­ ­ня­ют­ся в каче­ ­ст­ве диаг­ ­ ности­ ­че­с­ких подтвер­ ­жда­ю­щих тес­­тов.

Приобсле­ ­до­ва­ниидоно­ ­ровнеоб­ ­хо­ди­моисполь­ ­зо­ватькомп­ ­лекс серо­ ­ло­ги­че­с­ких реак­ ­ций, включа­ ­ю­щий МР и РСК ли­бо МР и ИФА, либо­ МР и РПГА.

Придиаг­ ­но­сти­кескрыто­ ­госифи­ ­ли­санеоб­ ­хо­ди­моосуще­ ­ст­в­лять поста­ ­нов­ку двух специ­ ­фи­че­с­ких тес­­тов одно­ ­вре­мен­но.

Посколь­ ­ку ИФА и РПГА яв­ляют­ ­ся более­ высо­ ­ко­чув­ст­ви­тель­ ными­ , специ­ ­фи­че­с­ки­ми и воспро­ ­из­во­ди­мы­ми тес­­та­ми, кото­ ­рые мож­ ­но исполь­ ­зо­вать в ка­чест­ ­ве отбо­ ­ро­ч­ных и подтвер­ ­жда­ю­щих те­ стов­ , предпо­ ­ла­га­ет­ся осуще­ ­ст­вить до 2006 года­ заме­ ­ну комп­ ­ле­к­са серо­ ­ре­ак­ций (КСР) выше­ ­ука­зан­ны­ми реак­ ­ци­я­ми при диаг­ ­но­сти­ке сифи­ ­ли­са [12].

7

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ИФА

ВосновеметодаИФАлежитследующийпринцип:натвердофаз­ ном­ носителе (в отечественных тест-системах и в большинстве тест-сис- тем зарубежного производства в качестве носителя используется повер­ х­ ность­ лунокполистироловогопланшета)фиксируетсяантиген возбу­ дителя­ инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твёрдого носителя, принято называть иммуносорбентом. Как правило, в состав набора тест-системы входит уже готовый имму­ носорбент­ . Схема иммунологической реакции, которая­ происходит­ в лунках планшета при проведении анализа, предс­тавлена­ на рис. 1. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой­ при наличии в ней антител к данному антигену проис­ходит­ их связывание в комплекс «антиген–антитело». После уда­ле­ния несвя­зав­шихся им­му­ногло­ ­ булинов следует инкубация с мечеными ферментом антителами­ к иммуноглобулинам­ человека (конъюгатом), в ходе которой

Рис. 1. Схема иммуноферментного анализа на иммуноглобулины класса G (IgG).

1 – носитель (поверхность лунки планшета);

2 – антиген;

3 – специфические IgG сыворотки крови;

4 – моноклональные анти-IgG–антитела, меченые пероксидазой хрена (конъюгат).

8

на поверхности носителя происхо­ дит­ присоединение к имеющимся комплексам­ «антиген–антитело» антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется­ пероксидаза хрена). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит­ взаимодей­ ствие­ фермента с субстратом, в результате чего разви­ ва­ ется­ цветная реакция, интенсив­ ность­ которой зависит от ко­личест­ ва­ связанных сыворо­ ­ точныхантител­ (вслучаеиспользова­ ния­ пероксидазного­ конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода­ в сочетании с ортофенилендиамином (ОФД), 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК)илитетраме­ ­тилбен­ зидином­ (ТМБ)).Результатреакцииоценивается спектрофо­ тометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъек­тивность оценки. Некоторые иммуноферментные­ тест-системыдопуска­ ют­ визуальнуюоценкурезультатов,чтоможет быть полезно при отсут­ ст­ вии­ соответствующего оборудования.

Конъюгат, применяемый в таких тест-системах, может быть получен­ на основе поликлональных антивидовых антител (напри­ ­ мер, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе полиили моноклональ­ ных­ антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов­ определённого класса (M,G,А).Взависимостиоттого,ка­киеантителаис­пользованы,тестсисте­ ма­ будет выявлять в иссле­дуемом образце или любые специ­ фические­ антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только IgG или только IgM).

По такому принципу построена основная масса отечественных ИФА-тест-систем для диагностики различных инфекций (ВИЧ-ин­ фекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, ток­ соплазменная и др. инфекции), в том числе и сифилиса.

В то же время, существуют тест-системы, в которых исполь­ ­­

зована несколько другая схема (рис. 2) – ИФА с фикси­рован­ ными антителами или «ловушка для антител» (Antibody cap­ture­ ELISA). Она основана на том, что на твердофазном носителе фиксируются аффинно очищенные антитела­ , специфически реаги­ рующие­ с человеческими антителами определенного класса (IgM, IgG или IgA). В результате инкубации с тестируемой сывороткой антитела этого класса связываются с носителем­ . Наличие среди них антител, специфических для какого-либо антигена (например, трепонемного), выявляется в ходе инкубации с этим антигеном, меченым ферментом. При инкубации с субстратом в том случае, когда в исследуемом

9

Рис. 2. Схема иммуноферментного анализа на иммуноглобулины класса М (IgМ).

1 – носитель (поверхность лунки планшета);

2 – моноклональные анти-IgM–антитела;

3 – IgМ сыворотки крови;

4 – антиген, меченый пероксидазой хрена (конъюгат).

образце присутствовали специфические антитела, развивается окрашивание раствора. По такой схеме постро­ ены­ , например, коммерческие зарубежные тест-системы «Captia Syph G EIA», «Captia Syph M EIA» для выяв­ ле­ ния­ анти­ тел­ , соот­ вет­ ст­ вен­ но­ , клас­сов G иMквоз­бу­дите­ лю­ си­фили­ ­са.Наоте­чест­ вен­ ­номрын­кеди­аг­ности­ че­ с­­ койпродук­ ции­ также­ суще­ ст­ ву­ ют­ имму­ но­ фер­ мент­ ные­ тест-сис­те­ мы­ для выяв­ ле­ ния­ анти­ тре­ по­ нем­ ных­ имму­ ног­ ло­ бу­ ли­ нов­ класса­ М,

10