6 курс / Кардиология / Диагностика_инфекций,_передаваемых_половым_путём_Хворик_Д_Ф
.pdfНазвание |
|
|
Описание |
|
|
||
|
менее 3 шт.); |
|
|
|
|
|
|
|
6) |
амплификатор (термоциклер) или амплификатор с |
|||||
|
детекцией результатов амплификации в режиме |
||||||
|
реального времени; |
|
|
|
|
||
|
7) |
ПЦР-детектор флуоресценции; |
|
|
|||
|
8) |
источник постоянного тока для электрофореза; |
|||||
|
9) |
камера для горизонтального электрофореза с |
|||||
|
плашками и гребенками для приготовления геля; |
||||||
|
10) |
трансиллюминатор |
для |
детекции |
продуктов |
||
|
амплификации в агарозном геле; |
|
|
||||
|
11) |
видеосистема для регистрации изображений; |
|||||
|
12) |
компьютер; |
|
|
|
|
|
|
13) |
микроволновая печь для приготовления агарозного |
|||||
|
геля или магнитная плитка-мешалка; |
|
|
||||
|
14) |
одноразовые |
пластиковые |
микропробирки типа |
|||
|
«Eppendorf» 1,5 мл; |
|
|
|
|
||
|
15) |
одноразовые пластиковые микропробирки 0,5 или |
|||||
|
0,2 мл; |
|
|
|
|
|
|
|
16) |
наборы автоматических |
дозаторов |
переменного |
|||
|
объема (отдельно для этапа выделения, амплификации |
||||||
|
выделенной нуклеиновой кислоты и детекции |
||||||
|
продуктов амплификации методом гель-электрофореза); |
||||||
|
17) |
одноразовые |
наконечники |
для |
дозаторов |
||
|
переменного объема, тестированные на отсутствие |
||||||
|
ДНК/РНК; |
|
|
|
|
|
|
|
18) |
одноразовые наконечники с аэрозольным барьером |
|||||
|
для дозаторов переменного объема, тестированные на |
||||||
|
отсутствие ДНК/РНК; |
|
|
|
|
||
|
19) |
стеклянные стаканы; |
|
|
|
|
|
|
20) |
стеклянные колбы; |
|
|
|
|
|
|
21) |
цилиндры; |
|
|
|
|
|
|
22) |
стеклянные палочки; |
|
|
|
|
|
|
23) |
штативы для микропробирок; |
|
|
|||
|
24) |
штативы для автоматических дозаторов; |
|||||
|
25) |
емкости для дезинфекции; |
|
|
|
||
|
26) дезинфицирующие средства; |
|
|
||||
|
27) |
бактерицидные облучатели; |
|
|
|
||
|
28) |
контейнеры |
для |
транспортировки |
образцов |
||
|
первичных проб; |
|
|
|
|
|
|
|
29) |
средства индивидуальной защиты |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
51
Название |
Описание |
|
Реагент |
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для |
|
|
выделения нуклеиновых кислот из проб первичных |
|
|
образцов; |
|
|
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для |
|
|
проведения амплификации нуклеиновых кислот с |
|
|
детекцией методом гель-электрофореза; |
|
|
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для |
|
|
проведения амплификации нуклеиновых кислот с |
|
|
детекцией продуктов амплификации в режиме |
|
|
реального времени; |
|
|
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для |
|
|
детекции продуктов амплификации методом гель- |
|
|
электрофореза; |
|
|
дистиллированная вода; |
|
|
70% этиловый спирт. |
|
Подготовка |
к Все работы проводятся с использованием одноразовых |
|
проведению |
расходных материалов, спецодежда меняется при |
|
анализа |
переходе из одного помещения (зоны) в другое. |
|
Процедура |
Процедура включает в себя следующие этапы: |
|
анализа |
— пробоподготовка (выделение нуклеиновых кислот и |
|
|
удаление ингибиторов ПЦР) из образцов первичных |
|
|
проб или чистой культуры микроорганизма; |
—проведение амплификации;
—детекция и учет продуктов амплификации. Технология проведения этапов анализа описана в соответствующих инструкциях и рекомендациях производителей тест-систем.
Организацию работ на всех этапах, а также обеззараживание проб необходимо проводить в соответствии с Инструкцией МЗ РБ «Организация работ в лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)» per. № 090-1008 от 13.11.2008 г.
Учет и оценка Результаты амплификации анализируют с помощью: результатов гель-электрофореза, флуоресцентного ПЦР детектора
или с использованием амплификатора с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Проведение учета и оценки полученных результатов осуществляется согласно инструкциям производителей тест-систем.
52
Название |
Описание |
|
Заключение |
Нуклеиновая кислота, специфичная для T.vaginalis, |
|
лабораторного |
обнаружена. |
|
исследования |
Нуклеиновая кислота, специфичная для T.vaginalis, не |
|
|
обнаружена. |
|
Контроль |
На преаналитическом этапе оценивается: |
|
качества |
взятие биологического материала в соответствии с |
|
|
требованиями; |
выполнение требований хранения и доставки материала в лабораторию;
выполнение требований маркировки проб и соответствия маркировки пробы маркировке направления;
контроль реагентов (внешнее состояние, срок годности), условия и сроки хранения;
качество лабораторной посуды.
Мероприятия аналитического этапа:
включение официально зарегистрированных контрольных материалов;
соблюдение технологии выполнения процедуры в соответствии с инструкцией производителя тест-систем;
учет результатов с контрольным материалом и испытуемым образцом в соответствии с официально признанными критериями.
Внутренний контрольный образец, добавляемый на стадии выделения нуклеиновой кислоты, позволяет судить о наличии в пробах веществ, ингибирующих ПЦР, а также о качестве пробоподготовки.
Технология проведения реакции амплификации подразумевает обязательную постановку наряду с опытными пробами положительных и отрицательных контрольных образцов. Положительный контроль этапа амплификации включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца, прошедшего пробоподготовку, вносится контрольный препарат нуклеиновой кислоты.
Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца, прошедшего пробоподготовку, вносится буфер или деионизованная вода. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них
53
Название |
|
Описание |
|
|
||
специфической нуклеиновой кислоты или клеток |
|
|||||
возбудителя вследствие контаминации, и для |
||||||
исключения |
получения |
ложно-положительных |
||||
результатов. Внутри лабораторный контроль качества |
||||||
проводят не реже 1 раза в месяц путем исследования |
||||||
шифрованных |
контрольных |
панелей, содержащих |
||||
«положительные» |
и |
«отрицательные» |
пробы. |
|||
Контрольные панели могут быть приготовлены в |
||||||
лаборатории или использованы референс-панели, |
||||||
зарегистрированные в МЗ РБ. |
|
|
|
|||
В рамках внутри лабораторного контроля качества 1 раз |
||||||
в месяц, а также при подозрении и для выявления |
||||||
возможной контаминации лаборатории нуклеиновыми |
||||||
кислотами, следует проводить исследования смывов с |
||||||
рабочих поверхностей и оборудования. Для обеспечения |
||||||
внешнего контроля качества проводимых исследований |
||||||
используются референс-панели, разрешенные к |
||||||
применению на территории РБ. |
|
|
|
|||
Мероприятия постаналитического этапа: |
|
|
—правильность внесения результатов в бланк исследования и формулировка лабораторного заключения;
—своевременное доведение информации до врача, назначившего исследование.
Перечень |
|
Появление специфической полосы в отрицательном |
|||||||
возможных |
|
контроле свидетельствует о наличии контаминации |
|||||||
ошибок |
при |
реактивов или проб. В этом случае результаты анализа |
|||||||
выполнении и |
по всем пробам считаются недействительными. |
||||||||
пути |
их |
Контаминация может быть спорадическая (появление |
|||||||
устранения |
|
ложноположительных результатов в некоторых пробах) |
|||||||
|
|
и |
тотальная |
(появление |
ложноположительных |
||||
|
|
результатов в каждой пробе). Требуется повторить |
|||||||
|
|
анализ проб, а также предпринять меры по выявлению |
|||||||
|
|
источника контаминации. |
|
|
|
|
|||
|
|
Появление |
неспецифических |
продуктов амлификации |
|||||
|
|
при |
их |
детекции |
методом |
электрофореза: |
|||
|
|
дополнительные полосы. Появление в дорожках |
|||||||
|
|
неспецифических |
полос |
|
на |
разных |
уровнях |
||
|
|
свидетельствует о неверном температурном режиме в |
|||||||
|
|
ячейках амплификатора, или об отсутствии «горячего |
|||||||
|
|
старта». При этом необходимо отрегулировать |
|||||||
|
|
температурный режим в |
ячейках |
амплификатора и |
54
Название |
|
|
Описание |
|
|
|
|
использовать «горячий старт» до начала циклов |
|||||
|
амплификации. Отсутствие в пробе полос внутреннего |
|||||
|
контроля и специфического фрагмента амплификации |
|||||
|
ДНК свидетельствует об ошибке в процедуре |
|||||
|
подготовки клинического материала, а результаты, |
|||||
|
полученные |
по |
данной |
пробе, |
считаются |
|
|
недействительными. Требуется повторить анализ |
|||||
|
пробы, начиная с этапа выделения. |
|
|
|
||
|
При проведении детекции в режиме реального времени |
|||||
|
значение порогового цикла в пробе выше параметра, |
|||||
|
указанного производителем тест-системы. Следует |
|||||
|
повторить |
анализ |
пробы, |
начиная |
с |
этапа |
|
пробоподготовки. |
|
|
|
|
Однако, учитывая распространенность смешанных инфекций, частой встречаемости «атипичных» трихомонад, при сомнительных результатах культурального исследования для дополнительного контроля следует проводить ПЦР-диагностику в комплексе с микроскопией [18, 49].
Заслуживает внимания алгоритм диагностики УТ у мужчин и женщин (рисунки 3 и 4), предложенный Р.А.Раводиным (2005).
55
Рисунок 3 – Алгоритм диагностики УТ у мужчин
56
Рисунок 4 – Алгоритм диагностики УТ у женщин
Клинический протокол диагностики пациентов с УТ в РБ (Приложение к Приказу МЗ РБ № 1020 от 29.10.2009 г.) представлен в таблице 15 [27].
57
Таблица 15 – Клинический протокол диагностики пациентов с УТ [27]
ЛПУ |
Обязательная |
|
Дополнительная |
||
|
(по показаниям) |
||||
|
|
|
|
||
В условиях |
Физикальный осмотр. |
|
Бактериологическое |
||
поликлиники |
Исследование |
крови |
на |
исследование |
отделяемого |
|
антитела к T. pallidum. |
|
мочеполовых |
органов на |
|
|
ИФА-ВИЧ. |
|
|
T.vaginalis, |
|
|
ИФА-Hbs антиген, ИФА- |
микроскопическое, |
|||
|
HCV. |
|
|
бактериологическое |
|
|
Микроскопическое |
|
исследование, МАНК, РИФ, |
||
|
исследование |
отделяемого |
ИФА (на антигены) на |
||
|
мочеполовых органов. |
|
ИППП (применяется один из |
||
|
Микроскопическое |
|
предложенных методов). |
||
|
исследование |
нативного |
Исследование |
секрета |
|
|
мазка |
отделяемого |
предстательной железы. |
||
|
мочеполовых органов. |
|
Общий анализ крови. |
||
|
Бактериологическое |
|
Общий анализ мочи. |
||
|
исследование |
отделяемого |
Флюорография. |
|
|
|
мочеполовых |
органов |
на |
|
|
|
N.gonorrhoeae. |
|
|
|
|
|
МАНК на T.vaginalis. |
|
|
|
|
В условиях |
Физикальный осмотр. |
|
Бактериологическое |
||
стационара |
Исследование |
крови |
на |
исследование |
отделяемого |
|
антитела к T. pallidum. |
|
мочеполовых органов на T. |
||
|
ИФА-ВИЧ. |
|
|
vaginalis, микроскопическое, |
|
|
ИФА-Hbs антиген, ИФА- |
бактериологическое |
|||
|
HCV. |
|
|
исследование, МАНК, РИФ, |
|
|
Микроскопическое |
|
ИФА (на антигены) на |
||
|
исследование |
отделяемого |
ИППП (применяется один из |
||
|
мочеполовых органов. |
|
предложенных методов). |
||
|
Микроскопическое |
|
Исследование |
секрета |
|
|
исследование |
нативного |
предстательной железы. |
||
|
мазка |
отделяемого |
|
|
|
|
мочеполовых органов. |
|
|
|
|
|
Бактериологическое |
|
|
|
|
|
исследование |
отделяемого |
|
|
|
|
мочеполовых |
органов |
на |
|
|
|
N.gonorrhoeae. |
|
|
|
|
|
Общий анализ крови. |
|
|
|
|
|
Общий анализ мочи. |
|
|
|
|
|
Флюорография. |
|
|
|
|
|
МАНК на T.vaginalis. |
|
|
|
58
Урогенитальный кандидоз
Эпидемиология урогенитального кандидоза.
Урогенитальный кандидоз чаще встречается у женщин, реже – у мужчин. Заболевание составляет до 40% в структуре инфекционной патологии нижнего отдела гениталий (Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р., 1995). Подсчитано, что из 100 млн ежегодных визитов к врачам по поводу вагинита около 2025% обусловлены вульвовагинальным кандидозом [31]. Установлено, что 75% женщин переносят в течение своей жизни по крайней мере хоть один эпизод вульвовагинального кандидоза, а у 40-50% из них развивается один рецидив заболевания (Harley R., De Louvois J., 1979; Reed B.D., 1992).
Заболеваемость вульвовагинальным кандидозом в США насчитывает около 13 млн случаев в год, что составляет около 10% женского населения страны. Урогенитальный кандидоз наиболее часто регистрируется в странах с жарким климатом и низкими санитарно-гигиеническими условиями. В последние годы появились стертые и атипичные формы данной патологии, а также хронические, резистентные к проводимой терапии разновидности заболевания [2, 19, 21, 26, 62].
Вульвовагинальный кандидоз поражает женщин репродуктивного возраста, причем увеличение частоты кандидоза отмечается ближе к 20 годам с пиком заболевания в следующие 20 лет, снижаясь после менопаузы [15, 48, 62].
Характеристика возбудителя. Первые упоминания о кандидозе появились еще в трудах Гиппократа и Галена. Впервые клиническая картина вульвовагинита была описана в 1792 г. (Frank), а в 1794 г. (Wilkinson) впервые установил ее грибковую этиологию. Возбудителем урогенитальных кандидозов наиболее часто является Candida albicans. В настоящее время описано более 170 биологических видов дрожжеподобных грибов, среди которых в подавляющем большинстве случаев (85-90%) преобладают Candida albicans. Среди остальных видов Candida клиническое значение имеют преимущественно С.glabrata (или С.torulopsis) (5-10%), С.tropicalis (3-5%), С.parapsilosis (3-5%), С.сrusei (1-3%), С.guilliermondi, значительно реже – С.pseudotropicalis и Saccharomyces cerevisiae. Среди
59
перечисленных дрожжеподобных грибов С.albicans является наиболее патогенным [21, 31].
Факторы патогенности С.albicans можно разделить на 3 группы: изменчивость и значительную лабильность морфофизиологических свойств клетки, рецепторы адгезии и литические ферменты. Изменчивость С.albicans обеспечивается многими генетическими и регуляторными механизмами и позволяет выживать в различных патологических условиях (воздействие температуры, кислотности, содержания кислорода и др. вредных факторов). В зависимости от условий среды возбудитель может переходить от дрожжевой формы к плесневой
иобратно, способен изменять фенотип или структуру поверхности, т.е. рецепторы и антигены [2, 4, 31, 62].
Наличие факторов адгезии (к фибриногену, ламинину, фибронектину, факторам системы комплемента) способствует быстрому прикреплению с последующей инвазией и развитием «антигенной мимикрии». У С.albicans описано 9 протеиназ, способных разрушать кератин, белки эндотелия и соединительной ткани, факторы плазмы крови, комплемента и фрагменты иммуноглобулинов. Имеются также фосфолипазы, разрушающие фосфолипиды клеточных мембран, гиалуронидазу
игемолитический фактор. Среди факторов патогенности данного гриба следует отметить устойчивость к противогрибковым средствам: способность к их ускоренному выведению,
изменению или амплификации внутриклеточной мишени
[4, 34, 45].
Данные возбудители относятся к условно-патогенным растительным микроорганизмам. Кроме сапрофитирования в окружающей среде на субстратах живой и неживой природы, они довольно часто выделяются с поверхности кожных покровов и слизистых оболочек человека. Дрожжеподобные грибы рода кандида являются одноклеточными микроорганизмами. Все виды Candida существуют в форме почкующихся клеток. Их диаметр колеблется в пределах от 1,5 до 10 мкм. При этом многие виды образуют псевдомицелий, представленный вытянутыми дрожжевыми клетками. От настоящего мицелия их отличает отсутствие септ (перегородок). С. albicans – единственный в роде Candida вид, способный к образованию истинного мицелия, для
60