5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Лечение_ВИЧ_инфекции,_К_Хоффман,_Дж_К_Роктрох,_Б_С_Кампс

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 35

Острая лихорадочная фаза ВИЧ-инфекции обычно продолжается 7-10 дней, очень редко — более 14 дней. Из-за неспецифичности симптомов диагностика этой стадии ВИЧ-инфекции является трудной задачей, в решении которой помогает тщательный сбор анамнеза и выяснение контактов.

Диагностика

Диагноз острой фазы ВИЧ-инфекции ставится при выявлении репликации ВИЧ в отсутствие антител к нему (антитела появляются позже). Среди различных методов диагностики наиболее чувствительным служит выявление РНК ВИЧ-1 в плазме.

В недавно опубликованном исследовании (Hecht, 2002) чувствительность всех исследований на РНК ВИЧ (метод разветвленной ДНК, ПЦР, олигонуклеотидные зонды) составила 100%, однако в 2-5% случаев были получены ложноположительные результаты. В большинстве случаев они соответствовали концентрации РНК ВИЧ менее 2000 мл–1, т.е. намного ниже типичных для этой стадии ВИЧ-инфекции показателей (по нашим данным, средняя концентрация РНК ВИЧ составляет 13 × 106 мл–1, а диапазон — 0,25-95,5 × 106 мл–1). Во всех ложноположительных случаях при повторном определении РНК ВИЧ в том же образце плазмы тем же методом получены отрицательные результаты. Таким образом, чувствительность и специфичность дублированного определения РНК ВИЧ в одном образце составляют 100%. Чувствительность определения антигена p24 составляет лишь 79%, а специфичность — 99,5-99,96%. Диагноз острой фазы ВИЧ-инфекции необходимо подтвердить через несколько недель выявлением сероконверсии (положительным результатом исследования на антитела к ВИЧ).

Во время острой фазы ВИЧ-инфекции нередко отмечается выраженное падение числа лимфоцитов CD4. Затем это число повышается, но обычно не достигает первоначального уровня. Число лимфоцитов CD8, наоборот, сразу увеличивается, при этом отношение CD4/CD8 может стать менее 1.

В дифференциальной диагностике главное место занимает инфекционный мононуклеоз. Следует учесть также гепатит, грипп, токсоплазмоз, сифилис и побочные эффекты лекарственных средств. В целом, самый важный момент в диагностике острой лихорадочной фазы ВИЧ-инфекции — это как раз включение

еев дифференциальный диагноз. Когда ВИЧ-инфекция заподозрена, остается провести тест на антитела

кВИЧ и — при необходимости — определить вирусную нагрузку (рис. 1).

Подозрение на острую лихорадочную фазу

Исследование на антитела к ВИЧ и на РНК ВИЧ

Рисунок 1. Диагностический алгоритм при подозрении на острую лихорадочную фазу ВИЧ-инфекции

(источник: Hecht et al., AIDS 2002).

36 Острая фаза ВИЧ-1-инфекции

Лечение

Цель антиретровирусной терапии во время острой лихорадочной фазы ВИЧ-инфекции — сократить число зараженных клеток, сохранить специфический иммунный ответ на ВИЧ и, по возможности, снизить вирусологическую контрольную точку. В последние годы в нескольких исследованиях было показано, что лечение острой лихорадочной фазы ВИЧ-инфекции позволяет добиться длительного снижения виремии, сохранить и даже увеличить число специфичных к ВИЧ T-хелперов и сохранить высокую гомогенность вирусной популяции.

Первые исследования терапии во время острой фазы ВИЧ-инфекции с последующими плановыми перерывами показали, что с помощью антиретровирусных средств можно поддержать специфический иммунный ответ на ВИЧ (Rosenberg, 2000). Большинство пациентов через некоторое время смогли прекратить лечение и достигли по крайней мере временного подавления репликации вируса; у некоторых из них концентрация РНК ВИЧ сохранялась на уровне < 5000 мл–1 в течение 3 лет и более. Однако у большинства пациентов в этом исследовании (Kaufmann, 2004), а также в других исследованиях, в которых оценивалось подавление вируса после лечения первичной инфекции (Markowitz, 1999), вирусная нагрузка со временем опять возросла и превысила начальный уровень, что потребовало возобновления терапии.

Отдаленная польза раннего начала лечения пока не доказана. Не ясно также, сколько продолжается период острой фазы инфекции, в течение которого начало терапии позволяет добиться иммунологического, вирусологического и клинического успеха. До тех пор, пока ответы на эти вопросы не найдены, лечение пациентов с острой лихорадочной фазой ВИЧ-инфекции должно проводиться в рамках контролируемых испытаний (Yeni, 2002). Если это не осуществимо, пациенту следует предложить пройти стандартный курс терапии первого ряда. Перед началом антиретровирусной терапии следует открыто обсудить с пациентом связанные с ней вопросы: предупредить, что польза раннего лечения пока не доказана, рассказать о риске осложнений антиретровирусной терапии и перерывов в ней (включая побочные эффекты, развитие устойчивости, острый ретровирусный синдром во время реактивации вируса), а также о риске передачи ВИЧ и суперинфекции во время перерывов в лечении.

Литература

1.Allen TM, O'Connor DH, Jing P, Dzuris JL, Mothe BR, Vogel TU, et al. Tatspecific cytotoxic T lymphocytes select for SIV escape variants during resolution of primary viraemia. Nature 2000,407:386-390. http:// amedeo.com/lit.php?id=11014195

2.Altfeld M, Rosenberg ES, Shankarappa R, Mukherjee JS, Hecht FM, Eldridge RL, et al. Cellular Immune Responses and Viral Diversity in Individuals Treated during Acute and Early HIV-1 Infection. J Exp Med 2001,193:169-180. http:// amedeo.com/lit.php?id=11148221

3.Altfeld M, Addo MM, Rosenberg ES, Hecht FM, Lee PK et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 2003 Dec 5;17(18):2581-91. http://amedeo.com/lit.php?id=14685052

4.Biti R, Ffrench R, Young J, Bennetts B, Stewart G, Liang T. HIV-1 infection in an individual homozygous for the CCR5 deletion allele. Nat Med 1997,3:252-253.

5.Borrow P, Lewicki H, Hahn BH, Shaw GM, Oldstone MB. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol 1994,68:6103-6110. http://amedeo.com/lit.php?id=8057491

6.Cooper DA, Gold J, Maclean P, Donovan B, Finlayson R, Barnes TG, et al. Acute AIDS retrovirus infection. Definition of a clinical illness associated with seroconversion. Lancet 1985,1:537-540. http://amedeo.com/lit.php?id=2857899

7.Daar ES, Little S, Pitt J, Santangelo J, Ho P, Harawa N, et al. Diagnosis of primary HIV-1 infection. Los Angeles County Primary HIV Infection Recruitment Network. Ann Intern Med 2001,134:25-29. http://amedeo.com/ lit.php?id=11187417

8.Douek DC, Brenchley JM, Betts MR, Ambrozak DR, Hill BJ, Okamoto Y, et al. HIV preferentially infects HIV-specific CD4+ T cells. Nature 2002,417:95-98. http://amedeo.com/lit.php?id=11986671

9.Gupta KK. Acute immunosuppression with HIV seroconversion. N Engl J Med 1993,328:288-289.

10.Hecht FM, Busch MP, Rawal B, Webb M, Rosenberg E, Swanson M, et al. Use of laboratory tests and clinical symptoms for identification of primary HIV infection. Aids 2002,16:1119-1129. http://amedeo.com/lit.php?id=12004270

11.Jin X, Bauer DE, Tuttleton SE, Lewin S, Gettie A, Blanchard J, et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med 1999,189:991-998. http://amedeo.com/ lit.php?id=10075982

12.Kahn JO, Walker BD. Acute human immunodeficiency virus type 1 infection. New England Journal of Medicine 1998,339:33-39.

13.Kaslow RA, Carrington M, Apple R, Park L, Munoz A, Saah AJ, et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nat Med 1996,2:405-411. http://amedeo.com/ lit.php?id=8597949

14.Kaufmann DE, Lichterfeld M, Altfeld M, Addo MM, Johnston MN et al. Limited Durability of Viral Control following Treated Acute HIV Infection. PLOS Medicine, November 2004. in press. http://www.plosmedicine.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pmed.0010036

15.Keet IP, Krijnen P, Koot M, Lange JM, Miedema F, Goudsmit J, et al. Predictors of rapid progression to AIDS in HIV-1 seroconverters. Aids 1993,7:51-57. http:// amedeo.com/lit.php?id=8095146

16.Koup RA, Safrit JT, Cao Y, Andrews CA, McLeod G, Borkowsky W, et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of Virology 1994,68:4650-4655. http://amedeo.com/lit.php?id=8207839

17.Lange CG, Lederman MM, Medvik K, Asaad R, Wild M, Kalayjian R, et al. Nadir CD4+ T-cell count and numbers of CD28+ CD4+ T-cells predict functional responses to immunizations in chronic HIV-1 infection. Aids 2003,17:2015-2023. http://amedeo.com/lit.php?id=14502004

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 37

18.Lichterfeld M, Kaufmann DE, Yu XG, Mui SK, Addo MM, Johnston MN et al. Loss of HIV-1-specific CD8+ T cell proliferation after acute HIV-1 infection and restoration by vaccine-induced HIV-1-specific CD4+ T cells. J Exp Med. 2004 Sep 20;200(6):701-12. http://amedeo.com/lit.php?id=15381726

19.Lindback S, Brostrom C, Karlsson A, Gaines H. Does symptomatic primary HIV- 1 infection accelerate progression to CDC stage IV disease, CD4 count below 200 x 10(6)/l, AIDS, and death from AIDS? Bmj 1994,309:1535-1537. http:// amedeo.com/lit.php?id=7819891

20.Markowitz M, Vesanen M, Tenner-Racz K, Cao Y, Binley JM, Talal A, et al. The effect of commencing combination antiretroviral therapy soon after human immunodeficiency virus type 1 infection on viral replication and antiviral immune responses. J Infect Dis 1999,179:527-537.

21.Mellors JW, Kingsley LA, Rinaldo CR, Jr., Todd JA, Hoo BS, Kokka RP, et al. Quantitation of HIV-1 RNA in plasma predicts outcome after seroconversion. Ann Intern Med 1995,122:573-579. http://amedeo.com/lit.php?id=7887550

22.O'Brien SJ, Gao X, Carrington M. HLA and AIDS: a cautionary tale. Trends Mol Med 2001,7:379-381. http://amedeo.com/lit.php?id=11530315

23.O'Brien TR, Winkler C, Dean M, Nelson JA, Carrington M, Michael NL, et al. HIV-1 infection in a man homozygous for CCR5 delta 32. Lancet 1997,349:1219.

24.O'Connor DH, Allen TM, Vogel TU, Jing P, DeSouza IP, Dodds E, et al. Acute phase cytotoxic T lymphocyte escape is a hallmark of simian immunodeficiency virus infection. Nat Med 2002,8:493-499. http://amedeo.com/lit.php?id=11984594

25.Pantaleo G, Demarest JF, Soudeyns H, Graziosi C, Denis F, Adelsberger JW, et al. Major expansion of CD8+ T cells with a predominant V beta usage during the primary immune response to HIV. Nature 1994,370:463-467. http://amedeo.com/lit.php?id=8047166

26.Pedersen C, Lindhardt BO, Jensen BL, Lauritzen E, Gerstoft J, Dickmeiss E, et al. Clinical course of primary HIV infection: consequences for subsequent course of infection. Bmj 1989,299:154-157. http://amedeo.com/lit.php?id=2569901

27.Price DA, Goulder PJ, Klenerman P, Sewell AK, Easterbrook PJ, Troop M, et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proc Natl Acad Sci U S A 1997,94:1890-1895. http://amedeo.com/ lit.php?id=9050875

28.Rosenberg ES, Altfeld M, Poon SH, Phillips MN, Wilkes BM, Eldridge RL, et al. Immune control of HIV-1 after early treatment of acute infection. Nature 2000,407:523-526. http://amedeo.com/lit.php?id=11029005

29.Rosenberg ES, Billingsley JM, Caliendo AM, Boswell SL, Sax PE, Kalams SA, et al. Vigorous HIV-1-specific CD4+ T cell responses associated with control of viremia. Science 1997,278:1447-1450. http://amedeo.com/ lit.php?id=9367954

30.Samson M, Libert F, Doranz BJ, Rucker J, Liesnard C, Farber CM, et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 1996,382:722-725. http:// amedeo.com/lit.php?id=8751444

31.Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S, Sasseville VG, Simon MA, Lifton MA, et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science 1999,283:857-860. http://amedeo.com/lit.php?id=9933172

32.Sinicco A, Fora R, Sciandra M, Lucchini A, Caramello P, Gioannini P. Risk of developing AIDS after primary acute HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr 1993,6:575-581. http://amedeo.com/lit.php?id=8098750

33.Vanhems P, Hirschel B, Phillips AN, Cooper DA, Vizzard J, Brassard J, et al. Incubation time of acute human immunodeficiency virus (HIV) infection and duration of acute HIV infection are independent prognostic factors of progression to AIDS. J Infect Dis 2000,182:334-337. http://amedeo.com/lit.php?id=10882619

38 Тестирование на ВИЧ

3. Тестирование на ВИЧ

В. Прайзер

Знание о наличии у себя ВИЧ-инфекции дает человеку возможность воспользоваться самыми современными методами лечения. Поэтому каждому, кто подвергся риску заражения ВИЧ, рекомендуется пройти консультирование и тестирование на ВИЧ. В последние годы тестирование на ВИЧ приобрело громадное клиническое значение, поскольку своевременно начатая ВААРТ способна не только повысить качество жизни, но и существенно продлить саму жизнь. В связи с этим в последнее десятилетие тестированию на ВИЧ стали уделять гораздо больше внимания. Если раньше в тестировании на ВИЧ усматривали ущемление прав обследуемого, то сегодня — в эпоху ВААРТ — медицинский работник обязан доброжелательно советовать пациенту пройти тестирование на ВИЧ, когда это необходимо, чтобы открыть ему путь к оптимальному лечению ВИЧ-инфекции. Иногда тестирование на ВИЧ проводится в интересах третьих лиц; примеры тому — случайная травма иглой, загрязненной кровью пациента с неизвестным ВИЧ-статусом, и тестирование на ВИЧ беременных.

Если у пациента наблюдается заболевание, которое может быть обусловлено ВИЧ-инфекцией, тестирование на ВИЧ позволит подтвердить или опровергнуть подозрения и, таким образом, станет отправной точкой для дальнейшего диагностического поиска или лечения. Как правило, выясняется, что пациент болен ВИЧ-инфекцией уже некоторое время (зачастую несколько лет). Отдельно стоят случаи, в которых есть основания подозревать острую или приобретенную вертикальным путем ВИЧ-инфекцию. Они требуют особого подхода к тестированию (см. ниже).

Тестирование на ВИЧ проводится не только при необходимости обследовать конкретного больного. Оно широко используется для массовых обследований, в том числе доноров крови, препаратов крови и органов. В подобных случаях тестирование на ВИЧ позволяет гарантировать безопасность пациентов, либо используется в целях эпидемиологического надзора (UNAIDS, 1997a и 2001).

Как проводить тестирование

Обычно основанием для диагноза ВИЧ-инфекции служат косвенные признаки, а именно специфические антитела к ВИЧ (Gürtler 1996). Они обнаруживаются фактически у 100% ВИЧ-инфицированных и свидетельствуют о реакции гуморального иммунитета на вирус. В отличие от антител ко многим вирусам, антитела к ВИЧ не обеспечивают ни защиту от ВИЧ, ни иммунитет к ВИЧ-инфекции. Их присутствие лишь означает, что у пациента на протяжении некоторого времени имеется ВИЧ-инфекция. Случаи ВИЧинфекции, в которых антитела к ВИЧ стойко не определяются, настолько редки, что пока для клинической практики значения не имеют или почти не имеют (Connick 2005). Возможно, в будущем эта ситуа-

ция изменится (Kassutto, 2005).

О наличии ВИЧ-инфекции можно судить не только по косвенным, но и по прямым признакам. К ним относятся: сам ВИЧ (его выделяют в культуре клеток — только в специализированных лабораториях 3 уровня биологической безопасности), антигены ВИЧ (в частности, антиген p24, выявляемый при ИФА) или нуклеиновые кислоты ВИЧ (то есть генетический материал). Последние выявляют при так называемых тестах на РНК или ДНК ВИЧ. Именно они используются сегодня чаще всего, поскольку для их проведения лабораториям не требуется повышенных мер безопасности, они более чувствительны, чем тесты на антигены ВИЧ, и позволяют получить количественные данные.

Прямые качественные тесты на ВИЧ (позволяющие получить ответ «да» или «нет») целесообразно использовать для определения ВИЧ-статуса лишь в отдельных случаях, таких как подозрение на недавнее заражение ВИЧ и обследование детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами (подробнее см. ниже). В то же время прямые количественные тесты на нуклеиновые кислоты ВИЧ имеют гораздо большее значение. В частности, тест на так называемую вирусную нагрузку, то есть тест, с помощью которого определяют концентрацию вирусной РНК в крови, стал незаменимым средством управления антиретровирусной терапией.

Однако следует отметить, что понятие «тест на ВИЧ» (иногда его ошибочно называют тестом на СПИД), как правило, относят к тестам на антитела к ВИЧ — косвенные показатели ВИЧ-инфекции.

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 39

Диагностика ВИЧ-инфекции с помощью тестов на антитела к ВИЧ

Чтобы провести тестирование на антитела к ВИЧ, необходимо использовать по крайней мере два разных теста:

1.предварительный тест (скрининг-тест);

2.подтверждающий тест.

В основе большинства скрининг-тестов лежит ИФА (иммуноферментный анализ) или сходные методы (UNAIDS, 1997b). Чтобы свести к минимуму вероятность ложноотрицательного результата, скри- нинг-тесты должны обладать высочайшей чувствительностью. Иными словами, они должны улавливать антитела с низким сродством к антигенам, которые появляются вскоре после заражения. Кроме того, скрининг-тесты должны определять антитела к ВИЧ разных типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) и групп (ВИЧ-1-N,

ВИЧ-1-O, ВИЧ-1-M) (UNAIDS/WHO, 1992 и 1997).

Положительный результат скрининг-теста необходимо подтвердить по крайней мере одним подтверждающим тестом. В ряде стран, например, в Германии и США, в качестве подтверждающего теста используют так называемый иммуноблоттинг или метод иммунофлюоресценции. В других странах (например, в Великобритании) положительный результат скрининг-теста подтверждают разными исследованиями в определенной последовательности по установленному алгоритму. Последний подход ничем не хуже первого и даже имеет ряд преимуществ, среди которых более низкая стоимость и большая объек-

тивность (Tamashiro 1993).

Скрининг-тест по методу ИФА

Многие тест-системы для ИФА выпускаются в виде 96-луночных планшетов для микротитрования. Хотя практически все этапы исследования можно выполнить вручную, планшеты позволяют полностью автоматизировать процесс, благодаря чему тестирование многих проб крови становится и безопасным, и экономичным. По сходному принципу сделаны и многие другие тест-системы, которые помещаются в специальные лабораторные приборы, в которых титрование и анализ полностью автоматизированы.

Можно выделить несколько вариантов ИФА. Все они основаны на специфической реакции «анти- ген-антитело». В самых первых (тестах первого поколения) использовался антиген «цельного вируса», который получали в культуре клеток. В современных тестах (тестах второго и последующих поколений) используется смесь рекомбинантных вирусных протеинов или синтетических пептидов, представляющих собой наиболее иммуногенные детерминанты ВИЧ.

Чтобы ИФА выявила имеющийся в крови пациента вирус, используемые в тесте антигены должны соответствовать тем антителам, что могли выработаться в организме пациента к ВИЧ определенного типа (ВИЧ-1, ВИЧ-2) или группы (ВИЧ-1-N, ВИЧ-1-O, ВИЧ-1-M). Так, неверно использовать ИФА на антитела только к ВИЧ-1, чтобы обследовать пациентов, заразившихся ВИЧ-2 в Западной Африке. В то же время, в силу более или менее выраженной способности к перекрестным реакциям, достоверно различить случаи ВИЧ-1- и ВИЧ-2-инфекции способны лишь специальные исследования, о которых иногда необходимо договариваться непосредственно с лабораторией.

В большинстве тест-систем для ИФА вирусный антиген нанесен на так называемую твердую фазу (например, на дно ячейки планшета). В ячейку добавляют сыворотку пациента. Если в ней содержатся специфические антитела к этим антигенам, происходит реакция антиген-антитело. Следующий этап исследования — отмывание. Его задача состоит в том, чтобы удалить все несвязавшиеся с антигеном компоненты сыворотки, в том числе и антитела, которые не смогли распознать вирусные антигены.

Связавшиеся с вирусными антигенами антитела выявляют на следующем этапе исследования — при добавлении меченного ферментом конъюгата. В качестве конъюгата выступают связанные с молекулой фермента либо другие антитела, например, козьи антитела к человеческим иммуноглобулинам (антиглобулиновый тест), либо вирусные антигены, причем зачастую те же, что нанесены на твердую фазу (иммунометрический тест или сэндвич-тест — тесты третьего поколения). Преимущество иммунометрических тестов состоит в том, что они выявляют антитела всех классов (в том числе и ранние IgM-антитела, не играющие существенной роли в развитии ВИЧ-инфекции). Оставшийся несвязанным конъюгат вновь отмывают.

На последнем этапе исследования добавляют субстрат. Если конъюгат связался с комплексом анти- ген-антитело, соединенный с ним фермент воздействует на субстрат, меняя его цвет. Эта реакция сопро-

40 Тестирование на ВИЧ

вождается выделением света, интенсивность которого (оптическая плотность) измеряется. Полученный показатель пропорционален активности антител в образце крови. В каждой тест-системе имеются образы для положительного и отрицательного контроля; оптическую плотность, полученную при их обработке, часто используют в качестве пороговой (то есть такой оптической плотности, которая служит эталоном для определения результатов теста как положительных или отрицательных).

Особый вид тестов — конкурентные. Во время таких тестов вместе с образцом крови пациента к твердой фазе добавляют меченные ферментом антитела к ВИЧ. Эти антитела конкурируют с антителами, присутствующими в крови пациента, за антигены. Если в исследуемом образце антитела к ВИЧ отсутствуют, все или почти все меченные ферментом антитела связываются с антигенами, и добавленный субстрат интенсивно окрашивается. И наоборот: чем больше в образце крови пациента содержится специфических антител, тем слабее окрашивается субстрат. Конкурентные методы исследования, как правило, высокоспецифичны.

Каждый метод исследования обладает собственными преимуществами и недостатками. Следовательно, всегда важно знать, каким именно методом проведено тестирование. Так называемые тесты четвертого поколения выявляют и антитела к ВИЧ, и антиген p24, что позволяет сократить так называемый период диагностического окна (см. ниже) (Brust 2000).

Достоверность результатов теста определяется двумя факторами: чувствительностью и специфичностью. Чувствительность означает способность теста давать положительный результат при наличии болезни (в данном случае, при наличии антител к ВИЧ в сыворотке). В свою очередь, под специфичностью понимают способность теста давать отрицательный результат в отсутствие болезни (в данном случае, при отсутствии антител к ВИЧ в сыворотке).

Скрининг-тесты тесты обладают высочайшей чувствительностью (почти 100%), то есть они способны определить малейшую концентрацию антител к ВИЧ, наблюдаемую в самом начале ВИЧ-инфекции. Высокой чувствительностью обеспечивается низкая вероятность ложноотрицательного результата. Иными словами, если пациент инфицирован ВИЧ, то высокочувствительный тест не позволит ошибочно заключить, что ВИЧ-инфекция у него отсутствует. Если для скрининг-теста выбран тест с высокой чувствительностью, то его отрицательный результат через 6 и более месяцев после чреватого заражением контакта позволит с уверенностью сказать, что вероятность инфекции у данного пациента практически рав-

на нулю (Preiser 2000).

Тесты на ВИЧ, которые поступили в продажу после 7 декабря 2003 г., должны отвечать требованиям нового закона Европейского Союза в отношении средств лабораторной диагностики и иметь маркировку CE. В частности, к ним предъявляется такое требование: тест должен дать положительный результат при исследовании 600 ВИЧ-положительных образцов, включая 200 ВИЧ-2-положительных, полученных на разных стадиях ВИЧ-инфекции.

Таким образом, главное качество скрининг-теста на ВИЧ — максимально возможная чувствительность. Он не имеет права дать отрицательный результат при исследовании ВИЧ-положительного образца, поскольку это чревато серьезными последствиями. В то же время, при столь высокой чувствительности специфичность отчасти снижается. На деле это означает, что положительный результат теста может оказаться ложноположительным. То есть тест может показать присутствие антител к ВИЧ в образце, в котором их нет. Это бывает, когда положительную реакцию дает нечто другое, ошибочно принятое за антитела к ВИЧ. Ложноположительные результаты обусловлены активацией иммунной системы по тем или иным причинам (острая вирусная инфекция, беременность, иммунизация или аутоиммунное заболевание). Специфичность современных скрининг-тестов на ВИЧ составляет не менее 99,5%, то есть при исследовании 4 000 ВИЧ-отрицательных образцов они дают не больше 20 ложноположительных результатов.

Поскольку любой тест может дать неспецифическую ложноположительную реакцию, положительный результат скрининг-теста предпочтительно называть «реактивным». Это нужно, чтобы ложноположительный результат не воспринимался как окончательное лабораторное заключение и все реактивные результаты обязательно проверялись подтверждающими тестами. «Положительным» можно называть только подтвержденный реактивный результат тестирования на ВИЧ!

Внимание! Реактивный результат скрининг-теста не означает, что пациент ВИЧ-инфицирован! Только положительный результат подтверждающего теста является основанием для диагноза ВИЧ-инфекции и, теоретически, только его следует сообщать пациенту!

Среди причин ложноположительных (и ложноотрицательных) результатов тестов на ВИЧ — ошибки, допущенные либо в лаборатории, либо до отправки образцов в лабораторию, либо после получения результатов. Случается, что образцы путают или материал из одного образца попадает в другой из-за по-

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 41

грешностей в ходе исследования, но возможны и чисто канцелярские ошибки (при маркировке пробирок, заполнении направлений в лабораторию, вводе данных в базу лаборатории или клиники). Следовательно, обеспечение качества лабораторных исследований требует пристального внимания даже к таким, казалось бы несущественным, деталям!

Подтверждающий иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг — наиболее часто используемый метод подтверждения реактивных результатов скри- нинг-тестов. Чтобы получить тест-полоски для иммуноблоттинга, ВИЧ поселяют в культуру клеток, инкубируют, очищают и денатурируют (расщепляют на части). Затем с помощью электрофореза вирусные протеины-антигены разделяют в соответствии с их молекулярным весом и наносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на ленты. Чтобы провести тест, сыворотку пациента инкубируют с мембраной. Если в сыворотке имеются антитела к тем или иным нанесенным на мембрану вирусным антигенам, они оседают на соответствующие участки мембраны. Чтобы выявить образовавшиеся комплексы антиген-антитело, используют меченые ферментами антитела с соответствующим субстратом. В результате на мембране появляются так называемые полосы.

Антигены ВИЧ и соответствующие им полосы мембраны для иммуноблоттинга обозначают как «p» (протеин) или «gp» (гликопротеид). За обозначением указывается молекулярная масса (умноженная на 1000). Все эти антигены можно разделить на три группы (в качестве примера взят иммуноблоттинг на ВИЧ-1): Env — гликопротеиды внешней оболочки (gp41, gp120, gp160), Gag — капсидные белки (p18, p24/25, p55) и Pol —протеины обратной транскриптазы, протеазы и интегразы (p34, p40, p52, p68).

Иммуноблоттинг, будучи подтверждающим тестом, проводится только при получении реактивного результата скрининг-теста. В продаже имеются наборы для иммуноблоттинга на ВИЧ-1 и на ВИЧ-2. Результат иммуноблоттинга может быть положительным, отрицательным или сомнительным (неполный набор полос). Последний может свидетельствовать о пограничных или неспецифических реакциях.

Критерии положительного результата иммуноблоттинга различаются в зависимости от организации, которая их разработала. Так, «Американский Красный Крест» определяет результат иммуноблоттинга как положительный при появлении хотя бы одной полосы каждой группы (одной полосы группы Gag, одной — группы Pol и одной — группы Env). Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) установило следующие критерии положительного результата имму-

ноблоттинга: полосы p24, p34 и gp41 (или gp120/160) (Centers for Disease Control and Prevention, 1989). В

соответствии с рекомендациями ВОЗ, счесть результат иммуноблоттинга положительным позволяет наличие двух полос группы Env. В Германии нормативом 58969 часть 41 Немецкого нормативного института установлено следующее правило (Deutsches Institut für Normung, 2000): образец сыворотки ВИЧ-положителен, если он взаимодействует хотя бы с одним вирусным гликопротеидом и одним протеином. При любом другом наборе полос результат иммуноблоттинга считается сомнительным.

Среди недостатков иммуноблоттинга — высокая стоимость, относительная сложность методики исследования и неизбежная субъективность при считывании и толковании результатов. В связи с этим многие страны предпочли разработать специальные алгоритмы подтверждения результатов. В них указано, при каких обстоятельствах следует использовать те или иные сочетания методов ИФА или экспресс-тестов с известными чувствительностью и специфичностью.

Чтобы поставить диагноз ВИЧ-инфекции, необходимо не только провести подтверждающие тесты (например, иммуноблоттинг), но и обязательно исследовать еще один — полученный в другое время — образец крови. По возможности, сообщать пациенту диагноз следует только после тестирования второго образца крови.

Экспресс-тесты

Сегодня выпускается множество экспресс-тестов на ВИЧ. Они известны как «тест на месте», «тест у постели больного» и «упрощенный экспресс-тест». В их основе лежит один из четырех методов: реакция агглютинации, ИФА на полимерных мембранах (тест-полоски), иммунологический фильтрационный анализ либо иммунохроматография (Giles 1999, Branson 2000). Большинство таких тестов позволяет получить результат через 15-30 минут. Многие предназначены для исследования цельной или капиллярной крови (из кончика пальца или мочки уха), что исключает существующую при исследовании венозной крови необходимость центрифугировать образец.

Во многих экспресс-тестах имеется «встроенный» контроль, то есть контрольная полоса, показывающая, верно ли нанесены кровь и реагенты (когда они есть). Если контроль свидетельствует об ошибке, резуль-

42 Тестирование на ВИЧ

тат теста считается недействительным (важно не получить ложноотрицательный результат, который возможен, например, когда кровь не нанесена или результат считан раньше времени).

Подобные экспресс-тесты полезны, когда результат необходимо получить быстро, например, в приемном отделении, перед срочными хирургическими вмешательствами или после случайной травмы иглой. Кроме того, они позволяют сократить частоту «невостребованности» результатов тестирования, ведь при получении результата теста через несколько дней некоторые пациенты не обращаются за ним. Поскольку экспресс-тесты просты в исполнении и не требуют сложного оборудования, они служат хорошим подспорьем для развивающихся стран (Branson 2003; WHO 2004). Тем не менее, такие тесты должны отвечать всем основным требованиям, предъявляемым к скрининг-тестам на основе ИФА (WHO/UNAIDS 1998). Теоретически, в развитых странах экспресс-тесты должны использоваться только в качестве ориентировочных, и после них пациентам следует как можно скорее пройти полноценное лабораторное тестирование. Основной проблемой применения экспресс-тестов (помимо потребности в обучении персонала) является необходимость консультировать пациента перед тестированием и получать его согласие на проведение теста. Кроме того, любой тест на ВИЧ, доступный непрофессионалам, может использоваться неправомерно (скажем, для принудительного тестирования заключенных).

В настоящее время в Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США лицензированы несколько новых экспресс-тестов на ВИЧ: OraQuick® (OraSure Technologies, Пен-

сильвания, США), Reveal™ (MedMira Laboratories, Галифакс, Новая Шотландия), Uni-Gold Recombigen™ (Trinity Biotech, Ирландия) и одноразовая диагностическая система Murex. Недавно, после ряда настораживающих ошибок (было установлено, что по крайней мере у пяти ВИЧ-инфицированным реактивный результат экспресс-теста был расценен как ложноположительный, и им сообщили, что у них нет ВИЧинфекции!) Центры контроля и профилактики заболеваний (CDC) указали на необходимость проверять результаты экспресс-тестов качественными подтверждающими тестам, а при необходимости и контрольными тестами через 4 недели (CDC 2004).

Материал для тестирования

Как правило, в тестах на антитела к ВИЧ исследуют сыворотку, плазму, обработанную ЭДТА, и — иногда — цельную кровь. Если исследование проводится не сразу, из образцов плазмы или сыворотки желательно удалить эритроциты, поскольку гемолиз препятствует проведению некоторых тестов.

Иммуноглобулины можно определить даже в мазке крови, высушенном на фильтровальной бумаге. Исследование таких сухих мазков на антитела к ВИЧ используют для массовых (анонимных и не позволяющих идентифицировать личность) обследований беременных и родильниц. В подобных случаях используют стандартные тест-карточки для поголовного исследования новорожденных на фенилкетонурию по методу Гатри (содержание антител в крови новорожденного отражает таковое в крови его матери). Приготовление сухих мазков — удобный и недорогой способ получения материала для исследования в развивающихся странах при недостатке холодильных установок и транспорта. Полностью высушенная кровь перестает быть источником инфекций, даже ВИЧ-инфекции.

Для некоторых тестов используют мочу или мазок из полости рта (иногда его называют слюной, но это неверно, поскольку материалом для исследования служит отделяемое слизистой) (Tamashiro 1994; King 2000). Экспресс-тест мазка из полости рта был лицензирован Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США в марте 2004 г., в нем используется та же технология, что и в тесте, поставляемом на рынок OraSure Technologies, который в ноябре 2002 г. был лицензирован в качестве экспресс-теста на антитела к ВИЧ в цельной крови (см. выше). По имеющимся данным, этот тест определяет антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с чувствительностью 99,3% и специфичностью 99,9 %.

В определенных обстоятельствах моча и мазок из полости рта — единственно возможные материалы для тестирования, поскольку, в отличие от образцов крови, их получение не требует инвазивного вмешательства. Однако чувствительность и специфичность тестов, которые проводятся мочой и мазком из полости рта, по большей части невелики. Таким образом, кровь остается главным материалом для тестирования. Важно помнить, что реактивный результат теста на любом материале, безусловно, должен проверяться подтверждающим тестом.

Характеристики теста

Тесты на антитела к ВИЧ — одни из самых лучших коммерческих иммунологических тестов. Наиболее важными их характеристиками являются чувствительность (высокая чувствительность → мало ложноотрицательных результатов) и специфичность (высокая специфичность → мало ложноположительных результатов). У каждого теста они свои и рассчитываются отдельно. Однако наибольший практический ин-

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 43

терес представляют не чувствительность и специфичность теста, а предсказательная ценность его результатов. Это объясняется тем, именно результаты теста должны позволить нам определить ВИЧ-статус пациента. Предсказательная ценность положительного результата — это вероятность того, что пациент с положительным результатом теста действительно инфицирован. И наоборот: предсказательная ценность отрицательного результата — это вероятность того, что пациент с отрицательным результатом теста и в самом деле не инфицирован.

В таблице 1 представлена связь между характеристиками:

Чувствительность

=число положительных результатов / (число положительных результатов + число ложноотрицательных результатов)

=вероятность положительного результата при наличии инфекции

Специфичность

=число отрицательных результатов / (число отрицательных результатов + число ложноположительных результатов)

=вероятность отрицательного результата в отсутствие инфекции

Предсказательная ценность положительного результата

=число положительных результатов / (число положительных результатов + число ложноположительных результатов)

=вероятность наличия инфекции при положительном результате теста

Предсказательная ценность отрицательного результата

=число отрицательных результатов / (число отрицательных результатов + число ложноотрицательных результатов)

=вероятность отсутствия инфекции при отрицательном результате теста

На первый взгляд это может показаться невероятным, и тем не менее предсказательная ценность результатов теста зависит не только от его чувствительности и специфичности, но и от распространенности ВИЧ-инфекции в данной популяции (то есть от исходной вероятности иметь соответственно положительный или отрицательный ВИЧ-статус). Эта зависимость показана на рис. 1 на примере воображаемой популяции с долей серопозитивных по ВИЧ лиц от 0,02 % (например, доноры крови в европейской стране) до 20 % (например, группа сексуально активного населения в стране с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции). На рис. 1 видно, что при низкой распространенности ВИЧ-инфекции (0,02%) преобладающее большинство положительных (или, точнее, реактивных) результатов теста в действительности ложноположительны: инфицированными оказываются лишь 4.8% лиц, получивших положительный результат теста!

Напротив, в группе с высоким риском ВИЧ-инфекции (распространенность 20%) 98% положительных результатов теста действительно положительны. Именно поэтому в рекомендациях ВОЗ указано, что при высокой распространенности ВИЧ-инфекции подтверждать положительные результаты скрининг-тестов не обязательно. Представленные примеры показывают, насколько важно верно выбрать тактику подтверждения положительных результатов скрининг-тестов!

К сожалению, описанный статистический феномен нередко используют в пропагандистских целях. Скажем, в популяции доноров крови в Германии, где распространенность ВИЧ-инфекции мала, действительно положительными будет лишь небольшая часть реактивных результатов скрининг-тестов. Для обследуемых это не должно было бы иметь существенного значения, поскольку в любом случае реактивный результат скрининг-теста проверяется и, когда иммуноблоттинг его не подтвердит, пациенту (или донору крови) просто должны были бы сообщить, что его ВИЧ-статус не является положительным!

Тем не менее, как ни печально, расхождения между действительно положительными и ложноположительными результатами часто используют в качестве «доказательства» мнимой пользы тестов на ВИЧ.

Рисунок 1. Зависимость предсказательной ценности положительного результата от доли серопозитивных лиц в исследуемой популяции при использовании теста с постоянной специфичностью 99,6%

(4 ложноположительных результата на 1000 исследованных образцов).

Когда проводить тестирование?

С момента заражения до тех пор, пока в результате иммунного ответа в крови ВИЧ-инфицированного появится такое количество антител, которое может быть выявлено, обычно проходит от 3 до 12 недель. В связи этим не следует проводить тестирование вскоре после опасного заражением контакта даже если пациент по вполне понятным причинам обеспокоен и требует обследования. Однако при профессиональном контакте тестирование необходимо выполнить немедленно — это необходимо, чтобы убедиться, что подвергшийся риску заражения медицинский работник изначально серонегативен! Примерно у 5% лиц с момента заражения до появления в крови определимого титра антител проходит более 2 месяцев. Следовательно, следующий тест можно назначить на более поздний срок.

Вероятность приобрести ВИЧ-инфекцию возрастает, если хотя бы на один из приведенных ниже вопросов пациент может ответить утвердительно.

Вступали ли вы в половые отношения с ВИЧ-инфицированным партнером без презерватива? Имелись ли у вас ранее инфекции, передающиеся половым путем, такие как хламидиоз или гонорея?

Пользовались ли вы теми же шприцами или иглами (общими иглами), что и другие потребители наркотиков?

Делали ли вам переливание крови или ее препаратов в период с 1978 г. по 1985 г?

Вступали ли вы в половой контакт с кем-либо, кто мог бы ответить «да» на приведенные выше вопросы?

Сегодня все чаще говорится о том, что тестирование на ВИЧ необходимо «лишить особого статуса» (Manavi et al., 2005; Beckwith et al., 2005). Установлено, что с распространением эпидемии за пределы групп риска многие случаи ВИЧ-инфекции могут быть упущены, а дополнительная нагрузка, связанная с необходимостью проводить полноценное предтестовое консультирование, может стать препятствием к тому, чтобы медицинские работники предлагали пациентам пройти тестирование.