4 курс / Дерматовенерология / Хламидийно_ассоциированные_инфекции_Хворик_Д_Ф_

поздних генов L1 и L2. Экспрессия происходит на конечной стадии дифференцировки эпидермиса в ороговевающем слое, где происходят активная сборка зрелых вирусных частиц, их выделение из клеток и почкование непосредственно на поверхности кожи.

ВПЧ вызывает подавляющее большинство (более 90%) случаев инвазивного рака аногениталий, причем 50% из них

– 16-й тип вируса. 16-й тип часто обнаруживают в ткани плоскоклеточного рака шейки матки, а 18-й тип – в ткани железистого рака – аденокарциномы [4].

Имеются данные о выраженной корреляции диагноза рака шейки матки 2–3 стадий с наличием антител к ВПЧ и ВПГ-1, однако связи между развитием опухоли и носительством ВПГ-1 не обнаружено.

Получены убедительные данные, что латентная ПВИ шейки матки, обусловленная ВПЧ высокого онкогенного риска (16 и 18 типов), сопровождается дисбиотическими состояниями влагалищной микрофлоры, а также инфицированием С.trachomatis (Кузнецова Ю.Н. и соавт., 2003). Подтверждаются сведения о недостаточности простого носительства ВПЧ для малигнизации и о необходимости изучать влияние сопутствующих развитию опухолей факторов: вирусов герпеса, цитомегаловирусов, хламидий, других возбудителей ИППП [4].

Примерно у трети женщин с интраэпителиальной неоплазией вульвы также обнаруживается влагалищная интраэпителиальная неоплазия, поэтому всем женщинам с аногенитальными бородавками для выявления возможных бородавок во влагалище и/или на шейке матки показано исследование в зеркалах. Для выявления плоских поражений можно использовать цитологическое исследование и кольпоскопию. При этом кольпоскопия является более чувствительным методом. В отличие от поражений вульвы, при лечении поражений шейки матки обязательно проводится гистологическое исследование; биопсия выполняется под контролем кольпоскопа.

По данным В.И. Козловой и А.Ф. Пухнер (2003), доказано, что в связи с иммунодефицитом, вызванным снижением числа лимфоцитов CD4+, ВПЧ шейки матки и связанные с

191

ней плоскоклеточные интраэпителиальные поражения чаще наблюдаются у ВИЧ-инфицированных женщин. Однако ВПЧ-инфекция и плоскоклеточные интраэпителиальные поражения встречались чаще среди ВИЧ-инфицированных девочек, хотя они практиковали такое же рискованное поведение в отношении половых контактов, как и не инфицированные ВИЧ девочки, и были относительно здоровы. Вероятно, пролиферация ВПЧ при ВИЧ-инфекции, особенно на ее ранних стадиях, вызвана не снижением числа лимфоцитов CD4+, а другими причинами.

Инфекции шейки матки, вызванные вирусами папилломы человека типов 16 и 18, чаще сочетаются с цервикальной интраэпителиальной неоплазией различной степени тяжести. Имеются доказательства существования двух этиологически различных разновидностей эпидермоидной карциномы вульвы. Одна из них ассоциируется с ВПЧ высокой степени онкогенного риска и представляет собой злокачественное образование, гистологические характеристики которого соответствуют базолоидной или бородавчатой карциноме. Другая разновидность – это кератинизированная плоскоклеточная карцинома, которая встречается в основном у пожилых женщин и значительно реже ассоциируется с ВПЧинфекцией [4, 151].

Не исключено, что масштабы распространения и онкогенный потенциал редких типов ВПЧ (59, 61, 62, 70, 73 и др.) до сих пор недооценивались при развитии предраковых и раковых поражений гениталий, из них на долю плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкой степени тяжести приходится 12%, высокой степени тяжести – 8% и 4% рако-

вых поражений (Meyer Т., et. al., 1998).

По данным J. Dillner et al. (1998), ВПЧ-16 и ВПЧ-18

могут играть этиологическую роль в развитии некоторых случаев рака предстательной железы, злокачественных поражений вульвы, влагалища и ануса.

Современные методы диагностики ВПЧ могут быть подразделены на классические (цитологический метод, гистологическое исследование биоптатов, кольпоскопия, определение антител к ВПЧ) и молекулярно-генетические.

192

Диагностика ВПЧ, согласно Европейским стандартам, представлена в таблице 35 [43, 55].

Таблица 35 – Диагностика ВПЧ согласно Европейских стан-

дартов [43, 55]

193

Цитологическое исследование. Цитологические и гистологические изменения при ВПЧ-инфекции впервые описаны в 1976 году Мейсельсоном. Много лет для диагностики рака шейки матки и предшествующих ему состояний применяли цитологический метод исследования, с помощью которого выявляли атипичные многоядерные клетки. Однако данная методика достаточно субъективна и не отвечает современным требованиям (Башмакова М.А., Савичева A.M., 2003; Киселев В.И. и соавт., 2004; Дмитриев Г.А. и соавт., 2006).

194

При цитологическом исследовании используют окрашивание мазков по Папаниколау. Критерием обнаружения ВПЧ при цитологическом исследовании шеечных мазков является наличие в них койлоцитов (клеток с обширной зоной просветления вокруг ядра и дискератоцитов (клеток с увеличенным темным пикнотическим ядром из поверхностных ороговевающих слоев многослойного плоского эпителия). Результат цитологического исследования подтверждают кольпоскопией с обработкой пораженных участков слизистой 3–5% раствором уксусной кислоты и раствором Люголя. Участки плоского эпителия, пораженные ВПЧ, в таком случае выглядят побелевшими и приподнятыми над окружающей тканью, расположены мозаично и напоминают лейкоплакию. Клинически значимо также выявление четких границ йоднегативного эпителия [39].

Цитологическое исследование шеечных мазков по Папаниколау (PAP – smear test) выделяет следующие результаты:

1-й класс – атипические клетки отсутствуют, нормальная цитологическая картина;

2-й класс – изменение клеточных элементов обусловлено воспалительным процессом во влагалище и (или) шейки матки;

3-й класс – имеются единичные клетки с изменениями соотношения ядра и цитоплазмы, диагноз недостаточно ясен, требуется повторение цитологического исследования или необходимо гистологическое исследование биоптированной ткани для изучения состояния шейки матки;

4-й класс – обнаруживаются отдельные клетки с признаками злокачественности, а именно с увеличенными ядрами и базофильной цитоплазмой, неравномерным распределением хроматина;

5-й класс – в мазке имеются многочисленные атипические клетки.

ПВИ подразделяют на клинически выраженную, субклиническую, латентную. Первые два варианта ПВИ характеризуются резкоили слабовыраженными изменениями эпителиальных клеток. В мазках с поверхности эпителия обнаруживают измененные койлоциты, представляющие собой

195

крупные вакуолизированные клетки со светлой цитоплазмой и перинуклеарным светлым ободком в виде нимба. Ядра клеток, как правило, пикнотичные и гиперхромные. При микроскопии препаратов отчетливо проявляются утолщение эпителия, акантоз, гиперхроматоз, папилломатоз. Механизм изменения цвета эпителия на белый при обработке уксусной кислотой неизвестен. Эта реакция неспецифична, т.к. наблюдается при других хронических воспалительных процессах и при истончении эпителия; соответственно, ее нельзя использовать для постановки диагноза.

При опухолевой трансформации созревание клеток атипичное; койлоцитоз развивается в верхней трети эпителия, часто распространен очагово, отмечается также полиморфизм ядер и увеличенное количество митозов, в т.ч. атипичных.

Доброкачественное течение ПВИ сопровождается наличием лишь небольшого количества койлоцитов и незначительным увеличением в них ядер. Койлоцитоз развивается непосредственно поверх парабазального слоя эпителия, митотические клетки сохраняются без изменений.

При латентном течении ПВИ измененных клеток не наблюдают.

Внастоящее время появляются сообщения о нетипичной картине мазков из цервикального канала у женщин с ВПЧ-инфекцией, получающих гормональную заместительную терапию в климактерическом периоде (Menezes G.А., 2001). Невероятно трудно, а иногда и невозможно проводить цитологический анализ на фоне сопутствующей инфекционной патологии. Таким образом, цитологическое исследование является недорогим и сравнительно простым методом диагностики, но недостаточно точным и специфичным.

В1992 году для обнаружения изменений тканей, обусловленных ВПЧ, была предложена проба с 5% раствором уксусной кислоты (Wikstrom A. et al., 1992). По мнению авторов, после обработки 5% раствором уксусной кислоты очаги поражения ВПЧ становятся на несколько минут сероватобелыми. Однако попытки его клинического применения показали низкую специфичность метода. Проба оказалась положительной при неспецифических кольпитах, вульвитах,

196

баланопоститах, генитальном герпесе, микротравмах, экземе и т. д. Тем не менее, в Европейском руководстве по аногенитальным бородавкам содержатся рекомендации по ее использованию для скрининга (Ван Крог Д. и др., 2002). Этот метод может быть полезен при определении участка для прицельной биопсии и уточнения границ поражения при хирургическом лечении, а также при колоноскопическом и кольпоскопическом исследованиях.

Кольпоскопия. Описаны характерные для ВПЧинфекции признаки, выявляющиеся при кольпоскопии. У больных с папилломавирусной патологией в ходе этого исследования выявляются множественные красные пятна, как йод-положительные, так и йод-отрицательные. Характерна картина точечного кольпита с толстыми точками или рисунком в виде полей, петель, колец, на которые не действует уксусная кислота, обнаруживаются йод-негативные участки с дискератозом. Для плоских интраэпителиальных кондилом характерны участки неправильной формы, имеющие белесоватый цвет, расположенные в зоне трансформации.

Гистологическое исследование. Решающее значение имеют другие диагностические подходы, в частности гистологический метод. Последний позволяет не только выявить койлоцитарную реакцию, но и оценить степень и характер поражения различных слоев эпителия, уточнить форму заболевания. Морфологическая диагностика становится более специфичной и информативной при использовании иммунохимического метода исследования, при котором возможно обнаружение антигенов ВПЧ в тканях.

Субклиническая форма ПВИ сопровождается такими морфологическими признаками, как акантоз, гиперплазия клеток базального и парабазального слоев многослойного плоского эпителия, пара- и гиперкератозом, клеточные элементы с койлоцитотической атипией.

Серологические методы. Данные методики диагно-

стики ВПЧ-инфекции непопулярны, так как существует огромное число серотипов вирусов, вследствие антигенного родства которых нередко отмечают т. н. перекрестные реакции. Кроме того, до последнего времени не удавалось получить надежные диагностические препараты. В последние го-

197

ды удалось создать вирусоподобные частицы, обладающие высокой специфичностью и реактивностью в иммунологических реакциях.

Молекулярно-генетические методы. Поскольку сте-

пень цитологической атипии оценивается с определенной долей субъективизма, в то время как ВПЧ-генетическая информация всегда присутствует в цервикальных интраэпителиальных поражениях, независимо от степени тяжести, для первичной диагностики инфекционной патологии шейки матки предлагается использовать молекулярнобиологические технологии. В последние годы широко обсуждается необходимость включения молекулярногенетических тестов на все идентифицированные в настоящее время высококанцерогенные типы ВПЧ в программу цервикального скрининга. Считается, что присутствие ДНК ВПЧ в шейке матки поможет идентифицировать от 20 до 30% женщин с цервикальными заболеваниями, которые имели ложно-отрицательные цитологические результаты. Вместе с тем, целесообразность скрининга на ВПЧ подвергается сомнению, поскольку большинство молодых женщин с ВПЧ в генитальном тракте имеют нормальную цитологию, низкий риск цервикального рака и самостоятельно элиминируют вирус в течение 12–24 месяцев.

Присутствие ВПЧ в биоптатах и мазках при субклинических формах инфекции, а также тип вируса можно определить по наличию ДНК генома вируса. Для этой цели применяется ПЦР-диагностика. Этот метод позволяет также определить серотип вируса, что имеет значение для прогноза дальнейшего развития заболевания. Многие специалисты отмечают высокую чувствительность ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-real time). Однако если быть объективным, наборы для ПЦР-анализа необходимо использовать при диагностике ПВИ в качестве скрининговых, поскольку с их помощью можно достоверно и в короткие сроки получить результаты для значительных групп обследуемых. Вместе с тем, применение ПЦР-анализа приводит к значительной гипердиагностике, поскольку во многих случаях инфицирование вирусами папилломы кратковременное, и заканчивается их элиминацией и санацией организма. Другими словами, поло-

198

жительный результат исследования ДНК ВПЧ свидетельствует лишь о наличии инфекции, но не позволяет достоверно прогнозировать развитие последствий [39, 134].

Метод может быть использован для анализа различных образцов: мазков, соскобов, смывов, биоптатов и тканей, заключенных в парафин. Пробы можно получить неинвазивным путем. В качестве материала для исследования используются: отделяемое или смывы со слизистых ротовой полости, ануса, гениталий и даже из эпидермиса. Наборы ВПЧ- прай-меров гибридизируются с высоконсервативными генами L1, которые кодируют капсидный белок. Для детекции продуктов амплификации используют набор длинных (400 п. н.) зондов, позволяющих определить тип вируса. Другой набор ВПЧ-праймеров гибридизуется с ранними генами Е6, которые сохраняются и после того, как вирусная ДНК попадает

вклетку. ПЦР продукты сначала анализируются с помощью гель-электрофореза в присутствии бромистого этидия. Типирование вирусной ДНК осуществляют при помощи дот-блот- гибридизации. Для идентификации разных типов ВПЧ используют типоспецифические олигонуклеотидные зонды. Этим методом можно выявить даже 10 копий ВПЧ.

Наряду с ПЦР-анализом, для детекции ВПЧ используют и другие амплификационные методы – ЛЦР, иммуноблоттинг (дот-блот, саузерн-блот), гибридизацию insitu на фильтре и ткани, систему гибридной ловушки – Digene Hybrid Capture System II. Однако в силу ряда обстоятельств эти хорошо воспроизводимые и высокоэффективные методологии в широкой практике применяют редко.

Реакция транскрибционной амплификации NASBA- Real-time имеет преимущества для практики, так как позволяет определять клинически значимую концентрацию вируса

вткани, что помогает врачу выбрать нужную тактику в данной ситуации (Тапильская Н.Н. и др., 2006).

Система двойной генной ловушки — используются РНК-пробы, комплементарные к полной геномной последовательности 13 канцерогенных типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) и 5 типов ВПЧ низкого риска (6, 11,42, 43, 44).

199

Наиболее информативным, высокочувствительным (98,1%) и специфичным (85-90%) методом в настоящее время является выявление ДНК в окрашенных препаратах in situ с цитологическим контролем. Перспективной является мультипраймерная модификация ЦПР, позволяющая выявить из одной пробы несколько типов ВПЧ (Bosch F. et al., 2002). В заключение раздела по диагностике ВПЧ-инфекции можно предложить порядок обследования при обнаружении атипичных клеток.

Предложены разнообразные подходы к достоверной диагностике ранних стадий цервикальных дисплазий. В этой связи применяют серологические методы выявления антител к онкобелкам папилломы в сыворотке крови пациентов, однако корреляции между титром антител и наличием цервикального рака выявить не удалось.

Большую важность приобретают исследования, направленные на поиск ранних вирусологических маркеров папилломавирусной инфекции и определение физического статуса ДНК ВПЧ (эписомальная, интегрированная фаза), а также вирусной нагрузки, необходимые для выявления патологического процесса на доклинической стадии (Шипицына Е.В. и соавт., 2004; Кубанов А.А., 2005; Куевда Д.А. и соавт., 2005; Катханов A.M., Катханова О.А., 2005; Шипулина О.Ю.

и соавт., 2005; Львов Н.Д. и соавт., 2007; Dalstein V. et al, 2003; Moberg et al, 2005; Shijders J, Meijer C., 2006).

Несмотря на перспективность изучения онкобелка Е7 при различном течении урогенитальной ПВИ, заболеваниях шейки матки воспалительного и пролиферативного генеза, исследования его содержания и экспрессии онкогена Е7, остается много вопросов относительно диагностической и клинической значимости интеграции онкогена Е7, особенно в преинвазивных поражениях (Киселев В.И., 2004; Дмитриев Г.А. и соавт., 2006; Золотоверхая Е.А. и соавт., 2007).

По мнению Г.А. Дмитриева (2007), несмотря на то, что в настоящее время основными методами диагностики ПВИ являются клинические, молекулярно-биологические (ПЦР с типированием ВПЧ, ДНК-гибридизация), цитологические, кольпоскопические, в недалеком будущем для ранней диагностики и прогноза ПВИ, вероятно, будет использоваться

200