4 курс / Дерматовенерология / КОЛЛАГЕН_В_КОСМЕТИЧЕСКОЙ_ДЕРМАТОЛОГИИ_

«специализация» напрямую зависят от активности матриксных металлопротеиназ - ММР. К наиболее изученным матрикинам человека относятся фрагменты эластина и коллагена I типа. Ингибиторами матрикинов проявили себя их комплементарные пептиды. Современное состояние знаний о вышеприведённых процессах будет представлено в этом разделе.

2.3.1. Формирование фрагментов коллагена

Под коллагеном далее будет подразумеваться основной белок межклеточного матрикса - коллаген I типа. Зрелый коллаген представляет собой сложнопереплетённые образования из фибрилл, каждая из которых является пучком из 5 однонаправленных тройных нитей-спиралей длиной 300 нм каждая

(рис. 2.4) (Kadler, 2017).

Рис. 2.4. Структура единичной фибриллы коллагена, состоящей из пяти нитей (тройных спиралей). Видно расположение брешей между нитями и их перекрытие. Участки узнавания ММР расположены в брешах периодически, с интервалом в примерно 1 мкм

Зрелый коллаген водонерастворим, и его плотная (за счёт межмолекулярных сшивок) пространственная структура делает его труднодоступным для ММР (Fields, 2014; Murphy, 2017). Из всех типов ММР только 4 способны расщеплять фибриллярный коллаген: ММР-1, ММР-8, ММР-13 и ММР-14 (Craig et al., 2015). ММР-1, ММР-8 и ММР-13 называют интерстициальными (иногда - классическими) коллагеназами, и в норме они неактивны (более подробно о ММР см. главу 3). С возрастом на фоне снижения концентрации коллагена растёт активность коллагеназ и происходит постепенное спонтанное расщепление коллагена (Kohl et al., 2011; Phillip et al., 2015; Li et al., 2015).

Резкий рост активности ММР наблюдается при патологиях (Wells et al., 2013). Однако даже при нормальных физиологических условиях в структуре человеческого коллагена происходят постоянные динамические изменения, спонтанно создавая с промежутками в 1 мкм более открытые участки для присоединения колла-геназ (Dittmore et al., 2016). Все ММР, и коллагеназы в частности, имеют два функциональных домена: субстрат-связующий домен и каталитический (расщепляющий) домен. В норме «посадки» коллагеназ на интакт-ный коллаген нередки, но они не приводят к его расщеплению, поскольку конформация интактного коллагена не позволяет каталитическому домену «приступить к работе» (Fields, 2013). С возрастом, при повреждениях или патологиях структура коллагена в коже и тканях существенно меняется - она становится гораздо более доступной для действия коллагеназ (Qin et al., 2014; Malik et al., 2015; Zitnay et al., 2017). Происходит это в результате эндогенных (мутаций, действия свободных радикалов, воспалений) и

Медицинские книги

@medknigi

экзогенных [ушибов, избытка ультрафиолетового (УФ) излучения] факторов

(Varani et al., 2001; Kaisers et al., 2017; Argyropoulos et al., 2016).

Можно предполагать, что ММР участвуют как в локальном восстановлении повреждённых элементов коллагеновых фибрилл, волокон и пучков по типу эксцизионной репарации двуспиральной ДНК, так и в расщеплении разрушенных структур коллагенового матрикса для полной его замены. Эти факторы активируют также экспрессию генов коллагеназ и белков-регуляторов самих коллагеназ при одновременном подавлении синтеза проколлагена (Fisher et al., 2009; Xia et al., 2013; Qin et al., 2014). Первичное (в единственном месте)

расщепление коллагена происходит в зависимости от типа клеток с помощью матриксных металло-протеиназ ММР-1/MMP-8/ММР-13/MMP-14 (Craig et al., 2015). В дерме взрослого человека практически весь коллаген (I типа)

расщепляется посредством ММР-1 и ММР-14 после их активации через ММР-3

(рис. 2.5) (Zigrino et al., 2016; Agren et al., 2015). В дальнейшем к расщеплению

«подключаются» желатиназы ММР-2 и ММР-9 (Wells et al., 2013).

Рис. 2.5. Взаимоотношения между путями формирования коллагеназ по мере их секреции из клетки и превращения в функциональные ферменты (Murphy, 2017). ЕСМ - внеклеточный матрикс

Коллагеназа ММР-14 (MT1-MMP) постоянно связана с клеточной мембраной, а ММР-7, ММР-8, а также желатиназы ММР-2 и ММР-9 привлекаются из матрикса к поверхности клеток при определённых обстоятельствах (Dayer, Stamenkovic, 2015). Это предполагает, что генерируемые ими фрагменты коллагена остаются вблизи поверхностных клеточных рецепторов. Само же расщепление коллагена происходит без помощи клеточных рецепторов (Cerofolini et al., 2016). Поскольку кроме коллагена важнейшую роль в дерме играет гиалуронан, интересно отметить, что некоторые коллагеназы потенциально могут влиять на функционирование его фрагментов. В частности, основной рецептор гиалуронана - CD44 - является также одним из рецепторов для MMP-9, а MMP-14 способна отщеплять от CD44 его эктодомен (Cerofolini et

Медицинские книги

@medknigi

al., 2016; Хабаров, Бойков, 2016). Некоторые ММР участвуют в высвобождении регуляторных белков, связанных и неактивных в комплексах на поверхности клеток. Так, например, ММР-9 и MMP-14 высвобождают важнейший белокрегулятор TGF-β из его комплекса с интегрином αvβ8 (Bai et al., 2017). Интересно, что ММР-1 и ММР-3 аналогично высвобождают TNFα, хотя они не относятся к поверхностным металлопротеиназам (Stamenkovic, 2003; Ågren et al., 2015).

В последние годы выявлены и изучены несколько функционально значимых пептидов коллагена (Abdul Roda et al., 2015; Gaggar, Weathing-

ton, 2016). В частности, коллагеновый трипептид Pro-Gly-Pro (называемый обычно PGP) образуется после нескольких стадий расщепления коллагена: сначала с помощью ММР-8, затем ММР-9 и пролил-эн-допептидазой на заключительном этапе. PGP и его ацетилированная форма AcPGP связываются с рецептором CXCR2 и стимулируют хемотаксис (движение подвижных клеток в ответ на химические раздражители) различного типа клеток. В случае нейтрофилов (neutrophils) AcPGP более активна, чем PGP. У хронических курильщиков отмечается самовоспроизводимый цикл формирования PGP: пока не установленные компоненты табачного дыма ингибируют лейкотрен-А4- гидролазу (leukotriene-A4-hydrolase) - обладающий аминопептидазной активностью фермент, расщепляющий PGP. Антагонистами для PGP являются трипептид аргинин-треонин-аргинин (RTR) и его олигомеры, а также трипептид аланин-серин-аланин (ASA). Наиболее выраженную активность против AcPGP

показал тетрамер RTR (Wells et al., 2013).

2.3.2. Рецепторы коллагена на поверхности клеток

αβ1-Интегрины

На поверхности клеток имеются трансмембранные рецепторы для коллагена, называемые αβ1-интегринами: α1β1, α2β1, α10β1 и α11β1 (Bar-czyk et al., 2010; Anderson et al., 2014). Они принадлежат к обширному семейству αβ, все члены которого имеют субъединичную структуру (рис. 2.6) (Horton et al., 2016;

Koivisto et al., 2013).

С αβ1-интегринами способны связываться различные типы коллагена. Так, лигандами для α1β1 являются коллаген I, III, IV, IX, XIII и XVI типов. Рецепторы α1β1, α2β1 и a11β1 узнают в молекулах коллагена одинаковую последовательность аминокислот - GFOGER (где О - гидроксипролин) (рис. 2.7) (Knight et al., 2000;

Davidenko et al., 2016).

Изучение взаимодействия αβ1-интегринов с коллагеном свидетельствует о его сложных и малопонятных пока молекулярных механизмах. Данные in

vitro, например, указывают, что α1β1 «предпочитает» мономерный коллаген по сравнению с фибриллярной структурой (Jokinen et al., 2004). У хондроцитов и некоторых других типов клеток αβ1-рецепторы «узнают» in vivo только тройную спираль коллагена, но не его отдельные фибриллы (Woltersdorf et al., 2017). Не исключено, что в тканях разных типов один и тот же αβ1-интегрин «предпочитает» различные структуры коллагена (Zeltz, Gullberg, 2016). Данные о связывании in vivo αβ1-интегринов с фрагментами коллагена пока отсутствуют.

Медицинские книги

@medknigi

эпидермиса EGF. У многих типов клеток не все αβ1-интегрины функционально активны: в гепатоцитах, например, активен только α1β1, у фибробластов основным рецептором связывания коллагена является α11β1, а у кератиноцитов - α1β1 (Zeltz et al., 2014). Создать адекватные модели in vitro пока не удаётся, поскольку контакт интегри-нов с коллагеном всегда сопровождается участием других белков внеклеточного матрикса. Поэтому основные исследования проводятся на моделях животных. Очевидно, что их результаты могут рассматриваться лишь условно применимыми к человеку. К примеру, мыши, у которых инактивировали любой один из этих рецепторов, почти не отличались от нормы, но удаление сразу двух - α1β1 и α2β1 - приводило к воспалениям и нарушениям в иммунной системе (Popova et al., 2007).

Рис. 2.7. Взаимодействие коллагена с α2β1 -интегрином (Davidenko et al., 2016) Все αβ1-интегрины функционируют в обоих направлениях: передают сигналы из межклеточного матрикса в клетки и наоборот. Внутриклеточные каскады реакций, инициируемые активированными αβ1-интегринами, изучались при различных патологиях (Barczyk et al., 2010; Bianconi et al., 2016; Boudjadi et al., 2016). Были определены основные участники первичной передачи сигналов с поверхности внутрь клетки и обратно (рис. 2.8).

Важно отметить, что конформация коллагена главным образом характеризует состояние межклеточного матрикса. Присоединение коллагена или его фрагментов к внеклеточному домену (N-концу) α-субъединицы интегрина изменяет её трансмембранную структуру, что приводит к разрыву блокировочной связи между цитоплазматическими С-концами а-и β-субъединиц и вызывает их раздвижение. Ни один из двух С-концов интегрина не обладает ферментативной активностью, но после активации приобретает способность присоединять регуляторные белки (Anthis,

Медицинские книги

@medknigi

внутриклеточного структурного белка или о нарушении внутриклеточного гомеостаза. В этом случае сигнал идёт через β-субъединицу и основным цитоплазматическим белком-посредником служит талин. Он способен разрывать связь между С-концами α- и β-субъединиц, которая служит блокатором сигналов (позже выяснилось, что такой же способностью обладают белки из семейства киндлинов) (Vinogradova et al., 2002). К талину могут присоединяться винкулин, паксиллин, тензин, филамин, актинин и другие белки. При обоих направлениях передачи сигналов активация интегрина связана с дефосфорилированием С-конца его β-субъединицы (Morse et al., 2014).

Характерной особенностью DDR-1/2-рецепторов по сравнению с другими белками является необыкновенно длительное (в течение дней) поддержание состояния в фосфорилированной форме (Fu et al., 2013). Как и в случае с αβ1- интегринами, присущая зрелому коллагену четвертичная структура не является необходимой для его успешного контакта с DDR-1/2 in vivo, но оба рецептора связываются только с нативными тройными спиралями коллагена (Carafoli, Hohenester, 2013). Более того,

Рис. 2.9. Активация DDR-рецепторов: A - в отсутствие контакта с коллагеном молекула DDR представляет собой димер за счёт контакта между мономерами в мембране клетки; Б - после контакта с коллагеном (две бирюзовых сферы) и фосфорилирования цитоплазматического домена (жёлтые сферы) DDR переходит в активное состояние если из молекул нативного коллагена удалить неспиральные «хвосты», то связывание с ними DDR-1/2 происходит даже

Медицинские книги

@medknigi

эффективнее. Контактов DDR-1/2 с отдельными цепями молекулы коллагена или его фрагментами не выявлено. Исследования DDR проводились до сих пор исключительно in vitro или суррогатных моделях ex vivo, поэтому остаётся невыясненным, насколько важна в норме роль этих рецепторов в организме человека (Leitinger, 2014). Мыши, у которых DDR-1 был инактивирован, имели высокое содержание утолщённых фибрилл коллагена, а у мышей без DDR-2

наблюдалось накопление коллагена (Mihai et al., 2006; Zhu et al., 2015). DDR-1/2

в разной мере активны во всех типах тканей и играют важную, но различную роль во многих биологических процессах, начиная с эмбриональных: дифференциации, пролиферации и миграции клеток, поддержание тканевого гомеостаза (Nho, Polunovsky, 2013). Как и в случае с α1β1-интегрином, связывание коллагена с DDR-1 тормозит синтез внутриклеточного проколлагена и усиливает активности основных коллагеназ (ММР-1 и ММР-13) и желатиназ (Flynn et al., 2010). Предполагается, что этим обусловлена стимуляция DDR-1 воспалительных процессов при атеросклерозе, фиброзе лёгких и почек, а также роста опухолей (Guerrot et al., 2011; Borza, Pozzi, 2014;

Rammal et al., 2016). Активация DDR-2 также способствует развитию различных патологий (Zhu et al., 2015; Ge et al., 2016). Это может быть связано со способностью активированного коллагеном DDR-2 активировать поверхностную ММР-14 (Majkowska et al., 2017). В отличие от DDR-1, DDR-2

способствует подавлению роста опухолей путём стимуляции активности антиракового белка р21 (Saby et al., 2016). Связано это со структурой коллагена и наблюдается только у здоровых людей, не достигших старости (рис. 2.10).

Медицинские книги

@medknigi

Рис. 2.10. Регуляция DDR-2 активности антиракового белка р21 (Saby et al.,

2016)

2.3.3. Матриксные рецепторы коллагена

В межклеточном матриксе коллагену приходится контактировать со многими белками, но в нашем контексте мы коротко рассмотрим лишь данные, касающиеся свободных форм DDR. При отклонениях от физиологической нормы и патологиях у DDR-1 наблюдается два независимых друг от друга процесса: отщепление эктодомена от N-конца и отщепление фрагмента от его С-

конца, названного CTF (tyrosine phosphorylated C-terminal fragment) (Slack et al.,

2006; Juskaite et al., 2017). Эти процессы называют шеддингом (shedding) (Shitomi et al., 2015). Такое отщепление осуществляют поверхностные ММР: ММР-14, ММР-15 и ММР-16, но на него не способны ММР-1 и ММР-13 (Fu et al., 2013). Судьба CTF-фрагмента может быть двояка: транспортировка посредством эндоцитоза внутрь клетки и далее в ядро или «свободное плавание» в межклеточном матриксе до момента встречи с одной из экзопептидаз. В ядре CTF-фрагмент может участвовать в белковых комплексах, регулирующих активность промоторов (Flynn et al., 2010). Отщеплённый эктодомен способен мигрировать через межклеточный матрикс, попадать в кровоток и связываться с коллагеном вдали от клетки. В межклеточном матриксе эктодомен может связываться с коллагеном, частично предотвращая его связывание с полноценными поверхностными DDR-1-рецепторами. Отражается ли это на каких-то важных физиологических процессах, неизвестно. Также неясно, происходит ли in vivo шеддинг у DDR-2 - данные относительно этого несколько противоречивы (Fu et al., 2013; Flynn et al., 2010). В

экспериментах с мышами искусственно индуцированные свободные (soluble) формы эктодоменов DDR-1 и DDR-2 частично подавляли фибриллогенез и изменяли морфологию фибрилл (Flynn et al., 2010).

2.3.4. Рецепторы эластина

К 2010-м гг. накопилось достаточно данных, свидетельствующих, что роль эластина не ограничивается только структурной компонентой межклеточного матрикса. В глубоком слое дермы эластин составляет лишь около 2% белков кожи, но, как и в других тканях, оказывает собственное важное влияние на передачу сигналов в клетки (Rodgers, Weiss, 2005; Duca et al., 2016; Wells et al., 2015). Связывание с межклеточными белками и клеточными поверхностными рецепторами отмечается у ин-тактного эластина и у его фрагментов, но при повреждениях и патологиях превалируют именно фрагменты, большинство которых образуется под действием трех типов активирующихся эластаз (Ntayi et al., 2004; Devy et al., 2010; Dale et al., 2016; Imokawa, Ishida, 2015; Kawecki et al., 2014). В частности, ММР-12 «надкусывает» тропоэластин в 89 местах, а ММР-7 и ММР-9 - в 58 и 63 сайтах соответственно (Heinz et al., 2010). Поскольку фрагменты эластина обладают биологической активностью в качестве триггеров молекулярных реакций, то по аналогии с цитокинами они получили название эластокинов (elastokines) (Antonicelli et al., 2007; Sproul, Argraves, 2013). Другое название фрагментов эластина - EDP (elastin degraded peptides). Биологическая активность выявлена у следующих пептидов: GVYPG, GFGPG, GVLPG,

Медицинские книги

@medknigi

YGARPGVGVGGIP и PGF-GAVPGA (Heinz et al., 2010; Wells et al., 2015). Но основным эластокином у человека проявил себя пептид Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly (VGVAPG).

Он образуется в результате состоящего из нескольких стадий процесса отщепления одного из повторяющихся фрагментов в С-конце молекулы тропоэластина, предшественника эластина (Van Doren et al., 2015).

В качестве основного рецептора для VGVAPG выявлен белок EBP (обозначаемый иногда как EBP67), который представляет собой 67 кДа изоформу альтернативного сплайсинга p-галактозидазы (S-Gal) (Blanche-voye et al., 2013; Almine et al., 2013). В норме EBP не активен. Он имеет два функциональных участка: один для связывания с интактным эластином или его фрагментами, а другой (galactolectin) - для связывания сахаров (обычно галактозы). Присоединение сахара к EBP приводит к его отделению от комплекса, что ингибирует функцию эластокина как триггера. Связывание EBP с эластокинами активирует поверхностный домен трансмембранного белка - нейроминидазы-1 (NEU-1), которая начинает «работать» как сиалидаза (sialidase) по отношению к прилегающим ганглиозидам (Hinek et al., 2008; Rusciani et al., 2010; Maurice et al., 2016). Это приводит к образованию вторичного мессенджера - лактозилкера-мида (lactosylceramide, или LacCer), который способен активировать несколько внутриклеточных сигнальных путей

(Dridi et al., 2013; Luzina et al., 2016; Scandolera et al., 2016). Конечным результатом является стимуляция многих процессов в клетках и их окружении

(рис. 2.11).

При старении отмечается постепенное нарастание концентрации фрагментов эластина в коже, которые вместе с фрагментами коллагена стимулируют повышенный уровень NEU-1 на поверхности фибробла-стов (Duca et al., 2016; Sasaki et al., 2017). При этом наблюдается снижение концентрации рецептора CD44, что, предположительно, должно приводить к замедлению дифференциации фибробластов в миофи-бробласты и к снижению синтеза нового коллагена. Пептид VGVAPG стимулирует различные процессы в нормальных клетках фибробла-стов, меланогенез, а также пролиферацию дендритных клеток. Появление при некоторых патoлогиях поперечной сшивки в этом пептиде стимулирует проинфламаторные клетки к постоянной активности, что в случае, например, лёгочной ткани приводит к энфиземе. Достаточно продолжительная активация EBP приводит к пролиферации мускульной ткани, утолщению стенок сосудов и увеличению их жёсткости.

Кроме EBP, выявлены также несколько «миноритарных» рецепторов для эластина и его фрагментов. К ним относятся интегрины αvβ3 и αvβ5, а также галектин (galectin-3) (Gan, Rünger, 2011; Pocza et al., 2008; Scandolera et al., 2016). С-конец тропоэластина содержит пептид RKRK, который связывается с клеточным рецептором αVβ3, а его центральная часть связывается с рецептором

αVβ5 (Broekelmann et al., 2005; Lee et al., 2014). Вероятно, существуют пока не идентифицированные белки, с которыми контактируют эластокины. В некоторых типах опухолей, например, связывание пептида VGVAPG со своими рецепторами тесно коррелирует с активностью поверхностной протеинкиназы

Медицинские книги

@medknigi