2 курс / Гистология / Цветков_И_С_Структурно_функциональные_изменения_предстательной_железы

На правах рукописи

Цветков Иван Сергеевич

СТРУКТУРНО–ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ КРЫС ВИСТАР ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ АУТОИММУННОМ ВОСПАЛЕНИИ В УСЛОВИЯХ НОРМО- И ГИПЕРАНДРОГЕНЕМИИ

03.03.04 − клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2012

1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

Ведущая организация – Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится « 27 » сентября 2012 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном

бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан «____» августа 2012 года

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одной из важных проблем клинической андрологии является хронический простатит в связи с тем, что этиология и патогенез его недостаточно изучены, а лечение не всегда эффективно. Заболеванием страдают мужчины репродуктивного возраста. Распространённость хронического простатита составляет 2–16% (Shoskes D.A., Nickel J.C., 2011).

В клинической классификации простатита Национального Института Здоровья США (NIH, 1998) выделяют следующие классификационные группы простатита: категория I – острый бактериальный простатит – острое

хронической тазовой боли, основным клиническим критерием заболевания является болевой синдром, длящийся более 3 мес. Эта категория хронического простатита подразделена на воспалительный синдром хронической тазовой боли (III А) и невоспалительный синдром хронической тазовой боли (III В); категория IV – асимптоматический воспалительный простатит.

Структурно-функциональные особенности предстательной железы в норме, при гиперандрогенемии и хронических воспалительных процессах у человека изучены недостаточно вследствие ограниченных возможностей получения биопсийного материала.

Влитературе обсуждается роль аутоиммунных механизмов в развитии синдрома хронической тазовой боли (Depiante-Depaoli M., Pacheco-Rupil B., 1985; Maccioni M., 1998), а также культивируемых неклассическим путем микроорганизмов (Хомяков Ю.Н., Северин С.Е., 2007; Domingue G.J., Sr. Hellstrom W.J., 1998; Mandar R., Raukas E. et al., 2005). Для изучения иммунологических механизмов хронического простатита и синдрома хронической тазовой боли широко используются экспериментальные модели аутоиммунного простатита. Аутоиммунный воспалительный процесс в предстательной железе индуцируется у лабораторных животных подкожным введением гомогената добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда

(Pacheco-Rupil B., 1981; Orsilles М.А., 1995). В ряде работ представлены данные о морфологических проявлениях экспериментального хронического аутоиммунного простатита, выявлены простатоспецические антигены, введение которых вызывает развитие аутоиммунного воспалительного процесса в предстательной железе (Depiante-Depaoli M., Pacheco-Rupil B., 1985; Maccioni M., 1998).

Однако в литературе отсутствуют сведения о структурных изменениях предстательной железы и ее долей при экспериментальном хроническом аутоиммунном простатите, а также остаются неизученными морфофункциональные изменения органов иммунной системы.

Впоследнее десятилетие у мужчин для коррекции метаболического синдрома, андрогенной недостаточности, а также с целью контрацепции стали достаточно широко использоваться фармакологические препараты

3

тестостерона (Nieschlag E. et al., 2010). В литературе сведения о влиянии гиперандрогенемии на морфологические и иммунологические проявления хронического простатита и синдрома хронической тазовой боли отсутствуют, что диктует необходимость проведения дальнейших экспериментальных исследований.

Цель исследования – изучение морфофункциональных изменений дорсальной и вентральной долей предстательной железы и органов иммунной системы при моделировании хронического аутоиммунного воспалительного процесса на фоне физиологического и повышенного уровня андрогенов

Задачи исследования

1.Провести морфологическую и морфометрическую оценку структурных особенностей дорсальной и вентральной долей предстательной железы крыс Вистар в норме.

2.Провести иммуноморфологическое исследование для доказательства наличия аутоантител в сыворотке крови крыс с экспериментальным хроническим аутоиммунным простатитом.

3.Изучить морфологические изменения дорсальной и вентральной доли предстательной железы при экспериментальном хроническом аутоиммунном воспалительном процессе.

4.Провести сравнительную морфометрическую оценку функциональных зон тимуса, селезёнки, определить цитокиновый профиль у крыс Вистар при экспериментальном хроническом аутоиммунном простатите.

5.Изучить морфологические изменения предстательной железы, органов иммунной системы и цитокиновый профиль у крыс Вистар с гиперандрогенемией.

6.Провести сравнительную оценку морфологических изменений предстательной железы, органов иммунной системы и цитокинового профиля у крыс Вистар при хроническом аутоиммунном простатите на фоне физиологического уровня тестостерона и при гиперандрогенемии.

Научная новизна. Впервые с помощью морфометрических методов проведена объективная сравнительная оценка структуры вентральной и дорсальной долей предстательной железы у крыс Вистар. Показано, что в дорсальной доле выше объемная доля ацинусов и ацинусов, содержащих секрет, эпителия, показатель индекса дегрануляции тучных клеток и ниже доля внутридольковой стромы, а содержание фиброцитов среди клеточных элементов в ней выше.

Установлено, что при хроническом аутоиммунном воспалительном процессе структурные изменения вентральной и дорсальной долей предстательной железы различаются. В дорсальной доле снижается объемная доля ацинусов, содержащих секрет, и объемная доля эпителия. В вентральной доле объемная доля ацинусов увеличивается, а стромы

десквамированных эпителиальных клеток в просвете ацинусов, объемной доли воспалительного инфильтрата и содержания в нем лимфоцитов и фибробластов.

При хроническом аутоиммунном простатите у крыс Вистар развивается вторичное иммунодефицитное состояние, характеризующееся акцидентальной инволюцией I-II стадии, гиперплазией белой пульпы селезенки за счет ПАЛМ-зоны и снижением продукции цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-γ, ФНО-α клетками селезенки, активированными Con-A.

Гиперандрогенемия вызывает изменение морфофункционального состояния предстательной железы крыс: увеличение объемной доли ацинусов без секрета и десквамированного эпителия, уменьшение числа тучных клеток в строме. Структурные изменения вентральной доли менее выражены и их отличает от дорсальной снижение объемной доли эпителия и более выраженная десквамация эпителия ацинусов.

Гиперандрогенемия оказывает иммуносупрессорное действие, снижает продукцию и секрецию провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов, вызывает развитие акцидентальной инволюции тимуса I-II стадии, опустошение В-зоны селезенки.

При гиперандрогенемии по сравнению с хроническим аутоиммунным простатитом на фоне физиологического уровня андрогенов более выражены увеличение объемной доли ацинусов, десквамация эпителия, фиброз. Гиперандрогенемия оказывает иммуносупрессорный эффект: в воспалительном инфильтрате снижается содержание лимфоцитов.

При хроническом аутоиммунном простатите на фоне гиперандрогенемии по сравнению с хроническим аутоиммунным простатитом на фоне физиологического уровня андрогенов выявлено опустошение Т- и В-зон селезёнки, снижение объемной доли светлых центров лимфоидных узелков.

Практическая значимость. Экспериментальная модель хронического аутоиммунного простатита с количественной оценкой структурных изменений может быть использована для доклинического исследования эффективности фармакологических препаратов, применяемых для лечения хронического простатита.

Полученные данные об иммуносупрессорном и профибротическом эффекте гиперандрогенемии при хроническом аутоиммунном простатите следует учитывать при использовании андрогенсодержащих препаратов для коррекции андрогенной недостаточности, метаболического синдрома, в спортивной медицине и с целью контрацепции.

Внедрение в практику. Результаты исследования используются в лекционном курсе по гистологии, цитологии, клеточной биологии в ФГОУ Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

5

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации были представлены и обсуждены на конференциях и конгрессах: «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», (Москва, 2008); «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», (Москва, 2010); Всероссийском форуме с международным участием имени академика Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011»; «Х Конгрессе международной ассоциации морфологов» (Ярославль, 2011); «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», (Москва, 2012); межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (май, 2012).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 научных работ, из них 2 статьи в журналах, включенных в «Перечень периодических изданий», рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и 6 глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц и проиллюстрирована 51 рисунком. Библиографический указатель включает 173 источника (40 отечественных и 133 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы. Лабораторные животные. В работе использованы 42 особи половозрелых крыс–самцов Вистар (питомник «Столбовая»). Масса тела экспериментальных животных составляла 240–280 гг. Все эксперименты выполнены в осенне–зимний период. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол №5 от 12.03.2008).

Исследование проводилось на 4–х рандомизированых группах крыс– самцов Вистар: контрольной (n=14); с хроническим аутоиммунным простатитом (n=14); с гиперандрогенемией (n=7); с хроническим аутоиммунным простатитом на фоне гиперандрогенемии (n=7).

Использовали экспериментальную модель хронического аутоиммунного простатита с введением гомогената добавочных половых желез крыс и адъюванта Фрейнда, разработанную B. Pacheco-Rupil et al. (1981), B. Pacheco-Rupil (1984) и модифицированную M. Orsilles et al. (1995). У половозрелых беспородных крыс извлекали добавочные половые железы (предстательная, пузырьковидная, коагуляционные), которые затем с помощью ультразвукового гомогенизатора измельчали до однородной массы. Гомогенат центрифугировали 30 мин. при 14000 об/мин. Концентрацию белка в супернатанте определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Thermo Fisher Scientific “Konelab prime 60i”, и она составила 15

6

мг/мл. Полученный супернатант добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда в равных объемах (по 0,75 мл) вводили крысам подкожно в область холки троекратно с интервалом в 7 сут.

Гиперандрогенемию моделировали путем внутримышечного введения фармакологического препарата тестостерона Омнадрен 250 (Jelfa, Польша). Для моделирования гиперандрогенемии подбирали экспериментальным путем оптимальную дозу омнадрена, которая составила 165 мг/кг. При внутримышечном введении крысам этой дозы омнадрена уровень тестостерона превышал физиологические пределы в 4-5 раз и стабильно сохранялся в течение 7 сут.

Для создания устойчивого фона гиперандрогенемии первое введение масляного раствора омнадрена крысам группы с гиперандрогенемией сделано за 7 дней до первой инъекции гомогената добавочных половых желез. В дальнейшем, введение омнадрена животным этой группы совпадало по времени с введением гомогената добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира на 31-е сутки после первого введения гомогената добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда или омнадрена.

Методы исследованияГистологические и гистохимические. Проводили забор

предстательной железы, тимуса и селезенки. Материал фиксировали в растворе Буэна в течение 24 ч., обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе, заливали в парафин. Изготовляли гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином, по ван Гизону. Для выявления нейтральных гликопротеинов проводили PAS–реакцию, для определения кислых гликопротеинов применяли окраску альциановым синим. С целью выявления тучных клеток соединительной ткани гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (рН 2.0).

Морфометрические. Морфометрическое исследование проводили на микроскопе Leica DM 2500 с цифровой фотокамерой. Изображение передавалось на экран монитора, на котором при помощи графического планшета и программы “Image Scope” измеряли стереологические параметры гистоструктуры методом точечного счета с применением 100– узловой тест-сетки (Автандилов Г.Г., 1973).

В гистологических срезах дорсальной и вентральной долей предстательной железы методом точечного счета определяли: объемную долю ацинусов, ацинусов содержащих и не содержащих секрет, стромы, воспалительного инфильтрата. Подсчитывали количество тучных клеток на площади среза 0,1мм2. Индекс дегрануляции тучных клеток оценивали по методу Д.П.

Линдер (1980).

Во внутридольковой строме предстательной железы в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали содержание

7

нейтрофилов и лимфоцитов (на 500 клеток). В препаратах тимуса и селезенки, окрашенных гематоксилином и эозином, методом точечного счета определяли объемные доли структурно-функциональных зон: для тимуса – коркового и мозгового слоев; для селезенки – белой пульпы, ПАЛМ–зоны, лимфоидных узелков, их светлых центров. Ширину субкапсулярной зоны тимуса измеряли с помощью программы Image Pro.

Иммунофлюоресцентный. Иммуноморфологическое исследование предстательной железы проводили с целью выявления в сыворотке крови крыс с хроническим аутоиммунным простатитом аутоантител к антигенам предстательной железы. На криостатные срезы предстательной железы и печени интактных крыс наносили сыворотку крови крыс с хроническим аутоиммунным простатитом в титре 1:400. В качестве контроля использовали срезы, которые инкубировали с фосфатным буфером или сывороткой крови интактных крыс контрольной группы в титре 1:400. В качестве «вторых» антител использовали меченные ФИТЦ–антитела козы против IgG крысы в титре 1:100 (ИМТЕК, Россия). Препараты просматривали в люминесцентном микроскопе Carl Zeiss Axioplan 2.

Культуральные. Для изучения цитокинового профиля из селезенки животных выделяли спленоциты с помощью стеклянного гомогенизатора

Поттера. Выделенные клетки центрифугировали в среде 199 10 мин при 1000 об/мин. Суспензию клеток селезенки в количестве 1х106/мл культивировали 24 ч в 1 мл полной ростовой среды с добавлением конканавалина А (в конечной концентрации 5 мкг/мл) в 24–луночных культуральных панелях при 37°С в атмосфере 5% СО2 для индукции синтеза и секреции цитокинов. По окончании инкубации отбирали надосадочную жидкость, которую хранили не более месяца при – 40°С. Среда для культивирования лимфоцитов состояла из RPMI 1640 (ПанЭко) с 5% инактивированной телячьей эмбриональной сывороткой, 2 мМ глутамина и 50 мкг/мл гентамицина.

Иммуноферментный. В сыворотке крови методом ИФА проводили определение уровня общего и свободного тестостерона (“Аdaltis”, Италия), кортикостерона (“IBL international”, Германия). В культуральной жидкости клеток селезенки методом ИФА (тест-системы фирмы “BioSource International”, США, “BenderMedsystems”, Австрия) определяли концентрацию интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, интерферона-γ (ИНФ-γ), фактора некроза опухолей α (ФНО-α).

Статистический. Полученные цифровые данные оценивали на нормальность распределения при помощи метода Колмогорова и Смирнова в пакете Statistica 7.0. Цифровые данные, подчиняющиеся нормальному распределению, обрабатывали параметрическими методами, сравнение групп проводили по t–критерию Стьюдента, в противном случае использовали непараметрический метод Манна-Уитни. Статистически значимыми считали значения при р< 0,05.

8

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурно–функциональная и иммунологическая

характеристика экспериментального хронического аутоиммунного воспалительного процесса в предстательной железе

Вработе использовали экспериментальную модель хронического аутоиммунного простатита, индуцированного введением гомогената добавочных половых желез и адъюванта Фрейнда (Pacheco-Rupil B., 1981; Orsilles М.А., 1995). Несмотря на длительное использование этой модели, детальная характеристика структурных изменений предстательной железы и изучение морфофункциональных изменений органов иммунной системы при хроническом аутоиммунном простатите не проводилась, что в значительной мере ограничивает применение указанной модели для изучения патогенеза заболевания и доклинической оценки эффективности лечебных средств.

По E.Witebsky (1961) одним из критериев аутоиммунного процесса является обнаружение в сыворотке крови аутоантител. С целью доказательства аутоиммунного характера воспалительного процесса, вызванного введением гомогената добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда, проводили иммуноморфологическое исследование. Для выявления аутоантител к антигенам предстательной железы сыворотку крови крыс Вистар с хроническим аутоиммунным простатитом наносили на криостатные срезы предстательной железы печени интактной крысы. При нанесении сыворотки крови всех животных с хроническим аутоиммунным простатитом выявили линейное и гранулярное свечение в базальной пластинке ацинусов предстательной железы. В криостатных срезах печени интактных крыс свечение отсутствовало, что свидетельствует о специфичности антител к антигенам предстательной железы. Выявление аутоантител в сыворотке крови крыс Вистар с хроническим аутоиммунным простатитом в настоящем исследовании является прямым доказательством участия в воспалительном процессе в предстательной железе аутоиммунных реакций (Rose N.R., Bona C., 1993).

По сравнению с контрольной группой крыс Вистар при хроническом аутоиммунном простатите показатели уровня половых стероидов – общего и свободного тестостерона, а также кортикостерона, статистически значимо не различались.

Структурно–функциональная характеристика предстательной железы крыс Вистар при экспериментальном хроническом аутоиммунном простатите

Для оценки структурно-функциональных изменений предстательной железы при хроническом аутоиммунном простатите проводили ее морфологическое и морфометрическое исследование у крыс контрольной группы и крыс опытной группы, которым вводили гомогенат добавочных половых желез и адъювант Фрейнда.

Вконтрольной группе ацинусы предстательной железы были округлой

иовальной формы, просветы их были частично заполнены эозинофильным,

9

слабо PAS-положительным гомогенным секретом. Эпителий ацинусов был призматический с небольшим количеством эпителиально–стромальных выростов. В просветах части ацинусов выявлены клетки десквамированного эпителия. Строма была представлена тонкими прослойками пикринофильной рыхлой волокнистой соединительной ткани, в которой располагались диффузно рассеянные тучные клетки, лимфоциты и единичные гистиоциты. Цитоплазма большинства тучных клеток была заполнена плотно упакованными гранулами, метахроматически окрашивающимися толуидиновым синим. Выводные протоки были выстланы кубическим эпителием, вокруг них определялся тонкий слой пикринофильной или слабо фуксинофильной соединительной ткани.

Качественная характеристика структуры предстательной железы крыс в норме представлена в работе C. J. Jesik et al. (1982). Детального изучения структуры предстательной железы крыс в норме с использованием морфометрических методов не проводилось. По данным выполненного нами морфометрического исследования структура дорсальной и вентральной долей предстательной железы крыс Вистар в норме различается. В дорсальной доле выше объемная доля ацинусов и их эпителия, и ниже – показатель индекса дегрануляции тучных клеток и объемной доли внутридольковой стромы.

Выявленные структурные особенности дорсальной и вентральной долей предстательной железы крыс Вистар в норме отражают их функциональные различия. Основным секреторным белком дорсальной доли предстательной железы является дорсальный протеин-I, большой белковый комплекс, в составе которого содержатся гликопротеины. Секреция этого белка является андрогензависимой (Wilson E.M., French F.S., 1980). Эпителий ацинусов вентральной доли предстательной железы секретирует лимонную кислоту и белки, относящиеся к семейству простатеина - спермин и спермидин (Lea O.A., Petrusz P., French F.S., 1979; Maccioni M., Rivero V.E., Riera C.M., 1998). Простатеин является одним из антигенов, введение которого вызывает развитие хронического аутоиммунного простатита

(Maccioni M., Rivero V.E., Riera C.M., 1998).

При хроническом аутоиммунном простатите, вызванном введением гомогената добавочных половых желез с адъювантом Фрейнда, в предстательной железе крыс выявлена морфологическая картина, характерная для хронического простатита: сочетание дистрофических, десквамативных и пролиферативных изменений эпителия ацинусов, расширение их просвета, очаговый фиброз внутридольковой стромы, диффузно-очаговая воспалительная инфильтрация из лимфоцитов, гистиоцитов, тучных клеток. Выявленные патоморфологические изменения предстательной железы при хроническом аутоиммунном простатите у крыс Вистар согласуются с данными M.A. Orsilles (1998) и C. N. Rudick (2007).

В гистологических срезах предстательной железы крыс с хроническим аутоиммунным простатитом просветы ацинусов были расширены, частично

10