2 курс / Биохимия / Обмен белков и липидов

(4)активация жирных кислот и перенос их из цитоплазмы в митохондрию

(5)дегидрирование с образованием еноил-КоА

20.ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ КОМПЛЕКСА «СИНТАЗА ЖИРНЫХ КИСЛОТ»

(1)3-кетоацилредуктаза

(2)трансацилаза

(3)еноилредуктаза

(4)дегидратаза

(5)3-кетоацилсинтаза

ДОПОЛНИТЕ

21.Скорость β-окисления жирных кислот регулируется потребностью клетки в энергии, то есть соотношением _______/______ и

______/_______.

22.Транспорт жирных кислот из цитоплазмы в митохондрию осущест-

вляется в виде _____________ с помощью ________.

23.Энергетический выход β-окисления одной молекулы пальмитиновой кислоты (С16) составляет ______ _________ молекул АТФ.

24.Регуляторным ферментом липолитического расщепления жиров является ___________.

25.Образование малонил-КоА из ацетил-КоА в ходе синтеза жирных кислот осуществляется с затратой ______ биотинзависимым фер-

ментом ____________________.

26.Скорость β-окисления жирных кислот снижается за счет ингибирования малонил-коферментом А цитозольного фермента __________.

27.Начальные этапы синтеза триацилглицеролов и глицерофосфолипидов осуществляются одинаково до образования _________________

________.

28.Образование активной формы глицерола в печени и кишечнике может осуществляться с затратой АТФ ферментом ______________.

29.Образование активной формы глицерола в мышцах и жировой ткани осуществляется при восстановлении ________________ ферментом

______________________.

30.Регуляторный фермент синтеза кетоновых тел ______________ ингибируется высокими концентрациями свободного ______________.

21

22

Тема 3. ХОЛЕСТЕРИН. СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ. ЛИПОПРОТЕИНЫ КРОВИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность занятия – 180 мин.

Цель занятия: изучить процесс синтеза холестерина в организме, биологическое значение и условия протекания этих реакций; рассмотреть биологическую роль производных холестерина; изучить строение, метаболизм и клинико-диагностическое значение липопротеинов крови; ознакомиться с методами определения холестерина в сыворотке крови, проводимыми в клинических и эпидемиологических исследованиях по проблеме сердечно-сосудистых заболеваний, таких, как коронарный атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь; научиться одному из данных методов определения холестерина в сыворотке крови.

Изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-3, ОК-5) и профессиональных (ПК-2, ПК-3, ПК-5, ПК-8, ПК-9, ПК-15, ПК-16, ПК-17, ПК-31) компетенций.

Конкретные задачи.

Студент должен знать:

–синтез и биологическую роль холестерина в организме.

–локализацию и ключевые реакции синтеза стероидных гормонов, желчных кислот, витамина D3, эфиров холестерина.

–строение и метаболизм основных классов липопротеинов крови. Студент должен уметь:

–количественно определять холестерин в сыворотке крови.

–классифицировать по строению и физико-химическим свойствам липопротеины крови.

–проводить клинико-диагностическую оценку нарушений обмена холестерина и липопротеинов.

Студент должен владеть навыками выполнения биохимического метода, способностью использовать теоретические знания в диагностике и лечении, а также профилактике заболеваний сердечно-сосудис- той системы.

Мотивация. Знания и навыки, приобретенные на занятии, необходимы для понимания развития патологических состояний, связанных с

23

процессами нарушения липидного обмена, понимания вопросов диагностики и терапии атеросклероза.

3адание для самоподготовки: изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

Рекомендуемая литература

Основная

Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :

Медицина, 1998. – С. 398–408.

Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :

ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 439–457, 389, 572–574, 606–608.

Дополнительная

Климов, А.Н. Обмен липидов и липопротеинов и его нарушения : руководство для врачей / А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева. – СПб. : Питер, 1999. – 505 с.

Марри, Р. Биохимия человека ; т. 1 / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес,

В. Родуэлл. – М. : Мир, 1993. – С. 256–286.

Вопросы для самоподготовки

1.Пути использования ацетил-КоА в клетке.

2.Синтез холестерина до мевалоновой кислоты.

3.Последующие этапы синтеза холестерина.

4.Строение и биологическая роль холестерина.

5.Производные холестерина.

6.Регуляция синтеза холестерина.

7.Эфиры холестерина. Обмен эфиров холестерина.

8.Липопротеины. Классификация. Состав, строение.

9.Классификация и свойства апобелков.

10.Факторы риска при атеросклерозе.

11.Индекс атерогенности.

12.Клинико-диагностическое значение определения холестерина в

крови.

Пример входного контроля – см. Тестовые задания по теме.

Методы количественного определения холестерина в сыворотке крови. Клинико-диагностическое значение

Холестерин (ХС) является важным липидным компонентом всех тканей и клеток организма. 80 % ХС в организме составляет свободный ХС, почти весь он является компонентом биологических мембран. В то

24

же время в сыворотке (плазме) крови ⅔ ХС представлено в форме эфиров холестерина. Больше всего его в надпочечниках, крови, нервной системе, коже, пищеварительном аппарате. Основным местом биосинтеза ХС является печень. В организме человека с массой тела 70 кг содержится в среднем 140 г ХС, то есть около 0,2 % массы тела. Известно, что человек с пищей получает в среднем 0,4–0,5 г ХС в день, синтезирует же ежедневно в организме в количестве 1,5–4,2 г, в среднем 2 г. Таким образом, большая часть ХС организма образуется эндогенно.

В настоящее время применяют референсные границы содержания ХС, установленные ВОЗ. Согласно этим данным верхний уровень нормального содержания ХС у человека в возрасте 20–29 лет составляет 5,17 ммоль/л, 30–39 лет – 5,69 ммоль/л и более 40 лет – 6,21 ммоль/л. На уровень ХС оказывают влияние характер пищи и прием алкоголя, интенсивные физические тренировки, фармакологические препараты, включая гормональные контрацептивы, стероиды, гиполипидемические препараты. Сезонные и дневные вариации не оказывают влияния на уровень ХС в сыворотке крови.

Содержание ХС в крови является важным диагностическим тестом. Уменьшение концентрации ХС (гипохолестеринемия) обнаружено при гипертиреозе, анемиях, туберкулезе, лихорадочных состояниях, голодании, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, онкологических заболеваниях. Количество ХС в крови может увеличиваться при нарушении переноса и поглощения клетками липидов. Длительная гиперхолестеринемия является тестом развития атеросклероза вследствие отложения в стенке артерий преимущественно ЭХС с последующим образованием атеросклеротических бляшек. Резко повышается содержание ХС в органах при жировой инфильтрации. Увеличение концентрации ХС отмечается также при механической желтухе, гломерулонефрите и нефротическом синдроме, сопровождаемых отеками, сифилисе, гипотиреозе, В-авитаминозе и др. Очень высокий уровень ХС в крови наблюдается при сахарном диабете и липоидном гидронефрите – 26,86 ммоль/л и выше.

Определение содержания ХС не дает диагностической информации о конкретном заболевании, а характеризует общую патологию обмена липидов. Определение ХС имеет социальное значение, так как повышенный уровень ХС в популяции требует организационных мероприятий по первичной профилактике коронарного атеросклероза.

Гиперхолестеринемия является независимым фактором риска ИБС. Связь между уровнем общего ХС плазмы крови и смертностью от ИБС

25

является весьма жесткой и описывается экспоненциальной кривой. Холестерин ЛПВП как «предсказатель» ИБС оказался в 8 раз чувствительнее, чем холестерин ЛПНП. Предложено в качестве «предсказателя» рассчитывать так называемый холестериновый коэффициент атерогенности (К), представляющий собой отношение холестерина ЛПНП и ЛПОНП к холестерину ЛПВП:

холестерин ЛПНП + холестерин ЛПОНП / холестерин ЛПВП.

В клинике очень удобно рассчитывать этот коэффициент на основании определения общего холестерина и холестерина ЛПВП:

общий холестерин – холестерин ЛПВП / холестерин ЛПВП.

Чем больше этот коэффициент (у здоровых лиц он не превышает 3), тем выше опасность развития (и наличия) ИБС.

Методы определения ХС можно классифицировать следующим образом: а) химические; б) ферментные; в) электрохимические; г) хроматографические.

К химическим относятся методы определения продуктов взаимодействия ХС с кислотами Льюиса после его дегидроксилирования. В качестве реагентов наиболее часто применяются либо реактив Либер- мана–Бурхарда (смесь концентрированной H2SO4, СН3СООН и уксусного ангидрида), либо реактив Златкиса–Зака (H2SO4 и соли Fe3+). Известно большое число модификаций этих методов, отличающихся способами пробоподготовки, соотношением реактивов и условиями проведения реакций. В зависимости от способа подготовки пробы химические методы можно разделить на 2 группы: 1) прямые методы, не предусматривающие предварительную подготовку пробы; 2) экстракционные методы, включающие экстракцию ХС органическими растворителями.

Основным достоинством прямых методов являются простота, доступность и низкая стоимость анализа. Важнейшим недостатком является неспецифичность. Это связано с тем, что в жестких условиях, учитывая значительное эндогенное образование тепла, в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови, образуя окрашенные продукты (чаще всего в результате дегидратации). На определение ХС сильно влияют билирубин, гемоглобин, каротин, некоторые стеролы, лекарственные препараты, присутствующие в крови. Причиной ошибки может являться также денатурация белка сыворотки в присутствии кислоты. Из-за влияния этих факторов результаты определения ХС прямыми методами оказываются завышенными в среднем на 2–12 %.

26

Включение этапа экстракции повышает специфичность метода; результаты определения ХС в среднем на 7 % ниже, чем при прямом методе. Спектр используемых экстрагентов довольно широк. В настоящее время наиболее часто применяются гексан, изопропанол, петролейный эфир, смесь метанол – хлороформ. Применяемые растворители достаточно эффективно отделяют ХС от основных интерферирующих веществ: билирубина, гемоглобина и других белков, многих лекарств, однако холестериноподобные стерины экстрагируются вместе с ХС.

В химических методах обычно используют фотометрическую регистрацию (λmax = 560 нм), однако для повышения чувствительности применяют и флуориметрический способ. При этом снижается влияние ряда мешающих компонентов.

Ферментные методы. В настоящее время 95 % лабораторий мира используют ферментный способ определения ХС. Ферментное определение протекает в несколько стадий.

I стадия – ферментный гидролиз эфиров ХС (чаще всего используют холестеринэстеразу):

холестеринэстераза ЭфирыХС Н2О ХС ЖК (1).

II стадия – окисление ХС растворенным в реакционной смеси кислородом воздуха в присутствии оксидазы ХС:

холестериноксидаза ХС О2 Холест-4-ен-3-он Н2О2(2) .

III стадия – определение продуктов реакции (Н2О2 или холест-4-ен- 3-она) или убыли кислорода в процессе ее протекания. Чаще всего содержание ХС находят, определяя Н2О2, образующийся в ходе реакции

(2).

Электрохимическое определение холестерина. Электрохимиче-

ские варианты ферментного метода определения ХС основаны на регистрации уменьшения парциального давления О2 или на увеличении концентрации Н2О2 в ходе реакции (2).

Хроматографические методы. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и газожидкостной хроматографии обладают высокой разрешающей способностью при разделении близких по свойствам стеринов, позволяют проводить определение в малых количествах биологического материала (капиллярная кровь).

27

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Количественное определение холестерина в сыворотке крови ферментативным методом

Принцип метода:

холестеринэстераза 1.ЭфирыХС Н2О холестерин жирныекислоты.

холестериноксидаза 2. Холестерин О2 Н2О холестенон Н2О2.

пероксидаза 3. 2Н2О2 4-аминоантипирин фенол окрашенноесоединение 4Н2О.

Реактивы: 1) рабочий реагент включает фосфатный буфер, натрий холевокислый, фенол, 4-аминоантипирин, холестериноксидазу, холестеринэстеразу, пероксидазу; 2) калибровочный раствор холестерина с концентрацией 4,65 ммоль/л.

Ход работы (табл. 2).

Пробы перемешать, инкубировать 10 мин при температуре 37° С. Определить оптическую плотность опытных и калибровочной проб против рабочего реагента при λ=500 (490–520) нм. Окраска стабильна в течение 60 мин.

Результаты: D1 =

D2 =

Dк =

Содержание холестерина (ммоль/л) рассчитывают по формуле:

С = D1/Dк ∙ 4,65,

С1 = С2 =

Норма ХС в сыворотке крови – менее 5,2 ммоль/л.

Выводы: ________________________________________________.

28

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

ВЫБЕРИТЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ

1.ЛИМИТИРУЮЩЕЙ СТАДИЕЙ БИОСИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА ЯВЛЯЕТСЯ РЕАКЦИЯ, В ХОДЕ КОТОРОЙ ОБРАЗУЕТСЯ

а) ацетоуксусная кислота (ацетоацетат) б) β-оксимасляная кислота (β-оксибутират) в) β-оксибутирил-КоА г) β-окси-β-метил-глутарил-КоА

д) мевалоновая кислота (мевалонат)

2. ФУНКЦИЕЙ АПО А1 ЯВЛЯЕТСЯ

а) активация липопротеинлипазы б) активация лецитинхолестеролацилтрансферазы (ЛХАТ) в) транспорт эфиров холестерола г) транспорт триацилглицеролов

д) активация ацил-КоА-холестеролацилтрансферазы (АХАТ)

3.ТРАНСПОРТ ЭКЗОГЕННОГО ХОЛЕСТЕРИНА И ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ ИЗ КИШЕЧНИКА В ТКАНИ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ

а) хиломикроны б) ЛПОНП и ЛПНП в) ЛПВП

г) хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП д) ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП

4. ФУНКЦИЕЙ АПО С2 ЯВЛЯЕТСЯ

а) активация липопротеинлипазы б) активация лецитинхолестеролацилтрансферазы (ЛХАТ) в) транспорт эфиров холестерола г) транспорт триацилглицеролов

д) активация ацил-КоА-холестеролацилтрансферазы (АХАТ)

5.ТРАНСПОРТ ЭНДОГЕННОГО ХОЛЕСТЕРИНА И ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ ИЗ ПЕЧЕНИ В ТКАНИ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ

а) хиломикроны б) ЛПОНП и ЛПНП в) ЛПВП

г) хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП д) ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП

6.ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРИНА ИЗ ВНЕПЕЧЕНОЧНЫХ ТКАНЕЙ В ПЕЧЕНЬ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ

а) хиломикроны

29

б) ЛПОНП и ЛПНП в) ЛПВП

г) хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП д) ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП

7. ОБРАЗОВАНИЕ ЛПНП ПРОИСХОДИТ

а) в печени б) в печени и кишечнике в) в кишечнике

г) в крови из ЛПОНП д) в крови из хиломикронов и ЛПОНП

8.НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНЫМ ДЛЯ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ РИСКА РАЗВИТИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА ЯВЛЯЕТСЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ В КРОВИ

а) общего уровня холестерина б) холестерина в ЛПНП в) холестерина в ЛПВП

г) холестерина в ЛПОНП и ЛПНП д) соотношение холестерина ЛПОНП, ЛПНП к холестерину ЛПВП

9. АТЕРОГЕННЫМИ ЛИПОПРОТЕИНАМИ ЯВЛЯЮТСЯ

а) ЛПВП б) ЛПНП, ЛПОНП

в) ЛПНП, ЛПВП г) ЛПОНП, ЛПВП д) хиломикроны

10.ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ СИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКЕ ИМЕЮТ ОБЩИЕ РЕАКЦИИ С

а) синтезом жирных кислот б) распадом жирных кислот в) синтезом фосфолипидов г) синтезом кетоновых тел

д) синтезом триацилглицеридов

11. МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ГМГ КоА-РЕДУКТАЗЫ ХОЛЕСТЕРИНОМ

а) аллостерическая активация б) ковалентная модификация в) индукция синтеза г) репрессия синтеза

д) активация протектором

12.КОФЕРМЕНТОМ ГМГ КоА-РЕДУКТАЗЫ (СИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИНА) ЯВЛЯЕТСЯ

а) ФАД2Н

30