2 курс / Биохимия / synevo-sayt

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

2. Для диагностики бактериального вагиноза (Lactobacillus spp./Gardnerella vaginalis количественное определение).

Соскобы производятся из двух точек – цервикальный канал и задне#

нижний свод влагалища.

При необходимости материал для исследования берут из уретры и эро5 зивно5язвенных поражений.

Забор материала производят одноразовыми стерильными зондами

(гинекологическими щетками – Цитобраш, ложки Фолькмана гинеколо# гические) в пробирку объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» (конической формы) с транспортной средой с муколитиком (ТСМ) (0,5 мл) розового цвета. Допускается взятие материала в пробирку объемом 1,5 мл типа «Эп5 пендорф» с транспортной средой для мазков (0,3 мл) (прозрачная).

Цервикальный канал. Удаляют слизь с поверхности шейки матки при по5 мощи цитобраша и этот цитобраш утилизируют. Вводят зонд (цитобраш) в цервикальный канал на 151,5 см и вращают его в течение 355 секунд. Извле5 кают зонд (цитобраш), избегая касания стенок влагалища, и помещают его

встерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Погрузив ра5 бочую часть зонда (цитобраш) в транспортную среду, вращают его в тече5 ние 10515 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд (цито5 браш) из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жид5 кости (не руками!), удаляют зонд (цитобраш) и плотно закрывают пробирку.

Задне+нижний свод влагалища. Проводят зондом (цитобраш, ложка Фолькмана гинекологическая) по поверхности слизистой в области задне5 нижнего свода влагалища и эктоцервикса и переносят зонд (цитобраш, лож5 ка Фолькмана гинекологическая) в пробирку с транспортной средой. Погру5 зив рабочую часть зонда (цитобраш, ложка Фолькмана гинекологическая) в транспортную среду, вращают в течение 10515 секунд, избегая разбрызги5 вания раствора. Вынимают зонд (цитобраш) из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости (не руками!), удаляют зонд (ци5 тобраш, ложка Фолькмана гинекологическая) и закрывают пробирку.

Уретра. Перед взятием соскоба из уретры необходимо обработать наружное отверстие уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раство5 ром, чтобы удалить отделяемое из влагалища. Вводят ЗОНД (и только ЗОНД)

вуретру на глубину 151,5 см и аккуратно, не поранив слизистую, несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и пере5 носят зонд в пробирку с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10515 секунд, избегая разбрызги5 вания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости (не руками!), удаляют зонд и закрывают пробирку.

Забор материала для диагностики папилломавирусной инфекции

Взятие материала из цервикального канала производится специальным одноразовым стерильным зондом в виде щеточки. Удалив слизь с поверх5 ности шейки матки тампоном, следует ввести зонд в цервикальный канал на глубину 1,051,5 см и сделать соскоб касательным движением, захватывая и эндо5, и эктоцервикс, вращая зонд. Необходимо повернуть зонд не менее трех раз. Затем поместить его в пробирку с транспортной средой, отломив или отрезав его рабочую часть.

Забор материала для диагностики бактериального вагиноза

(Lactobacillus spp./Gardnerella vaginalis количественное определение)

Для проведения анализа используется только клинический материал от

женщин: отделяемое задненижнего свода влагалища.

Клинический материал необходимо забирать стандартным способом, ис5 пользуя универсальный зонд или специальный аппликатор фирмы «Copan» (Италия), чтобы объем забранного материала (0,05±0,01 мл), помещенного

в пробирку цилиндрической формы с завинчивающейся крышкой, объемом 2 мл с транспортной средой с муколитиком (ТСМ) (0,5 мл) составлял 1/10 ее объема.

Максимально полно забрать отделяемое задненижнего свода влагалища с помощью зонда. Рабочую часть зонда тщательно прополоскать в транс5 портной среде, отжимая его о стенки пробирки, обломить в области насеч5 ки и оставить в пробирке с транспортной средой.

В случае адекватного забора материала, когда объем забранного отделя5 емого достаточный, транспортная среда должна резко помутнеть, а ее цвет должен измениться с розового на лимонно5желтый (при кислом pH отделяе5 мого). Если цвет среды не изменился, рекомендуется забрать дополнитель5 ную порцию отделяемого новым зондом. Цвет может не измениться или из5 мениться незначительно, если pH отделяемого больше 4.5.

Клинический материал, помещенный в транспортную среду с муколитиком (ТСМ), в плотно закрытой пробирке можно транспортировать и хранить.

Условия хранения материала При комнатной температуре (от +18 до +25 °С) – в течение 48 часов, при

температуре от + 2 до +8 °С – в течение 2 недель.

КРОВЬ

Взятие материaла. Взятие крови производится натощак из локтевой вены в специальную вакуумную систему типа «Venoject» с ЭДТА (сиреневые крышки – 6% ЭДТА). При взятии в шприц кровь из шприца аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пластиковую пробирку с ан5 тикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20).

Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!

Пробирка закрывается крышкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Хранение взятого материала

При комнатной температуре – до 6 часов, при температуре 258 °C – не бо5 лее 24 часа.

Не замораживать!

МАЗОК (СОСКОБ) ИЗ РОТОГЛОТКИ

Взятие материала. Взятие материала производится сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой основе. Вращательными движениями по часовой стрелке от левой миндалины по задней стенке глотки к правой мин5 далине, не прикасаясь к языку и небу, собирают эпителиальные клетки.

После забора материала тампон обломив, помещают в стерильную одно5 разовую пробирку типа «Эппендорф» с транспортной средой.

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

Хранение взятого материала

При комнатной температуре – до 6 часов, при температуре 258 °C – 24 часа, при температуре – 20 °С – 1 неделя.

Допускается только однократное замораживание – оттаивание материала.

МАЗОК (СОСКОБ) С КОНЪЮНКТИВЫ ГЛАЗ

Взятие материала. Взятие мазка осуществляется под местной анестезией (2 капли раствора декаина или инокаина). Оттянув нижнее веко, провести 455 раз по конъюнктиве, захватывая внешний и внутренний углы глаза, вра5 щая зонд.

Затем поместить зонд в пробирку типа «Эппендорф» с транспортной сре5 дой, отломив или отрезав рабочую часть зонда.

Хранение и транспортировка

При комнатной температуре – до 6 часов, при температуре 258 °C – 24 часа, при температуре 5 20 °С – 1 неделя.

Допускается только однократное замораживание – оттаивание материала.

НАТИВНЫЙ МАТЕРИАЛ

Ликвор

Взятие материла. Спинномозговую жидкость забирают в количестве не менее 0,5 мл (желательно 1,0 мл и более) одноразовым шприцем. Матери5 ал со шприца аккуратно (без образования пены) перенести в стерильные одноразовые пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл.

Слюна

Взятие материала. Перед взятием слюны исключается прием пищи в течение 45х часов и производится трехкратное полоскание полости рта физиологичес5 ким раствором (в домашних условиях – теплой кипяченой водой).

Взятие слюны производится в одноразовые стерильные пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл в количестве не менее 1,0 мл.

Слезная жидкость

Взятие материала. Материал забирают одноразовыми пластиковыми пи5 петками в количестве не менее 0,5 мл (желательно – 1,0 мл и более). Для усиления слезоотделения проводится провокация слезоточивым веществом (обычно используется нашатырный спирт).

Отобранная слезная жидкость переносится в одноразовые стерильные пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл.

Моча

Взятие материала. Для анализа отбирается первая порция утренней мочи в количестве не меньше 10 мл в специальный стерильный одноразовый флакон или стерильную пробирку.

Сперма

Взятие материала. Взятие спермы осуществляется в стерильные однора5 зовые флаконы или пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл.

Секрет предстательной железы

Взятие материала. После окончания массажа предстательной железы ее секрет в количестве 0,551 мл собирают в одноразовую стерильную пробир5 ку типа «Эппендорф» на 1,5 мл.

При невозможности получить секрет, сразу после массажа собирают пер5

вую порцию мочи (в которой содержится секрет предстательной железы) в количестве 10 мл (правила взятия мочи смотреть выше).

Молоко

Взятие материала. Взятие молока осуществляется в стерильные одноразовые флаконы или пробирки без консервирующего раствора и транспортной среды.

Синовиальная жидкость

Взятие материла. Забор исследуемого материала производится однора5 зовыми пластиковыми пипетками шприцем в количестве не менее 0,5 мл (желательно 1,0 мл и более). Материал со шприца следует аккуратно (без образования пены) перенести в одноразовую вакуумную систему типа «Venoject» с ЭДТА (сиреневые крышки – 6% ЭДТА) или в одноразовую пла5 стиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробир5 ка закрывается крышкой и переворачивается несколько раз (для перемеши5 вания с антикоагулянтом).

Хранение взятого нативного материала

При комнатной температуре – до 6 часов, при температуре 258 °C – 24 часа, при температуре 5 20 °С – 1 неделю.

Допускается только однократное замораживание – оттаивание материала.

Транспортировка клинического материала

Транспортировка клинического материала осуществляется в специаль5 ном контейнере с охлаждающими элементами в соответствии с общеприня5 тыми правилами.

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ РАБОТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЛАБОРАТОРИИ «СИНЭВО»

1. Проточная цитофлуорометрия.

Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула определяются после ли5 зиса эритроцитов с помощью проточной цитофлуорометрии, которая позволя5 ет анализировать физические и химические свойства клеток, при которой проба крови всасывается и разводится. Проба крови всасывается, разбавля5 ется и окрашивается. Клетки крови затем выстраиваются в линию по одному, проходя через центр проточной камеры, в то время как лазерный луч, излуча5 емый полупроводником, попадает на них и в результате рассеивается в раз5 личных направлениях. Свет, рассеянный фронтально, улавливается фотоди5 одом и позволяет определить объем клетки. Свет, рассеянный латерально, дает информацию о компонентах клетки (ядре и гранулированных элемен5 тах), а латеральный флуоресцирующий свет информирует о величине клеточ5 ной ДНК и РНК. Свет, рассеянный латерально и флуоресцирующий латераль5 но, принимается трубкой фотомультипликатора. В конечном результате ана5 лизатор отображает два двумерных изображения:

5 на «4DIFF» (X5ось отражает интенсивность латерального света, а Y5ось – интенсивность флуоресцирующего латерального света) появляются 5 лей5 коцитарных форм и группа теней эритроцитов;

5 на «WBC/BASO» (X5ось отражает интенсивность латерального света, а Y5ось – интенсивность фронтального света) появляются формы базофилов

иостальные формы лейкоцитов, и также эритроцитарные тени.

Показатели анализируемых проб:

а) эритроцитарные:

•количество эритроцитов,

•гемоглобин,

•гематокрит,

•эритроцитарные индексы:

5 средний объем эритроцитов,

5 среднее содержание гемоглобина в эритроците,

5 средняя концентрация гемоглобина,

5 ширина распределения эритроцитов; б) лейкоцитарные:

•общее количество лейкоцитов,

•лейкоцитарная формула в относительных (%) и абсолютных величи5 нах;

с) тромбоцитарные:

•количество тромбоцитов,

•тромбоцитокрит,

•средний объем тромбоцитов,

•ширина распределения тромбоцитов.

Анализатор непосредственно подсчитывает количество лейкоцитов и лей5 коцитарную формулу, количество эритроцитов, гемоглобина, гематокрит и количество тромбоцитов. Кроме гемограммы и двух изображений, прибор отображает две гистограммы для эритроцитов и тромбоцитов, которые по5 казывают количество клеток и их распределение, в зависимости от объема. Гематологический анализатор также может выявить аномальные или незре5

лые клетки, отображая это в виде различных предупреждений при анор5 мальной локализации формирований клеток на «WBC/BASO» или «4DIFF», таких как:

2. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов.

Автоматический анализатор, работающий на основе проточной цитофлу5 орометрии с применением флуоресцентного или лазерного полупроводни5 ков. Также может проводить исследование следующих параметров:

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

•процент ретикулоцитов,

•абсолютное число ретикулоцитов,

•процент незрелых ретикулоцитов.

Принцип работы метода

Отбирается образец крови путем аспирации, разбавляется и окрашивает5

ся суправитально, что способствует преципитации остаточных нуклеопроте5 идов из незрелых эритроцитов. Далее проба подвергается исследованию в оптической системе, где анализируется при помощи проточной цитофлуоро5 метрии на базе полупроводникового лазера. В результате получаем изобра5 жение, где ось X представляет латеральную флуоресцентную интенсив5 ность, и ось Y – свет, рассеянный фронтально, и при этом вырисовываются три группы: группа зрелых эритроцитов, группа ретикулоцитов и группа тромбоцитов, где ретикулоциты рассчитываются по формуле:

3. Определение СОЭ.

1. Ручной метод Вестергрена (Westergren).

Поставить пробирку в вертикальном положении в держатель с градацией в один миллиметр и определить уровень седиментации красных кровяных кле5 ток в мм/час. В некоторых тестах результат рассчитывают с интервалом в 2 ча5 са, но такой способ подсчета не дает никакой дополнительной информации.

2. Автоматизированный метод.

Осуществляется на автоматических анализаторах (СОЭ5мер), контроли5 руемых микропроцессором, измеряющим скорость оседания красных кро5 вяных клеток (СОЭ) с помощью системы инфракрасных лучей. Одновремен5 но могут быть исследованы 405160 проб в час, в зависимости от количества используемых модулей. Седиментация происходит при комнатной темпера5 туре под воздействием гравитации, и результаты выражаются в мм/час, со5 гласно методики Westergren. Так как результаты должны быть воспроизво5 димыми, необходимо, чтобы высота столбца крови из трубки для отбора проб составляла не менее 5515 мм от максимального наполнения трубки.

4. Определение показателей гемостаза.

Осуществляется на полу5 или автоматических анализаторах, принципом работы которых является коагулометрия для гемостаза и протеина S, а так5 же колориметрия для антитромбина III.

Для внутреннего контроля качества используются две контрольные плаз5 мы: плазма с нормальными показателями и одна – с патологическими зна5 чениями, обеспечивая ежедневный мониторинг точности и достоверности расчетов. Из колориметрических методов исследований используется ме5 тод, состоящий в измерении абсорбции монохромного света (с длиной вол5 ны 405 нм или 540 нм), который проходит сквозь кювету, где происходит ре5 акция формирования хромофорного вещества. Показатель абсорбции пря5 мо пропорционален уровню антитромбина III в исследуемой плазме.

5.Методы определения общих биохимических показателей, специ# фических белков.

Турбидиметрия и нефелометрия: основывается на формировании ком5 плекса антиген5антитело в растворе. Растворы антигена и антитела смеши5 ваются, при этом реактив используется в очень малых количествах, а фор5 мирование агрегатов происходит быстро. Турбидиметрия измеряет количе5 ство непреломленного света, прошедшего через раствор. Фотосенсор рас5 положен на прямой линии с источником света, абсолютно прозрачный рас5 твор пропускает до 100% света, чем выше концентрация частиц, тем мень5 ше проходит света. Нефелометрия измеряет количество рассеянного под прямым углом по отношению к лучу света, фотосенсор расположен под уг5 лом 90° к источнику освещения, абсолютно прозрачный раствор не прелом5 ляет свет. Поэтому нефелометрические измерения выявляют рост выше уровня нуля (в особенности турбидиметрия, выявляющая снижение переда5 чи до 100%), нефелометрия наиболее чувствительна к малым концентраци5 ям исследуемых веществ. Поэтапная нефелометрия представляет собой ки5 нетическое измерение формирования агрегатов. Время, за которое изгиб кривой «диспергированный свет – время» является максимальным и про5 порционален концентрации антигена. Использование турбидиметрии и не5 фелометрии: определение альбуминемии и микроальбуминурии, иммуно5 глобулинов IgА, IgG, IgM и фракций комплемента C3, C4.

ИСЭ (ион#селективные электроды): ион5селективный электрод являет5 ся трансдуктором (сенсором), преобразующим активность определенного иона, находящегося в растворе, через мембрану в электрический потенци5 ал, который может быть измерен с помощью вольтметра или pH5метром. Мембрана расположена у края пробирки, содержащей внутренний элек5 трод. Изменение потенциала измеряется электродом, расположенным из5 вне, с постоянным потенциалом. Разница потенциалов между двумя элек5 тродами зависит от активности иона в растворе, которая связана с концен5 трацией соответствующего иона, на основании которой и осуществляется анализ. ИСЭ работает по принципу гальванической клетки: потенциал клет5 ки эквивалентен потенциалу ИСЭ минус потенциал референс5электрода. Определения ИСЭ не подвержены воздействию интерференции так, как цвет пробы. Источники погрешностей – это взаимодействие с другими иона5 ми, по свойствам схожими с исследуемым ионом, разница в степени диф5 фузии ионов – в зависимости от их размеров.

Реакции латекс#агглютинации: являются серологическими реакциями, основанными на реакции антиген5антитело – микрочастицы латекса, покры5 тые молекулами антиген/антитело агглютинируют, в результате связывания

сантителом соответствующего антигена из исследуемой сыворотки. Ла5 текс5агглютинация была адаптирована для количественных исследований, использующих турбидиметрию/нефелометрию, обеспечивая повышение чувствительности.

6.Автоматизированные методы определения иммунологических маркеров.

Широкий спектр эндокринных, опухолевых, инфекционных, сердечных, костных, аллергологических и аутоиммунных маркеров определяется в ла5 боратории «СИНЭВО» автоматизированными методами, в основе которых лежит реакция антиген5антитело и методы называются иммунохимическими (аналог термина «immunoassay» в специализированной английской литера5

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

туре). Специфическое распознавание между антигеном и антителом, харак5 терное для иммунологических тестов, получило широкое распространение в качестве аналитического метода. Иммунохимические тесты используются для определения и антигенов, и антител. Чувствительность иммунологичес5 ких методов повысилась за счет развития новых систем приема сигналов и технологий с твердой фазой с твердой фазой, что позволило проводить определение уровня менее 0,1 пг/мл антигена, присутствующего в крови. Они могут применяться как для малых молекул (гаптены), так и для макро5 молекулярных белковых комплексов, а также для определения антител к ал5 лергенам, инфекционным возбудителям, автологических антигенов. Основ5 ная характеристика иммунохимических тестов состоит в маркировке анти5 гена или антитела веществом, генерирующим сигнал, который можно изме5 рить, осуществляя детекцию комплекса антиген5антитело. В зависимости от типа этих веществ, иммунохимические тесты классифицируются следую5 щим образом:

5 радиоиммунологические тесты: используется маркировка радиоизотопа5 ми (125I, 131I, 3H, 14C, 32P),

5 иммуноферментные тесты: используется маркировка ферментами,

5 иммунохимический тест с детекцией с помощью флюоресценции: исполь5 зуется маркировка при помощи флуоресцентных молекул (флюорохромов), 5 иммунохимические тесты с детекцией за счет хемилюминесценции: ис5 пользуется для маркировки молекул, которые генерируют хемилюминесцен5 цию, такие как производные люминола, акридиновые эфиры, производные

нитрофенил оксалата.

Одним из вариантов иммунохимических тестов является детекция за счет электрохемилюминесценции (ЭХЛМ, ECLIA), которая используется для мар5 кировки определенных органических соединений (соединения рутения, ос5 мия и т.д.), генерирующих электрохимическое свечение.

7. Иммуноферментные методы.

Этот тип тестов использует маркировку ферментами, которые представ5 ляют альтернативу радиоизотопному методу. Наиболее часто используемы5 ми тестами являются ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ), EMIT (радиоиммунологический анализ с ферментативным усилением). Тесты EIA нуждаются во вторичном процессе для получения сигнала в результате каталитического действия фермента. В качестве твердой фазы для отделения свободного конъюгата от связанного могут использоваться пластинки с ковшиками, пластиковые шарики, плас5 тиковые трубки, магнитные частицы или латекс с фильтрами. Использова5 ние магнитных частиц или латекса обеспечивает сокращение времени реак5 ции. Наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза, глюкозооксидаза, уреаза и каталаза. Выбор используемого фермента определяется субстратом для распознавания.

EIA колориметрический: используются хромогенные субстраты, такие как 35этил5бензотиазолин565сульфонат, который образует с перекисью во5 дорода под действием пероксидазы зеленый цвет, или n5нитрофенилфо5 сфат, образующий желтый цвет под действием щелочной фосфатазы.

EIA с хемилюминесценцией (CLIA) используют хемилюминесцентные субстраты, которые взаимодействуют с различными ферментами, использу5 емыми для маркировки, ферментная хемилюминесцентная реакция генери5

рует свет. Настоящие системы используют производные люминола с перок5 сидазой и перекисью водорода (или другая ферментативная система, кото5 рая генерирует перекись водорода как, например, глюкозоксидаза или ури5 каза) плюс потенциатор (производные фенола как, например, n5йодофе5 нол), который увеличивает эмиссию света до 3000 раз. Окислительные ре5 акции люминола могут быть представлены огромным количеством интер5 ференций, которые увеличивают неспецифический сигнал. Другая система использует щелочную фосфатазу и производное адамантилдиоксиэтана (AMPPD), которое не требует других молекул для эмиссии света, в отличие от люминола, которому необходимы окислительные соединения. AMPPD яв5 ляется сложным субстратом, образованным из одной группы адамантила, играющим роль стабилизатора целой молекулы, связь диоксетана – как ис5 точника энергии, фосфорилэстер – как место для энзимного расщепления и фенил группа – для хемилюминесценции. Этот новый субстрат сделал воз5 можным развитие исследований сверхвысокой чувствительности выше, чем

висследованиях RIA по чувствительности приблизительно 0,1 пг/мл, време5 ни и простоте выполнения. EIA, как и RIA, может быть разделена на конку5 рентные исследования (с избытком исследуемого вещества, используя ан5 тиген5ферментный конъюгат) и неконкурентные (с реагентом в избытке), ко5 торые включают иммунометрические тесты «сэндвич» для определения ан5 тигена (гормоны, онкомаркеры, инфекционные агенты, белки плазмы) и не5 прямые тесты для определения антител (анти HVC, аутоантитела). Преиму5 щества иммуноферментных тестов заключаются в разработке чувствитель5 ных исследований с помощью эффекта амплификации ферментов. Реакти5 вы являются стабильными, отсутствует радиологический риск, как и недо5 статки. Измерение ферментной активности может быть более сложным, чем измерение активности некоторых радиоизотопов, но ферментативная ак5 тивность может быть обусловлена составляющими ингредиентами сыворот5 ки.

ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ): является чувствитель5 ным методом, поскольку каждая молекула фермента может преобразовы5 вать многие молекулы субстрата, выступающие в качестве усилителя реак5 ции. Энзимы вырабатывают продукты окрашивания, которые осаждаются, так как они не диффундируют из места образования. Антиген связан с твер5 дой поверхностью, первичное антитело связывается с антигеном, а вторич5 ное энзим5меченное антитело связывается с первичным антителом. Энзим превращает субстрат в окрашенный конечный продукт, который образует преципитат пропорционально количеству антител из сыворотки пациента. Метод ELISA тип «сэндвич» с присоединенным антигеном увеличивает спе5 цифичность методики, требуя связывания антитела с двумя различными эпи5 топами (могут происходить перекрестные реакции в одном из эпитопов, но существует возможность произойти в двух эпитопах одновременно). Моно5 клональное антитело связывается на твердой поверхности и связывает анти5 ген, если оно присутствует в сыворотке пациента. Несвязанный материал промывается, одно их двух маркированных антител, которое распознает чу5 жой эпитоп, связывается с антигеном, новое промывание разделяет несвя5 занные антитела, затем присоединяет к субстрату, который превращает в ок5 рашенный продукт пропорционально количеству антигена, присутствующего

висследуемой сыворотке. Метод ELISA конкурентного типа состоит в следу5 ющих этапах: внутренняя поверхность микропластинки покрыта антителами

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

с точно оттитрованной концентрацией. Антиген из пробы и энзим5меченный антиген из конъюгата «конкурирует» в одной реакции для ограниченного ко5 личества мест из иммобилизированного антитела, после разделения конъю5 гата присоединяется хромогенный субстрат. Окрашенный продукт в резуль5 тате реакции обратно пропорционален количеству антигена из пробы.

Термин «авидность» или «функциональное родство» относится к группе антител и определяет фактическую силу связывания антигена. Авидность антител IgG является сниженной при первичных инфекциях, но увеличивает5 ся постепенно в течение недель или месяцев, как результат деятельности В5 клеток, способных вырабатывать специфические иммуноглобулины. Нали5 чие антител иммуноглобулинов IgG в повышенном титре указывает на факт перенесенной инфекции минимум 4 месяца назад, в то время как сниженный индекс авидности наводит на мысль о недавно перенесенной инфекции.

Иммунохимические тесты с определением при помощи электрохемилюми5 несценции основываются на использовании комплекса рутения (II)5три (би5 пиридил) [Ru(bpy)3]2+ с трипропиламином (TPA), который генерирует элек5 трохимический свет, в связи с циклом окислительно5восстановительных ре5 акций: Ru(bpy)32+ имеет реактивный участок для связывания с исследуе5 мым веществом, используется агент активатор, такое как N5гидроксисукци5 нимид (NHS), так как он легче связывается с аминогруппами белков, гапте5 нов или нуклеиновых кислот, что дает возможность применять данный ме5 тод к различным исследуемым веществам. Эмиссия света провоцируется электрическим импульсом иммунного комплекса (который содержит соеди5 нение рутения) фиксированного на микрочастицах, обернутых в стрептови5 дин. Преимущество электрической инициации хемилюминесцентной реак5 ции состоит в том, что она на всем протяжении может точно контролиро5 ваться. Существуют три основных принципа данного метода:

#принцип «сэндвича»: сначала проба пациента перемешивается с анти5 телами, связанными с биотином и антителами, связанными с рутением, пос5 ле инкубирования смеси добавляются парамагнетические микрочастицы, обернутые стрептавидином (твердая фаза). После второго инкубирования реакционная смесь аспирируется в измерительную камеру, а свободный конъюгат удаляется. В дальнейшем используется электрический ток для возбуждения рутения и генерации сигнала, позволяющего выявить ком5 плекс антиген5антитело, количество вырабатываемого света прямо пропор5 ционально количеству антигена в пробе;

#конкурентный принцип: изначально перемешивается исследуемое ве5 щество и антиген, связанный с биотином. После первичной инкубации до5 бавляются антитела, связанные с соединением рутения, и парамагнитные микрочастицы, обернутые с стрептавидином. Конъюгированные антитела связываются с еще не занятыми участками антигенов, связанных с биоти5 ном, а весь комплекс связывается с микрочастицами за счет взаимодей5 ствия биотина со стрептавидином. После второй инкубации реактивная смесь проходит в измерительную камеру, иммунные комплексы иммобили5 зированы магнитным методом на поверхности электрода, а несвязанные компоненты удаляются путем вымывания. Хемилюминесцентная реакция стимулируется электрически, а количество вырабатываемого света обратно пропорционально количеству антигена;

# принцип «bridging»: схож с принципом «сэндвича», но направлен на оп5 ределение антител и включает антиген, связанный с биотином, и антиген помеченный рутением.

8. Другие методы, используемые для проведения иммунологических

исерологических тестов.

Реакция агглютинации: клетки или частицы связаны друг с другом за счет

взаимодействия антиген5антитело. Антиген или антитело, прикрепленные к частицам, будь это эритроциты, латекс или металлические частицы, взаимо5 действуют с исследуемым веществом из пробы; как результат иммунной ре5 акции, частицы представляют существенную агглютинацию, которая видна невооруженным глазом. Гаптен с единственным участком для связывания не может присоединиться, так как фиксируется твердой фазой. Реакции агглю5 тинации являются очень чувствительными: маленькое количество антител мо5 жет агглютинировать с большим количеством частиц. Также они являются очень быстрыми, протекая за несколько минут. Благодаря чувствительности (~5 нг/мл) и быстроте широко используются в практике. Прямая/пассивная аг5 глютинация используется для детекции специфических антител с антигенами; обратная агглютинация используется для детекции растворенных антигенов в пробе с соответствующими антителами. Реакции агглютино5ингибирования основываются на конкурентном принципе, в котором агглютинация частиц, связанных с гаптенами ограниченным количеством антител, подавляются свободным гаптеном, содержащимся в образце исследуемого вещества.

Гемагглютинация представляет собой агглютинацию эритроцитов, вы5 званную антителами. Будучи пентамерной молекулой, иммуноглобулин Ig M является лучшим гемагглютиногеном, чем Ig G.

Пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, в которых анти5 ген был присоединен химическим способом; агглютинация выявляет антите5 ла к соответствующим антигенам. Например, группа АВ0 или ТРНА (тест ге5 магглютинации на Treponema pallidum).

Обратная пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, к кото5 рым были присоединены антитела; они агглютинируются антигенами.

Агглютинация частиц желатина и других синтетических частиц: используют5 ся специальные неантигенные частицы, которые устраняют проблемы, связан5 ные с наличием гетерофильных антител в ходе использования эритроцитов как частиц; могут заменить любой тест, основанный на гемагглютинации, за исключением тестов, использующих эритроциты из исследуемой пробы как частицы. Обеспечивают более чувствительную детекцию, чем при использова5 нии клеток крови. Концентрация антител может определяться путем титрова5 ния: осуществляется серийное разведение сыворотки; в каждом разведении концентрация антител уменьшается в два раза. В определенном разведении не существует достаточной концентрации антител, которые связывались бы со всем антигеном полностью; титр антител представляет фактор разведения в последней пробирке, где произошла полная реакция, например:

Результат: титр = 1:64

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

Реакция может быть ингибирована при повышенной концентрации анти5 тел. Ингибиторы обычно представлены в малых концентрациях. По мере растворения ингибитора, реакция становится положительной. Результат из5 начально отрицательный, называется «прозона».

Реакции преципитации: комплекс антиген5антитело образует видимый преципитат, который можно определить качественно невооруженным взглядом или количественно при помощи детектора. Формирование пре5 ципитата нуждается в формировании крупных молекулярных агрегатов путем связывания антигена с антителом. Малые комплексы остаются рас5 творенными. Для формирования больших комплексов и антитела, и анти5 гены должны быть поливалентными. Концентрация преципитата зависит как от абсолютной концентрации антигена и антитела, так и от их относи5 тельной концентрации. Если антитело или антиген находятся в избытке относительно друг друга, образуется малое количество растворимых ком5 плексов, преципитат уменьшается количественно или отсутствует, и, со5 ответственно, антитела или антигены остаются свободными в растворе. При приблизительно равных количествах антител и антигенов начинается формирование преципитата. Соотношение концентраций, при которых образуется максимальное количество преципитата и ни антитела, ни ан5 тигены не остаются в растворе, и являются точкой эквивалента. Другие условия, такие как температура, рН, ионное насыщение раствора, срод5 ство и авидность антител также являются важными в формировании им5 мунного преципитата.

Иммунноэлектрофорез: первоначально осуществляется электрофорети5 ческое разделение сывороточных белков в гель5агаре, далее антитела раз5 мещаются в бороздке в агаре. Антитела и белки диффундируют друг к дру5 гу и формируют дуги преципитации; различные белки могут идентифициро5 ваться специфическими антителами. Если специфические антитела распре5 делены по всей поверхности геля, то формируется полоска преципитации.

5.7 Методы, используемые в микробиологии.

Быстрое выявление микроорганизмов и изучение морфологии, необходи5 мой для микробиологической диагностики, осуществляется путем микро5 скопического исследования.

Микроскопическое исследование может быть свежим, между предметным

ипокровным стеклами или зафиксированным и окрашенным.

Под мазком понимается микробный материал (патологический материал

или микробная культура), размещенный в тонком слое на поверхности пред5 метного микроскопического стекла. Для создания мазка используются мик5 роскопические чистые и обезжиренные стекла, которые маркируются име5 нем пациента с одного края и названием микробиологического материала, который необходимо выявить, с другого.

Для каждого патологического материала делается 2 мазка (исключением являются пункционные жидкости, из которых делают 4 мазка), один окраши5 вается по Граму (для выявления бактерий), а второй – Giemsa (для опреде5 ления клеточной специфичности).

Мазок из патологического материала носит название окрашенного микро5 скопического исследования и имеет очень важное значение для медицин5 ской бактериологии. Она применяется для следующих целей:

5 быстрая ориентировка в диагнозе при неотложных состояниях (пример: бактериальный менингит);

5 ориентация микробиолога при уничтожении несоответствующего пато5 логического материала (пример: слюна вместо мокроты);

5 корреляция между состоянием пациентов и результатами, которая по5 зволяет перейти от предварительного к окончательному диагнозу.

Почти все бактерии с клиническим значением могут быть выявлены при помощи окрашенной микроскопии. Исключение составляют бактерии, кото5 рые обитают, в большинстве случаев, внутриклеточно, например, Chlamidia, а также те, которые располагаются в клеточной стенке (например, Mycoplasma и Ureaplasma) и те, которые имеют достаточные размеры для визуализации в микроскопе (пример: спирохета).

Методы окрашивания.

1. Простые окрашивания: используется один краситель и выявляется только морфология микроба – размеры, форма, группировка клеток, на5 личие капсулы. Из методов простого окрашивания традиционным и быс5 трым является окрашивание метиленовой синью, которая окрашивает в синий цвет все клеточные элементы – бактерии, лейкоциты, клетки эпи5 телия.

2. Дифференцированное окрашивание: выявляет, кроме морфологичес5 ких характеристик, и цветовые реакции микроорганизмов. Окрашивания по Граму и Цилю5Нильсену являются наиболее используемыми в бактериоло5 гии. Различные типы окраски бактерий при использовании методики окра5 шивания по Граму зависят от структурных особенностей клеточной стенки. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамот5 рицательные – в красный. Лейкоциты и эпителиальные клетки содержат ци5 топлазму, окрашенную в розовый цвет и ядро – в красный цвет. Окрашива5 ние по Цилю5Нильсену используется для идентификации следующих групп бактерий: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella и ооцист Cryptosporidium, Isopora, Sarcocystis и Cyclospora. Обычно в бактериологии окрашивание по Цилю5Нильсену применяется для выделения микобакте5 рий. Они, в отличие от других бактерий, благодаря наличию в бактериаль5 ной стенке некоторых восковых веществ, окрашиваются при комнатной тем5 пературе основным фуксином и выдерживаются для обесцвечивания в рас5 творимых неорганических кислотах и спирте. Кислото5 и спиртоустойчивые бациллы окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые – в синий цвет, так же, как и лейкоциты и клетки тканей, цитоплазма которых окраши5 вается в голубой с голубым ядром.

Внутренний контроль качества мазков является обязательным и прово5 дится с положительным и отрицательным контрольным образцом.

При окрашивании по Граму используем следующие контрольные образцы: 5 положительный образец: Staphylococcus aureus АТСС 25923;

5 отрицательный образец: Escherichia coli АТСС 25923.

Культивирование

Бактерии, принадлежащие к различным видам, могут иметь схожие мик5 роскопические характеристики, поэтому их идентификация предполагает и изучение физиологических характеристик, исследуемых «in vitro» на пита5 тельных средах. Бактериальная культура представляет собой результат ро5 ста и размножения бактерий в питательной среде и имеет цель:

5 выделение патогенных микроорганизмов из отобранного патологическо5 го материала;

5 идентификация патогенных агентов;

ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО

5 определение чувствительности к антибиотикам в целях инициации и мо5 ниторизации антимикробной терапии.

Классификация сред для культивирования может проводиться в за# висимости:

Для каждой категории отобранного патологического материала использу5 ется традиционная среда или набор сред, позволяющих выделить бактерии, наиболее часто вовлеченные в соответствующие инфекционные процессы. Этот набор традиционных сред может быть дополнен другими средами, в соответствии с клинико5эпидемиологическими данными. Для выделения па5 тогенных колоний из мультиконтаминированного продукта необходимо про5 вести посев на дифференциальные среды. В случае, когда установлено, что отобранная проба содержит уменьшенное количество колоний, необходимо использовать жидкие обогащенные среды (бульон для аэробных колоний, тиогликолитический бульон с ресазурином для анаэробов, селенитовый бу5 льон для копрокультуры и т.д.). Инкубация сред для посева проводится с учетом высоких требований, предъявляемых к подозрительным бактериям:

5 аэробные бактерии культивируются в обычных условиях воздушной среды;

5 карбоксифильные бактерии требуют инкубации при повышенном содер5 жании СО2 в воздушной среде в эксикаторе с использованием свечки;

5 строго анаэробные бактерии культивируются при помощи систем Gaspak.

Большинство бактерий, интересующих нас с медицинской точки зрения, растут при 37 °С, в отличие от грибов, оптимальная температура роста ко5 торых 30 оС. Длительность инкубирования сред составляет 24548 часов для обычных бактерий; 255 суток – для грибов.

Наблюдение культивирования: аспект культивирования зависит от типа и состава среды. В жидкой среде рост может быть равномерным, с образова5 нием отложений, гранул, пленки, колец, газа, пигмента. На твердых средах бактерии образуют колонии, характер которых (форма, размер, поверх5 ность, прозрачность, консистенция, запах) и количество ориентирует микро5 биолога на правильный ход диагностики. Важным аспектом является отсут5 ствие бактериального роста в случае обычных мультиконтаминированных продуктов (например, назофарингеальный экссудат, копрокультура, ваги5

нальные выделения). Данный факт предполагает, что пациент проходит си5 стематическое или местное лечение антибактериальными препаратами. Значение клиники некоторых выделенных культур может быть установлено также на основе первичной культуры, в случае отбора выделенных культур из неконтаминированных проб (жидкость из пункции) или грамотрицатель5 ных бацилл, выделенных за определенным порогом в количественной уро5 культуре. При выделении монобактериальных культур из нормальных сте5 рильно отобранных проб (гемокультура, жидкость из пункции) проводится прямая идентификация и антибиотикограмма. Из мультиконтаминирован5 ных культур проводится пересев колоний, затем – идентификация до уров5 ня вида и тест на чувствительность к антибиотикам. Их селекция осуществ5 ляется, в зависимости от аспекта колонии, характера отобранного образца, клинической диагностики и результатов микроскопического исследования с окрашиванием. Реакции антиген5антитело (агглютинация на стекле и ла5 текс5агглютинация) находят применение в лаборатории при идентификации антигенов из некоторых выделенных культур с клиническим значением при подтверждении рода и вида. Колонии E.coli, вызывающие диарейный синд5 ром, классифицируются на основе патогенных механизмов у: энтеропато5 генной E.coli (EPEC), энтероинвазивной E.coli (EIEC), энтеротоксигенной E.coli (ETEC), энтерогеморрагической E.coli (EHEC), энтероагрегативной E.coli (EAEC). Биохимическая идентификация не дифференцирует патоген5 ные штаммы Е. coli от непатогенных, поэтому рекомендуется провести тест по серотипированию. Врач5клиницист на основе клинических признаков должен уточнить в направлении серотип, на который должна быть исследо5 вана проба пациента. Высев на обогащенные среды (например, бульон с се5 ленитом натрия) и на селективные среды способствует росту сальмонелл и позволяет дифференцировать от других видов энтеробактерий.

Бета#гемолитические стрептококки, изучаемые в медицине:

+Str.pyogenes (группа A), вызывающие фарингиты, кожные инфекции, по5 ловые инфекции, последствия постстрептококковой инфекции;

+Streptococcus (группа B), являющиеся частью нормальной микрофлоры урогенитального тракта женщины, верхних дыхательных путей, нижнего пи5 щеварительного тракта; у новорожденных детей, инфицированных матерью, вызывают менингит, септицемию, у взрослых – инфекции с различной лока5 лизацией, а у беременных – аборты и послеродовую септицемию;

5 группа C и G вызывают схожие инфекции со стрептококком A, но немно5 го реже.

Антибиотикограмма

Микробиологическая лаборатория играет важную роль в лечении инфек5 ций, используя идентификацию бактерий и тестирование на антибиотико5 чувствительность. Основная цель – это лабораторная помощь в установле5 нии клинического диагноза.

Антибиотикограмма необходима в следующих случаях: 5 назначение лечения врачом5клиницистом;

5 выявление тех штаммов, которые обладают энзимами, способными инактивировать действие антибиотиков in vivo;

5 эпидемиологический надзор за резистентными бактериями;

5 сравнение резистентных фенотипов штаммов, вызывающих нозокоми5 альные инфекции.