Методичка по мол биологии (там не все)

тидными последовательностями. При взаимодействии с ДНК РНКполимераза «закрывает» участок размером 60 п.н.

В клетке E.coli присутствуют несколько σ-факторов, они ответственны за узнавание РНК-полимеразой различных промоторов. Как правило σ-факторы узнают блоки, отстоящие от точки начала транскрипции приблизительно на 10 и 35 нуклеотидов (рис. 4.3). Эти блоки имеют консервативные (общие для всех в пределах одной группы промоторов) нуклеотидные последовательности.

Рис.4.3. Организация промотора. Номером +1 обозначается нуклеотид матричной цепи, с которого начинается транскрипция. Нуклеотиды, стоящие перед ним, имеют отрицательные номера, после него – положительные. Последовательность ТАТААТ называется ТАТА-блоком или Прибнов-блоком.

Последовательность ТТГАЦА называется блоком-35.

Различные σ-факторы отвечают за узнавание различных групп промоторов и обеспечивают транскрипцию определенных генов (табл.1).

Инициация транскрипции включает образование двойного закрытого комплекса, затем формируется двойной открытый комплекс и после этого происходит синтез коротких олигорибонуклеотидов. После того, как синтезируется фрагмент РНК более 9 нуклеотидов, σ- фактор необратимо диссоциирует и транскрипция вступает в стадию элонгации. Элонгацию осуществляет кор-фермент – α2ββ’ (рис. 4.4).

52

ρ-Независимая терминация обеспечивается образованием шпильки на РНК в процессе транскрипции и следующей за ней оли-

гоуридиловой последовательностью. Шпилька приводит к паузе в транскрипции, а олигоуридил-олигоадениловый дуплекс, как наиме-

нее стабильный, диссоциирует во время паузы (рис. 4.5).

Рис. 4.5. ρ-Независимая терминация

В случае ρ-зависимой терминации на синтезируемой РНК находится участок, с которым взаимодействует ρ-фактор (рис. 4.6). ρ- Фактор является НТФазой и способен использовать энергию гидролиза НТФ для движения по молекуле РНК от места посадки, расположенного в области 5’-конца РНК, в сторону ее 3’-конца. Как только ρ-фактор «догонит» работающую РНК-полимеразу, происходит терминация транскрипции (рис. 4.6).

54

c)РНК-полимераза III транскрибирует гены тРНК, 5S рРНК и мяРНК.

РНК-полимеразы эукариот в отличие от РНК-полимераз прокариот не способны самостоятельно инициировать синтез РНК. Только при наличии особых белков – факторов транскрипции – они приобретают способность осуществлять данный процесс.

Кроме ядерных РНК-полимераз у эукариот в митохондриях и хлоропластах присутствуют другие РНК-полимеразы.

РНК-полимераза I

РНК-полимераза I эукариот является большим ферментом, состоящим не менее чем, из 11 субъединиц, и транскрибирующим гены рРНК. Гены рРНК представлены в геноме клетки большим числом копий и кодируют три наиболее крупных рРНК – 18S, 5,8 S и 28S.

Гены рРНК расположены в виде серии тандемных повторов, отделенных друг от друга спейсером (рис. 4.7). В конце спейсера находится сайт терминации (Т), он же отвечает и за реинициацию синтеза нового транскрипта. После освобождения транскрипта в сайте терминации РНК-полимераза I остается связанной с ДНК, и затем при участии белкового фактора начинает синтез нового транскрипта. В спейсере имеются энхансеры (40 – 60 п.н.), активирующие транскрипцию в десятки раз. Степень активации пропорциональна числу энхансеров.

Рибосомные гены (рис. 4.7) транскрибируются в ядрышках в виде единого 45S-РНК транскрипта (13000 нуклеотидов). После синтеза 45S-РНК расщепляется с образованием 28S-РНК (около 5000 нуклеотидов), 18S-РНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,8S-РНК (около 160 нуклеотидов).

Транскрипция генов рРНК соответствует 50 – 70 % от общего объема клеточной транскрипции.

У человека гаплоидные клетки содержат около 200 генов рРНК, которые распределены в виде небольших кластеров по пяти хромосомам.

56

5S рРНК кодируется другими генами и транскрибируется РНКполимеразой III.

Рис. 4.7. Организация и транскрипция генов рРНК

РНК-полимераза II

РНК-полимераза II ответственна за синтез иРНК и состоит из более, чем 10 субъединиц. Тем не менее, она не в состоянии самостоятельно осуществлять транскрипцию. Для ее работы требуется дополнительно десятки белковых молекул, так называемых факторов транскрипции.

В узнаваемом РНК-полимеразой II промоторе в пределах 100200 п.н. перед стартом транскрипции обнаружены канонические нуклеотидные последовательности: TATA, CAAT, GC -блоки и др. (рис. 4.8). В различных промоторах могут присутствовать разные блоки, расположенные в различном порядке относительно друг друга и на разных расстояниях от точки начала транскрипции. Неодинаковая структура промоторов обуславливает различия в экспрессии генов.

Точка начала транскрипции

CAAT GGGCGG TATA

Рис. 4.8. Условная схема расположения нуклеотидных последовательностей в промоторах для РНК-полимеразы II

Особую роль в регуляции скорости транскрипции играют полинуклеотидные последовательности – энхансеры и сайленсеры. С энхансерами взаимодействуют белки-активаторы, которые, контак-

57

тируя с РНК-полимеразой, активируют ее, в результате транскрипция генов усиливается (рис. 4.9). С сайленсерами же взаимодействуют белки-ингибиторы, оказывающие тормозящие действие на активность РНК-полимеразы и снижающие скорость транскрипции.

Рис. 4.9. С энхансерами взаимодействуют белки-активаторы, которые, контактируя с РНК-полимеразой, активируют ее

Энхансеры могут занимать различное положение относительно гена. Чаще они располагаются перед геном за несколько сот и даже за несколько тысяч п.н. В то же время энхансеры обнаружены в интронах. Иногда они находятся за геном. Свойствами энхансера могут обладать и кодирующие последовательности. В некоторых случаях интенсивность транскрипции гена может контролироваться несколькими энхансерами. Граница энхансера бывает размыта – удаление нуклеотидных последовательностей постепенно снижает его активность. Однако энхансеры могут содержать блоки, мутации в которых резко снижают их активность. Энхансеры можно переносить от одного гена к другому.

Энхансеры в зависимости от регуляторного фактора могут вести себя как сайленсеры.

Организация сайленсеров имеют много общего с организацией энхансеров.

РНК-полимераза III

РНК-полимераза III транскрибирует гены 5S рРНК, тРНК и нескольких мяРНК. Эти три класса генов используют свои собственные классы промоторов. Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразой III, находится внутри генов тРНК и 5S рРНК. В случае генов тРНК промоторы состоят из двух блоков: 1-й блок начинается через 8 – 30 п.н.

58

после точки начала транскрипции и представлен в усредненном виде последовательностью TGGCNNAGTGG, 2-й блок находится на расстоянии +51…+72 и его усредненная последовательность –

GGTTCGANNCC (N – любой нуклеотид).

Что касается генов, кодирующих мяРНК, то их промоторы расположены перед точкой начала транскрипции. У большинства генов этого класса промоторы состоят из ТАТА-блока с центром в положении -30 и из второго блока с центром в положении -60.

НЕМАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ РНК

Существуют ферменты способные синтезировать РНК в отсутствие матрицы. К ним относится полинуклеотидполимераза и полиаденилатполимераза.

Полинуклеотидполимераза – встречается у бактерий и использует в качестве субстратов рибонуклеозид-5’-дифосфаты (НДФ) – АДФ, ЦДФ, ГДФ и УДФ. Этот фермент катализирует реакцию, которую в общем виде можно представить так:

Реакция обратима. Фермент катализирует образование 3’-5’- фосфодиэфирных связей:

59

НТФ и дезоксинуеозидтрифосфаты полинуклеотидполимераза в качестве субстратов для синтеза РНК использовать не может. Полиаденилатполимераза обеспечивает синтез полиА-последо- вательности на 3’-конце иРНК. В качестве субстрата использует АТФ и РНК (рис. 4.10).

Рис. 4.10. Полиаденилатполимераза синтезирует поли-А последовательность на 3’-конце иРНК

Фермент катализирует образование 3’-5’-фосфодиэфирных связей.

В заключении следует отметить, что транскрипция является одним из сложнейших биологических процессов, играющих центральную роль в реализации генетической информации. В его осуществлении принимают участие многочисленные белковые молекулы.

60