Методичка по мол биологии (там не все)

Глава 2. РЕПЛИКАЦИЯ

Одной из важнейших функций нуклеиновых кислот (НК) является передача генетической информации от родителей потомкам. Этот процесс связан с удвоением, или репликацией, НК (ДНК или РНК), выполняющей функцию хранителя генетической информации, и последующей передачи ее потомкам. Например, в результате деления дочерние клетки получают от материнской идентичные молекулы ДНК, а, следовательно, и идентичную генетическую информацию. При размножении вирусы также передают дочерним вирусным частицам точные копии НК (ДНК или РНК). При половом размножении потомки получают генетическую информацию от обоих родителей. Вот почему дети наследуют признаки обоих родителей.

Итак, в результате репликации НК образуются дочерние молекулы, нуклеотидные последовательности которых идентичны как между собой, так и с материнской молекулой НК. Репликации может подвергаться как ДНК, так и РНК (у РНК-содержащих вирусов). В основе репликации лежит принцип комплементарности.

Различают три типа репликации: полуконсервативный, консервативный, дисперсный.

В случае полуконсервативного типа репликации вновь синтезированная молекула НК состоит из одной материнской и одной дочерней полинуклеотидных цепей.

При консервативной репликации вновь синтезированная молекула НК состоит только из дочерних полинуклеотидных последовательностей.

При дисперсной репликации вновь синтезированная полинуклеотидная цепь НК состоит из фрагментов дочерних и материнских полинуклеотидных последовательностей.

Для прокариот и эукариот характерен полуконсервативный тип репликации. У вирусов встречаются все три типа репликации. Далее более подробно рассмотрим процессы репликации у прокариот и эукариот. Репликация у вирусов представлена в разделе «Организация генома вирусов».

21

БЕЛКИ И ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ

ВРЕПЛИКАЦИИ ДНК

Врепликации ДНК принимают участие многочисленные белки

иферменты. Рассмотрим их основных представителей.

ДНК-полимеразы

ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК. Субстратом для этих ферментов являются дНТФ: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Уравнение реакции, катализируемой ДНК-полимеразами, в общем виде выглядит так:

ДНК-полимеразы последовательно добавляют нуклеотиды к 3’ - концу полинуклеотидной цепи:

Синтез новой цепи происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. ДНК-полимераза может только наращивать цепь ДНК, начать же синтез ДНК с нуля она не в состоянии, для начала ее работы тре-

буется затравка. В качестве затравки может выступать фрагмент ДНК или РНК (рис. 2.1). ДНК-полимераза способна удлинять цепь

22

также только в присутствии цепи, играющей роль матрицы (рис. 2.1). Нуклеотиды присоединяются к затравке в соответствии с принципом комплементарности, напротив аденина всегда будет встраивается тимин, а напротив гуанина – цитозин (рис. 2.1).

Рис. 2.1. ДНК-полимераза наращивает цепь в направлении 5’ 3’. Для этого ей нужны матрица и затравка

ДНК-полимеразы способны копировать любую цепь ДНК, т.е.

они не специфичны к последовательности нуклеотидов матрицы.

Скорость ДНК-полимеразной реакции колеблется в пределах от 50

нуклеотидов в секунду у эукариот до 500 нуклеотидов в секунду у прокариот.

Главной задачей ДНК-полимераз является снятие точной копии с матрицы, в связи с этим они проверяют комплементарность каждо-

го нуклеотида дважды: перед включением его в состав растущей це-

пи и перед тем как включить следующий нуклеотид. Очередная фос-

фодиэфирная связь образуется, если последний нуклеотид компле-

ментарен матрице. Если включен некомплементарный нуклеотид, то он удаляется за счет 3 5’-экзонуклеазной активности ДНК-

полимеразы, и только после удаления некомплементарного нуклео-

тида ДНК-полимераза продолжит наращивать цепь ДНК (рис.2.2).

23

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПЛИКАЦИИ

Репликация ДНК начинается в определенном месте – в точке начала репликации. Репликация от точки начала репликации может происходить в одном (рис. 2.6 А) или двух направлениях (рис. 2.6 Б).

Рис. 2.6. Направления движения репликативной вилки от точки начала репликации

Бактериальная хромосома имеет одну точку начала репликации, т.е. представляет собой единицу репликации, получившее название репликон, иначе говоря, бактериальная хромосома представлена одним репликоном (рис. 2.7)

Рис. 2.7. Бактериальная хромосома представлена одним репликоном

26

ДНК эукариот имеет множество точек начала репликации, т.е. она имеет полирепликонную организацию. Репликация ДНК эукариот продолжается до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Полирепликонная организация ДНК эукариот

Размеры репликонов и скорость движения репликативной вилки у эукариот значительно меньше, чем у прокариот (табл. 2.1).

МЕХАНИЗМ РЕПЛИКАЦИИ У E.Coli

В клетках E.coli присутствуют три ДНК-полимеразы. Охарактеризуем их.

27

ДНК-полимераза I

На одной полипептидной цепи ДНК-полимеразы I находятся 2 активных центра:

a)1-й активный центр ответственен за полимеразную и 3’→ 5’-экзонуклеазную активности. Последняя обеспечивает удаление ошибочно встроенных нуклеотидов;

b)2-й активный центр ответственен за 5’→ 3’-экзонуклеазную активность. Эта активность необходима для удаления РНКзатравки в процессе репликации.

ДНК-полимераза II

Этот фермент обладает полимеразной и 3’→ 5’-экзонуклеазной активностями, предпочтительнее работает на двухцепочечных ДНК с брешами (рис. 2.9). ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК.

Рис. 2.9. ДНК-полимераза II предпочтительнее работает на двухцепочечных ДНК с брешами

ДНК-полимераза III

Этот фермент обладает полимеразной и 3’→5’-экзонуклеазной ак-

тивностями, состоит из десяти типов субъединиц. Его основное на-

значение – репликация ДНК. Скорость синтеза – 500 нуклеотидов в

секунду

Хромосома Е.coli имеет одну точку начала репликации (oriC),

ее – размер 258 н.п. Белок Dna А узнает OriC и инициацирует репли-

кацию. В результате АТФ-зависимая хеликаза начинает расплетать

28

дуплекс ДНК (рис. 2.10). Топоизомераза, располагаясь впереди по ходу движения репликативной вилки, снимает напряжение, возни-

каюшее в результате расплетения двойной спирали в ДНК. С обра-

зующимися одноцепочечными участками ДНК связывается SSB-

белок (рис. 2.10). Праймаза осуществляет синтез затравки (рис. 2.10, 2.11), которая необходима для проявления активности ДНК-

полимеразы. Затем в работу включается ДНК-полимераза III, которая последовательно присоединяет нуклеотиды к 3’-концу полинукле-

тидной цепи (рис. 2.10). Поскольку синтез ДНК осуществляется в направлении 5’→ 3’, одна цепь (ведущая) синтезируется непрерывно

(рис. 2.11), вторая фрагментами (отстающая цепь) по 1000 – 2000

нуклеотидов (фрагменты Оказаки). По окончанию синтеза фрагмента Оказаки ДНК-полимераза I за счет 5’→ 3’-экзонуклеазной активно-

сти удаляет затравку и заменяет ее ДНК. После действия этого фер-

мента между фрагментами Оказаки остается разрыв, который сшива-

ет ДНК-лигаза (рис.2.10, 2.11).

Рис. 2.10. Кооперативное действие белков в репликационной вилке

29