Методичка по мол биологии (там не все)

ДНК-полимераза δ обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями.

ДНК-полимераза ε обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями.

ДНК-полимераза γ обеспечивает репликацию и репарацию митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом.

ДНК-полимераза обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями, осуществляет синтез ДНК при SOSрепарации.

Скорость синтеза ДНК у эукариот приблизительно на порядок ниже, чем у прокариот и составляет около 50 нуклеотидов в секунду.

Схема процесса репликации ДНК эукариот представлена на рис. 2.12.

Рис. 2.12. Репликация ДНК эукариот

Размер фрагментов Оказаки у эукариот меньше, чем у прокариот и составляет около 100 нуклеотидов. Инициация репликации у эукариот происходит на многочисленных точках начала репликации. Например, у млекопитающих точки начала репликации располагаются на расстоянии ~ 100 тыс. н.п. друг от друга. Синтез ДНК в репликонах происходит в двух направлениям (рис. 2.13). Наличие многочисленных репликонов у эукариот связано с большими размерами

31

ДНК и более низкой активностью ДНК-полимераз. Полирепликонная организация ДНК требует, чтобы в каждом цикле клеточного деления каждый репликатор «сработал» только один раз.

Рис. 2.13. Синтез ДНК в репликонах

Продвижение репликативной вилки прекращается при столкновении с другой вилкой или при достижении конца хромосомы. Таким образом, в результате репликации образуются две дочерние молекулы ДНК, являющиеся точными копиями материнской. Причем каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной материнской и одной дочерней цепей ДНК. Такой тип репликации является полуконсервативным. Образовавшиеся молекулы ДНК в результате митоза распределяются между дочерними клетками. Репликация обеспечивает воспроизведение генотипов в ряду поколений.

СИНТЕЗ ТЕЛОМЕР

Соматические клетки могут делиться ограниченное число раз, например, эмбриональные клетки могут делиться до 80 раз, клетки 70-летнего человека – только 20 – 30 раз. Способность клеток делится ограниченное число раз носит название лимита Хейфлика.

В ряде случаев клетки способны преодолеть лимит Хейфлика и начать делиться неограниченно, это явление называется – имморта-

лизация клеток.

За 50 делений масса потомков одной клетки может соста-

вить 20 000 000 т.

Ограничение числа делений клеток определяется наличием особых структур на концах хромосом – теломер. Теломеры состоят из повторяющихся коротких последовательностей ДНК. У многих

32

видов они представлены высококонсервативными повторами ТТАГГГ. ДНК теломер не кодирует белки. У человека размер теломер может составлять от 2000 до 20 000 п.н. В процессе развития организма размер теломер уменьшается. Клетки, имеющие меньший размер теломер, имеют меньший потенциал делений. Уменьшение теломер в процессе деления клеток связано с недорепликацией концов хромосом. Недорепликация концов хромосом определяется тем, что в процессе репликации используется РНК-затравка и синтез ДНК протекает в направлении 5’→3’ (рис. 2.14) .

Рис. 2.14. Недорепликация хромосом

За наращивание теломер ответственен фермент – теломераза. Однако на определенной стадии развития происходит выключение гена теломеразы. Поэтому теломеры в процессе деления укорачиваются, что приводит к ухудшению функционирования хромосом, так как теломеры защищают генетический материал от деградации и ответственны за расположение хромосомы в клетке и ее функционирование. Следует отметить, что теломеразные гены выключаются только у организмов, размножающихся половым путем, но не вегетативным.

Теломераза является РНК-содержащим ферментом. В составе РНК-компонента теломеразы имеется тринуклеотид, комплементарный соответствующему участку повторяющейся последовательности теломеры. В результате их комплементарного взаимодействия (рис.2.15) образуется матричная область, которую использует фермент для синтеза фрагмента теломеры. После заверщения синтеза этого фрагмента происходит перемещение (транслокация РНКкомпонента теломеразы в направлении 3’-конца, синтезируемой це-

33

пи. Теломераза вновь способна продолжить синтез ДНК. Этот циклический процесс повторяется многократно до тех пор, пока не завершится синтез соответствующей цепи ДНК.

Рис. 2.15. Механизм действия теломеразы

После того как теломераза завершит синтез цепи ДНК в направление 3’-конца, при участии ДНК-полимеразы и других белков происходит синтез комплементарной ей цепи (рис. 2.15). Так происходит образование теломер.

Рис. 2.16. Образование теломеры

34

Теломеразная РНК закодирована в генах, ее длина у различных организмов не одинакова: у простейших она составляет 150 – 200 нуклеотидов, у человека и мыши – 450 нуклеотидов, у дрожжей – 1300 нуклеотидов.

Матричная область РНК теломеразы находится на расстоянии 50 нуклеотидов от ее 5’-конца. У теломеразы мышей матричная область РНК составляет 8 нуклеотидов, у человека – 11. Тем не менее обе последовательности кодируют одну и ту же повторяющуюся единицу теломеры.

Взародышевых клетках ген теломеразы экспрессируется, и, следовательно, в них проявляется теломеразная активность, и происходит синтез теломер. В соматических же клетках ген теломеразы выключен, и теломеразная активность не определяется.

Враковых клетках происходит активация гена теломеразы, и поэтому в них уровень активности теломеразы достаточно высок и вследствие этого происходит синтез теломер. Они в раковых клетках хоть и короче, чем в эмбриональных, но стабильны.

Использование антисмысловых РНК к РНК-компоненту теломеразы вызывало гибель опухолевых клеток HeLa. Эти эксперименты говорят о важной роли теломеразы в перерождении нормальных клеток в раковые. В тоже время получены мыши, нокаутированные по гену, кодирующему РНК-компонент теломеразы. У них отсутствовала активность теломеразы. Однако они были жизнеспособными

втечение 6 поколений. Кроме того клеточные линии из этих мышей подвергались иммортализации, трансформировались вирусными онкогенами и становились онкогенными для бестимусных мышей. Клетки мышей четвертого поколения не содержали теломерных повторов, характеризовались различными аномалиями. Эти данные подтверждают необходимость теломеразы для поддержания теломер, но отрицают ее роль в иммортализации клеток и их злокачественной трансформации.

Подытоживая вышесказанное, следует отметить, что воспроизведение генетической информации является сложнейшим биологическим процессом, в котором участвуют многочисленные факторы.

35

Глава 3. РЕПАРАЦИЯ ДНК

В молекуле ДНК под действием внешних и внутренних факто-

ров постоянно происходят повреждения в структуре – мутации. Они в большинстве своем являются нежелательными для клетки, а накоп-

ление их в больших количествах может оказаться губительным и привести к необратимым изменениям, в результате которых клетка не сможет выполнять свое предназначение или вообще перестанет существовать. Таким образом, чтобы клетка могла нормально функ-

ционировать, нарушения, возникающие в структуре ДНК, должны исправляться. Функция исправления ошибок в ДНК возложена на многочисленные, так называемые, системы репарации.

ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ДНК

В клетке происходят разнообразные повреждения ДНК. Рас-

смотрим их.

Апуринизация

Под апуринизацией понимают гидролитическое отщепление

пурина из полинуклеотидной цепи:

Результатом апуринизации является образование АР-сайта (рис. 3.1).

36

Г Ц

Ц

T A

3'-конец 5'-конец

Рис. 3.1. АР-сайт

Ежедневно клетка человека теряет около 5000 – 10000 пуринов. Образование АР-сайта может также произойти и при удалении

пиримидинов.

Дезаминирование азотистых оснований

Дезаминированию в клетке подвергается цитозин, аденин и гуанин. При дезаминировании цитозина образуется урацил:

аденина – гипоксантин:

37

гуанина – ксантин:

Наиболее часто дезаминированию подвергается цитозин, в клетке человека в течение суток дезаминируется около 100 этих азотистых оснований. Дезаминирование цитозина приводит к появлению в молекуле ДНК неспаренных оснований (рис.3.2), т.к. образовавшийся урацил комплементарен аденину, а не гуанину.

Рис.3.2. Дезаминирование цитозина приводит к появлению

вмолекуле ДНК неспаренных оснований

Вклетках эукариот цитозин может подвергаться метилированию, в результате которого образуется 5-метилцитозин:

При его дезаминировании образуется тимин:

38

Дезаминирование 5-метилцитозина опасно, поскольку может привести к мутации, так как после репликации в одной из двух до-

черних молекул ДНК пара ЦГ будет заменена на ТА (рис. 3.3)

Рис. 3.3. Дезаминирование 5-метилцитозина может привести к мутации после репликации ДНК

Алкилирование

При участии алкилирующих факторов может происходить алкилирование азотистых оснований. В результате алкилирова-

ния гуанина может образоваться, например, 6О-метилгуанин или

7-этилгуанин:

39

OCH3

N N

О6-метилгуанин

7-этилгуанин

H2NN N

ДНК

Алкилированные азотистые основания могут образовывать неканонические пары, например, 7-этилгуанин с тимином, а также способствовать апуринизации.

Образование тиминовых димеров может происходить под дей-

ствием ультрафиолетового света:

Окисление азотистых оснований происходит при участии ак-

тивных форм кислорода (супероксиданион-радикала ·О2-, одноэлектронного гидроксила ·ОН и др.). Например, в результате окисления цитозина образуется 5-гидроксицитозин и 5-гидроксиурацил:

5-гидроксицитозин 5-гидроксиурацил

Окисленные азотистые основание способны образовывать неканонические пары.

40