1.3 Полимеразная цепная реакция

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК- полимеразы (репликация ДНК). Метод позволяет добиться колоссального (до 10 в 12 степени раз) увеличения или амплификации числа копий определенного фрагмента ДНК.

Состав реакционной смеси:

Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки подойдёт даже суспензия клеток. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.

Праймеры — это искусственно синтезированные короткие цепочки нуклеотидов (15–30 штук), комплементарные выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.

Четыре вида дезоксинуклеотидтрифосфатов (нуклеотидов), необходимых для строительства цепей ДНК: — АТФ, ТТФ, ЦТФ и ГТФ.

ДНК-полимераза – фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей.

Буфер – раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы [5, c. 55].

Стадии ПЦР:

1. Денатурация.

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 0,5—2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

2. Отжиг (гибридизация ДНК с праймерами): когда цепи разошлись температуру снижают до 30-35°С, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей происходит образование двунитиевого участка ДНК в строго специфичных областях комплементарных праймеров. Время стадии отжига — 30 секунд, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов.

3. Элонгации комплементарной мРНК: при температуре 60-70°С начинается синтез ДНК-полимеразой дочерней цепи ДНК с двунитиевого участка образованного праймерами. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 минут [4, c. 132].

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.

Чтобы увидеть, намножились ли нужные участки ДНК, после окончания ПЦР содержимое пробирок подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием — так молекулы ДНК разной длины разделяются пространственно и становятся видны невооруженным глазом.

Типы ПЦР:

1. Качественная ПЦР

2. ПЦР с обратной транскрипцией

3. ПЦР (и ОТ-ПЦР) в реальном времени

4. Иммуно-ПЦР в реальном времени [4, c. 28].