2.1 Секвенирование нуклеиновых кислот

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности.

В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру [9, с. 36].

Методы секвенирования нуклеиновых кислот:

1. Метод Максама и Гилберта (химический).

Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений.

Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках, после этого с помощью блоттинга переводят содержимое электрофорезного геля на нитроцеллюлозу, закрепляют и затем проводят радиоавтографию. Те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание можно определить его положение.

Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК.

2. Метод Сэнгера («классический», ферментативный).

Метод секвенирования НК путем "обрыва цепи" основан на синтезе новой ДНК-цепи на анализируемой ДНК-матрице с участием ДНК- полимеразы в присутствии праймера и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и на случайном обрыве синтезируемой цепи при встраивании одного из меченных разными флуоресцентными красителями дидезоксинуклеотидов.

Метод Сэнгера используется для:

•секвенирования отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов;

•идентификации вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных);

•валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS);

•микросателлитного анализа;

•анализа делеций и инсерций (малых и протяженных) [8, с. 53].

Актуальность этого типа определения последовательности НК сохраняется из-за высокой точности (достоверности) полученных данных и невысокой стоимости работ при анализе небольшого количества ДНК-фрагментов.

3. Методы NGS (методы нового поколения). NGS осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов.

Эти методы используют для глубокого (многократного) прочтения генетического материала, которое необходимо, например, для ресеквенирования (повторное определение последовательности ДНК организма с уже расшифрованным геномом) и сборки новых геномов (de novo), транскриптомных и эпигеномных исследований.

Такой метод значительно производительнее, он позволет одновременно считывать миллионы коротких фрагментов. Это привело к возможности определения последовательности сразу десятков геномов (в зависимости от их размера) за один запуск прибора.

Размер одного прочитанного фрагмента при таком методе варьирует от 25 до 500 нуклеотидов.

4. Пиросеквенирование заключается в последовательном синтезе ДНК на ДНК-фрагментах изучаемого организма в специальных пиколитровых «реакторах». В ходе синтеза дочерней цепочки ДНК детектируют пирофосфаты, высвобождающиеся при включении нуклеотида в синтезируемую на матрице комплементарную цепь.

Быстрота и дешевизна методов NGS, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря NGS появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты. Применение NGS не ограничивается определением геномных последовательностей, а распространяется до изучения транскриптона, структуры хроматина и других областей молекулярной и клеточной биологии.

Большинство экспериментов по секвенированию РНК проводятся на оборудовании, которое предназначено для секвенирования молекул ДНК. В связи с этим необходимым шагом для секвенирования РНК является создание библиотеки кДНК (комплементарной ДНК), полученной из исследуемой РНК.

Перед секвенированием кДНК (комплементарной ДНК) ее необходимо амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции. Непосредственно перед проведением ПЦР можно ввести молекулярные маркеры. Эта процедура особенно актуальна, если РНК в образце изначально немного, как, например, в случае секвенирования РНК одной клетки [8, с. 203].