книги из ГПНТБ / Ошкая В.П. Нингидриновые реакции

нокислот после стадии декарбоксилирования не отличается от такового у нингидриновой реакции аминов. Исключительное зна­ чение возможности отщепления водородного атома от а-углерод- ного атома по отношению к аминогруппе или карбоксильной группе или отщепления протона было показано на модельных соединениях [185].

а-Метилаланин (121), у которого аминогруппа связана с тре­ тичным углеродом, дает положительную нингидриновую реак­ цию, так как возможно отщепление а-карбоксильной группы. Если карбоксильная группа связана амидной связью и поэтому неспособна декарбоксилироваться, как это имеет место в дипептиде (122), нингидриновая реакция не удается. По этой же при­ чине нингидриновая реакция не протекает с р-метил-(3-аминомас- ляной кислотой (123) с амином, имеющим третичный радикал (124) [185]. Ряд примеров аминокислот, которые не дают поло­ жительную нингидриновую реакцию, приведены в работе [186]. Аминокислоты, в которых аминогруппа удалена от карбоксиль­ ной группы в J3-, у-, б- и других положениях, реагируют с нингидрином [187, 188]. Разумеется, нингидриновая реакция с та­ кими аминокислотами протекает по вышерассмотренному меха­ низму нингидриновой реакции аминов.

Серосодержащая алифатическая аминокислота цистеин в обычных условиях выполнения нингидриновой реакции дает только около пятой части того количества пурпура Руэмана, ко­ торое должно было образоваться в данном случае при пересчете на аминогруппу [116]. Если сульфгидрильную группу окислять до сульфогруппы или алкилировать ее, то полученные цистеиновая и сс-амино-р-алкилмеркаптопропионовые кислоты дают нормаль­ ный «цветовой выход» нингидриновой реакции [185]. Уже ранее было установлено, что в водных растворах цистеин и нингидрин при комнатной температуре с хорошими выходами конденсиру­ ются в производное тиазина (126) [189]. Цистеин, так же как и

62 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

другие меркаптоаминокислоты, имеющие две нуклеофильные группы в молекуле, с нингидрином реагирует по двум схемам — по амино- и сульфгидрильной группам. Так как в реакциях нуклеофильного замещения сульфгидрильная группа реагирует при­ мерно в 300 раз быстрее аминогруппы, то реакция протекает главным образом в сторону образования производного тиазина (126) [185].

Аминогруппа промежуточного продукта (125), образовавше­ гося по схеме замещения с сульфгидрильной группой, взаимо­ действует со вторым карбонилом нингидрина, и выделяется про­ изводное тиазинкарбоновой кислоты (126) [185]. Промежуточный гемимеркапталь индантриона-1,2,3 (125) в отличие от 2-амино- производного 2-оксииндандиона-1,3 неспособен отщеплять воду и образовывать основание Шиффа, вследствие чего карбоксиль­ ная группа в конечном продукте сохраняется. Структура побоч­ ного продукта нингидриновой реакции с цистеином как произ­ водного тиазина не вызывает сомнений; она подтверждена ЯМРспектрами [185] и приготовлением производных [189].

Интересно отметить, что ленициллинамин, или р\р-диметилцис- теин, сульфгидрильная группа которого в значительной мере экранирована метальными группами, реагирует только в 7 раз быстрее соответствующей аминогруппы, и поэтому выход пур­ пура Руэмана с пенициллинамином выше, чем с цистеином в таких же условиях проведения нингидриновой реакции [185].

Нингидрин очень активно реагирует и с другими соединени­ ями, содержащими меркаптогруппы [190, 191], что используется для модификации белков нингидрином [192, 193].

64 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

образованием этих побочных продуктов можно объяснить раз­ личные оттенки реакционных растворов нингидриновых реакций различных аминокислот.

Производные Ы,№-бис-[индандион-1,3-ил- (2)}фенилэтиленамина (128) были изолированы при проведении реакции нингидрина в спиртовой среде с я-метокси-, я-хлор- и я-фторфениламинами [199].

оо

Эти продукты представляют собой высокоплавкие темно-зеленые кристаллы.

Судя по обстоятельной работе [198], побочные продукты, со­ держащие аминокислотные остатки (128), образуются в реак­ циях нингидрина с рядом аминокислот. Их образование ускоря­ ется при избытке аминокислоты, а замедляется в -водной среде и при рН выше 6,3. Так как в состав нингидриновых реагентов аминокислот часто входят органические растворители — ацетон, метилцеллосольв, спирты, пиридин и др., то с образованием по­ бочных продуктов вышеуказанного типа приходится, очевидно, часто встречаться.

Однако совсем недавно появилась работа [200], в которой спектроскопические данные относительно соединения 128, опуб­ ликованные ранее [197, 199], используются для доказательства индено-оксазиновой структуры (129) побочного продукта нингидриновой реакции фенилаланина, образующегося в спиртовой среде.

Доказательства авторов [200] в пользу оксазиновой структуры (129) побочного продукта убедительны, и, таким образом, N , N - б«с-[индандион-1,3-ил-(2)]стириламин может рассматриваться только как промежуточный продукт этой побочной реакции.

66ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

ипродукт реакции выпадает в осадок [154]. Подобным образом реагирует также а-пиперидинкарбоновая, или а-пипеколиновая, кислота [154]. Красная окраска в реакции аминокислот с нингид­ рином появляется также при нагревании их в уксусной кислоте. Продукт реакции окрашивается в красный цвет и в том случае, если после хроматографического разделения на бумаге пролин и оксипролин идентифицировать с нингидриновым реагентом и хроматограадмы высушивать при повышенной температуре. При постепенном повышении температуры высушивания хромато-

грамм можно наблюдать превращение желтого пятна в крас­ ное [155].

В работе [154] было установлено, что образование окрашенных продуктов реакции нингидрина с иминокислотами сопровожда­ ется декарбоксилированием иминокислот. В водной среде иминокислоты реагировали с двумя молекулами нингидрина, продук­ там реакции приписывалась одна из двух таутомерных структур (131 или 132) [154].

Если реакцию нингидрина с пролином и оксипролином прово­ дить в спиртовом растворе, то декарбоксилирование имино­ кислот происходит уже при комнатной температуре: с 82%-ным выходом образуются желтые кристаллы, содержащие один оста­ ток нингидрина и имеющие, по мнению авторов [154], структуру

133 или 134.

Предполагаемое расщепление — N = C < ^ -связи благодаря структурным особенностям енолятбетаина не происходит, по­

этому пурпур Руэмана не образуется.

Если желтый продукт реакции (136) нагревать с избытком нингидрина, то легко протекает альдольно-крото«овая конденса­ ция по метиленовой группе пирролиния и образуется красный продукт реакции (137), имеющий конъюгированную систему двойных связей. Методом Я М Р получены данные, подтверждаю­ щие правильность рассматриваемых структур желтого и крас­ ного продуктов [204].

о

1 3 '

Аналогично протекают реакции нингидрина с другими иминокислотами, имеющими иминогруппу в пятичленном цикле [205]. а-Пиперидинкарбоновая и другие шестичленные иминокислоты с нингидрином реагируют подобно вышеупомянутым кислотам, но в этом ряду первые продукты реакции, имеющие желтый цвет, малостабильны, поэтому удается выделить только продукты красного цвета [155]. Четырехчленная иминокислота — а-азети- динкарбоновая кислота — в реакции с нингидрином дает соот­ ветственно коричневый и синий продукты реакции, но в этом случае реакция, очевидно, протекает иначе [155, 206].

Высказано предположение, что реакции орнитина, лизина и оксилизина с нингидрином протекают с одновременной цикли­ зацией аминокислот [207]. В таком случае имеет место реакция нингидрина с циклическими иминокислотами.

3,4-Дегидропролин в противоположность пролину дает только желтое окрашивание при обработке его пятен на бумажных хроматограммах. В реакции 3,4-дегидропролина с нингидрином в водном растворе при рН 7 и небольшом нагревании интенсивно выделяется углекислый газ и осаждается бесцветный продукт [204]. Реакция нингидрина с 3,4-дегидропролином протекает сле­ дующим образом:

с о о н

138

М 3

После нуклеофильного присоединения 3,4-дегидропролина к нингидрину следуют отщепление углекислоты, перегруппировка и присоединение второй молекулы нингидрина к пиррольному

/ /С=С\ч ^-связи в цикле аминокомпонента.

При рассмотрении механизма нингидриновой реакции было отмечено, что эфиры и-аминокарбоновых кислот не дают харак­ терную нингидриновую реакцию. Более подробное изучение этого вопроса на примерах метилового, этилового, пропилового, изопропилового и н-бутилового эфиров и глицина позволило

70 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

обнаружить интересные факты. Оказалось, что «-бутиловый эфир глицина в водно-бутанольном растворе дает пурпур Руэмана быстрее, чем неэтерифициро-ванкый глицин. Авторы [208] объ­ ясняют это гидролизом «-бутилового эфира и образованием неионизированной аминокислоты со свободной карбоксильной группой, которая необходима для распада кетимина (144). Кетимин с неионизированной карбоксильной группой (144) рас­ падается быстрее, чем кетимин с ионизированной карбоксильной группой (145).

144

Таким образом, экспериментальные условия нингидриновой ре­ акции здесь таковы, что скорость гидролиза «-бутилового эфира глицина и нуклеофильной атаки глицина на нингидрин выше скорости установления равновесия между ионизированной и не­ ионизированной по карбоксильной группе молекулами глицина.

Втаких условиях перенос электронов по промежуточной форме

(144)протекает легче, чем по форме 145, и, следовательно, ско­

рость образования пурпура Руэмана больше при использовании «-бутилового эфира глицина, чем при использовании глицина.

В литературе [209] имеются указания, что гидразиды «-амино­ кислот при нагревании с нингидрином в присутствии пиридина или аскорбиновой кислоты дают цветную реакцию с образова­ нием пурпура Руэмана. Гидразид изоникотиновой кислоты при комнатной температуре образует желтые кристаллы продукта присоединения, пригодного для микрокристаллоскопической идентификации гидразида [210].

С нингидрином реагируют амиды кислот, несмотря на низкую нуклеофильность аминогрупп. Так, Ван Слайком с соавторами было замечено, что гидролиз мочевины при нагревании ее сла­ бокислых водных растворов заметно замедляется в присутствии нингидрина [211]. Влияние нингидрина на выделение углекис­ лого газа при гидролизе мочевины исследовалось количественно [212]. Выделением стабильного продукта присоединения моче­ вины к нингидрину удалось объяснить задержку гидролиза моче­ вины в присутствии нингидрина. Структура продукта присоеди­ нения, кристаллизующегося с одной молекулой воды, изучалась спектроскопически [56, 57]; продукту было приписано строение уреида нингидрина, вернее индандиона-1,3 (146). '