Генно-инженерная система дрожжей Saccharomyces.
Пекарские дрожжи S. cerevisiae являются наиболее изученными в биохимическом и генетическом плане эукариотическими организмами. Это обусловлено тем, что для них применимо большинство методов, разработанных для манипуляций с бактериальными культурами.
Дрожжи можно выращивать на простых питательных средах, в том числе агаризованных, в обычной бактериологической посуде и с использованием стандартного бактериологического оборудования. Методология работ с культурами клеток животных и растений существенно сложнее, и при этом необходимы специальные дорогостоящие питательные среды и оборудование. Кроме простоты культивирования дрожжи характеризуются высокой скоростью размножения и наличием небольшого числа стадий в цикле развития, смена которых легко контролируется в эксперименте. Будучи типичными эукариотами, дрожжевые клетки представляют собой удобную модель для изучения молекулярных основ наследственности и изменчивости высших организмов. Большое внимание дрожжи привлекли к себе как объекты генно-инженерных экспериментов, направленных на создание высокоэффективных технологий биосинтеза различных белков высших эукариот.
У дрожжей-сахаромицетов подробно изучен клеточный цикл развития (рис. 12.1). Клетки S. cerevisiae делятся почкованием. Вегетативные клетки штаммов, выделяемых из природных образцов или используемых в производстве, как правило, диплоидны. При определенных условиях в них происходит мейоз, и диплоидная клетка превращается в аск с четырьмя гаплоидными аскоспорами, окруженными общей оболочкой. Эти структуры называют тетрадами. Оболочку аска можно разрушить механически или ферментативно и с помощью микроманипулятора при наблюдении в микроскоп разъединить аскоспоры. После прорастания каждая спора дает начало отдельному гаплоидному клону со специфическим генотипом и фенотипом. Данный подход, называемый тетрадным анализом, позволяет методически просто выяснять, локализован ли изучаемый генетический маркер на хромосоме или он входит в состав внехромосомных генетических элементов.
Рис. 12.1. Жизненный цикл Saccharomyces cerevisiae
Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы — простота и надежность ее генетического анализа. Дрожжевые штаммы могут существовать как стабильные гаплоиды, что значительно упрощает, по сравнению с большинством диплоидных эукариотических систем, получение мутантов.
Гаплоидная клетка дрожжей S. cerevisiae содержит 16 линейных хромосом, каждая из которых представлена индивидуальной молекулой ДНК, упакованной в нуклеосомы. Размер хромосом у дрожжей-сахаромицетов значительно меньше, чем у высших эукариот, и находится в интервале от 250 до 2200 тпн. Это позволяет разделить дрожжевые хромосомы методом пульс-электрофореза. Суммарное содержание ДНК в гаплоидном ядре дрожжей (около 12 млн пн) лишь в 3 раза превышает содержание ДНК в клетках бактерии Е. coli (4639 тпн).
Относительно небольшой размер генома у дрожжей объясняется низким содержанием в их ДНК повторяющихся последовательностей. Основным классом многократно повторяющихся последовательностей ДНК у S. Cerevisiae является кластер генов рибосомной РНК, локализованный на хромосоме XII. На гаплоидную клетку приходится 100-140 копий тандемно повторяющихся единиц генов рРНК. В состав каждой такой единицы длиной 9 тпн входят четыре гена, кодирующих 25S, 18S, 5,8S и 5S рРНК (рис. 12.2). Показано, что в повторяющейся единице генов рРНК присутствует область начала репликации ДНК.
Рис. 12.2. Организация повторяющейся единицы генов рРНК S. cerevisiae.
Р1, р2— промоторы, с которых инициируется транскрипция соответственно 5S рРНК и 35S РНК — предшественника трех классов рРНК; t1 и t2 — терминаторы транскрипции рибосомных оперонов; ARS — область начала репликации ДНК. Направление транскрипции показано стрелками
Генетические элементы у дрожжей обозначаются иначе, чем у бактерий:
• гены обозначают тремя латинскими буквами, входящими в название функции, контролируемой данным геном;
• генетические локусы обозначают цифрами, которые пишут непосредственно после трехбуквенного обозначения гена;
• доминантные и рецессивные варианты генов обозначают соответственно прописными или строчными буквами, например
ARG2/arg2;
• фенотипы обозначают тремя латинскими буквами (первая буква прописная, остальные строчные), причем к обозначению дикого фенотипа добавляют знак ≪+≫, мутантного фенотипа
В 1967 г. Дж. Синклэйром при электронно-микроскопическом анализе препарата общей дрожжевой ДНК выявлена кольцевая двухцепочечная ДНК с контурной длиной около 2 мкм. Дальнейшие исследования в разных лабораториях показали, что большинство (около 75 %) лабораторных штаммов S. Cerevisiae содержат этот класс внехромосомных молекул ДНК. Обнаруженная кольцевая ДНК была названа двухмикронной (2м) плазмидой, а в дальнейшем — Scpl.
Данная плазмида содержит два инвертированных повтора IR1 и IR2, которые разделены уникальными протяженными сегментами ДНК: большим — L (large) и малым — S (small). Выяснилось, что каждая клетка содержит два типа молекул Scpl, которые различаются взаимной ориентацией L- и S-сегментов (рис. 12.3). Каждый тип молекул Scpl имеет специфический набор рестрикционных участков. Так, после обработки препарата ДНК Scpl рестриктазой EcoRl образуется четыре фрагмента. Суммы размеров фрагментов 1, 4 и 2, 3 равны и соответствуют размеру плазмидной молекулы. Поэтому выявленные изоформы Scpl иногда обозначают как тип 23 и тип 14; чаще употребляют обозначения ≪форма А≫ и ≪форма В≫ соответственно. На карте ДНК плазмиды Scpl за нулевую точку принят сайт RI рестриктазы EcoRl (см. рис. 12.3), отсчет нуклеотидов ведется по часовой стрелке. IR-последовательность, ближайшая к R1 участку, обозначается IR2, а другой идентичный повтор — IR1. В обеих формах Scpl нумерация IR-сегментов остается одной и той же.
Рис. 12.3. Структура двух форм плазмиды Scpl S. cerevisiae.
Сайты расщепления рестриктазами: RI,R2 — EcoRl; Н1,Н2,НЗ— Hindlll; Al, Al— Aval; P— Pstl; Нр — Hpal; XI, XI —Xbal. Цифры внутри круга обозначают расстояние (тпн) от RI по часовой стрелке
Исходя из функционального анализа и нуклеотидной последовательности на Scpl картированы четыре гена — FLP, REPl, REP2 и RAF, белковые продукты которых участвуют в поддержании данной плазмиды (рис. 12.4). Кроме этих генов выявлены три ifMc-действующих локуса: ori, STB и FRT.
Рис. 12.4. Транскрипционная и генетическая карта плазмиды Scpl. Транскрипты обозначены стрелками снаружи круга, цифры указывают размер (пн). Заштрихованными блоками отмечены цис-действующие генетические элементы плазмиды, черными —районы IR1 и IR2
Репликация плазмиды Scpl инициируется клеточными ферментами одновременно с репликацией хромосомной ДНК и осуществляется один раз в течение S-фазы клеточного цикла. Уровень амплификации плазмиды при этом регулируется плазмидными генами. Белковый продукт гена FLP связывается с участками FRT, расположенными в инвертированных повторах, и обусловливает внутримолекулярную рекомбинацию. Это приводит к ≪переброске≫ одной из вилок двунаправленной репликации плазмиды, в результате чего возникают две вилки репликации, движущиеся в одну сторону (рис. 12.5), что приводит к мультипликации плазмиды. После акта повторной внутримолекулярной сайтспецифической рекомбинации вилки репликации вновь направляются навстречу друг другу, происходит их встреча и терминация репликации. Мультимер после дополнительной внутримолекулярной рекомбинации распадается на мономеры. По такому необычному механизму достигается амплификация плазмиды Scpl, благодаря чему она поддерживается в многокопийном состоянии.
Рис. 12.5. Модель Фючера репликационно-рекомбинационной амплификации плазмиды Scpl (на примере одноактной апмлификации): а-л — различные этапы репликации плазмиды. Тонкими стрелками отмечено направление движения вилок репликации.
IR-районы плазмиды изображены сближенными параллельными прямыми элементами. FLP-зависимая рекомбинация (в—г, е-ж) меняет взаимную ориентацию вилок репликации; з — внутримолекулярная рекомбинация мультимерной плазмиды
Практически вся совокупность генов Scpl направлена на регулирование уровня амплификации и на правильное распределение плазмидных молекул между клетками при делении. Эффективность внутримолекулярной рекомбинации зависит от концентрации белка FLP, так как каждый участок FRT (рис. 12.6) состоит из трех повторов длиной 13 пн, окружающих спейсерный участок размером 8 пн (в его состав входит ХЬсй-сшт).
Рис. 12.6. Последовательность нуклеотидов плазмиды Scpl в участке связывания (rRT) с белком FLP. Точками отмечены места контакта молекул белка FLP с ДНК, треугольниками — места гидролиза цепей в спейсерном участке. Стрелками обозначены повторяющиеся последовательности
С каждым 13-мерным повтором взаимодействует одна молекула белка FLP. В спейсере происходит расщепление нитей ДНК с образованием одноцепочечных концов и последующим воссоединением их в новой комбинации. (В промежуточном комплексе после расщепления ДНК молекулы белка FLP ковалентно связываются с образующимися после разрыва 3'-концевыми нуклеотидами.)
Важную регуляторную роль в экспрессии генов плазмиды Scpl играют продукты генов REPI и REP2. Белки REP1 и REP2, взаимодействуя друг с другом, формируют активный комплекс (рис. 12.7, а), который затем связывается в иерархическом порядке со специфичными участками и ингибирует транскрипцию генов RAF, FLP и REP1. Важной особенностью белкового комплекса REP1-REP2 является то, что С-конец белка REP1 гомологичен кариоскелетным компонентам. Таким образом, этот комплекс способен одновременно связываться с плазмидой на участке STB и с ядерной мембраной (см. рис. 12.7, б), тем самым обеспечивая распределение плазмидных молекул между делящимися клетками.
Связывание комплекса с участком STB на плазмиде Scpl подавляет транскрипцию гена RAF (от англ. REP antagonizing factor), продукт которого является антагонистом репрессии транскрипции гена FLP комплексом REP1-REP2 (см. рис. 12.7, а). Таким образом, от соотношения концентраций белков RAF и REP1-REP2 зависит уровень экспрессии гена FLP.
Рис. 12.7. Модель авторегуляции копийности плазмиды Scpl (a) и ее связывания с ядерной мембраной дрожжей-сахаромицетов (б). Цифрами (а) обозначена иерархия взаимодействия комплекса REP1-REP2
Когда концентрация комплекса REP1-REP2 достаточно высока, транскрипция гена REP1 будет репрессирована, что приведет к снижению концентрации данного комплекса, т. е. наблюдается авторегуляция экспрессии гена REPI. При очень высокой концентрации комплекса REP1-REP2, обусловленной большой копийностью Scpl, возможно его связывание около участка FRT и физическое блокирование процесса внутримолекулярной рекомбинации, что повлечет за собой репрессию амплификации плазмиды.
Плазмида Scpl является прекрасной модельной системой для изучения контроля экспрессии эукариотических генов и репликации хромосом. Зная молекулярно-биологическую организацию данной плазмиды, можно эффективно использовать ее для создания молекулярных векторов, последующего конструирования гибридных ДНК и введения их в клетки дрожжей.
Плазмидная трансформация клеток дрожжей
Генно-инженерные манипуляции на S. Cerevisiae стали реальны лишь после того, как экспериментально была доказана возможность генетической трансформации дрожжевых клеток. Клеточная стенка дрожжей препятствует проникновению экзогенной ДНК в клетку. Поэтому была разработана процедура получения протопластов клеток S. cerevisiae. Она состоит в том, что дрожжевые клетки инкубируют в осмотически стабилизирующем растворе, содержащем ферменты, которые разрушают клеточную стенку. Дрожжелитической активностью обладают ферментные препараты, выделенные из самых разных источников. К таким препаратам, например, относятся экстракт пищеварительного сока виноградной улитки и фермент глюкуронидаза из желчи животных.
Поскольку дрожжевые протопласты не способны к регенерации клеточной стенки в жидкой среде, их смешивают с расплавленной ага- ризованной средой и выливают на чашку Петри. Клетки, погруженные в агар, восстанавливают клеточную стенку и формируют в его толще колонии.
Попытки трансформировать протопласты мутантных штаммов S. cerevisiae препаратами суммарной ДНК из дрожжей дикого типа долгое время не давали положительных результатов. Преодолеть данное затруднение удалось лишь в 1978 г., когда А. Хиннен с соавторами для трансформации протопластов использовали препараты гибридных плазмид Е. coli, несущих индивидуальные фрагменты хромосомной ДНК S. cerevisiae с определенными генами. Успех был достигнут благодаря тому, что в препарате трансформирующей плазмидной ДНК относительное содержание индивидуального гена дрожжей было многократно выше, чем в тотальной ДНК клетки.
Для адсорбции экзогенной ДНК на поверхности протопластов необходимы катионы кальция, а проникновение молекул ДНК внутрь протопластов происходит во время слияния протопластов, индуцированного полиэтиленгликолем (ПЭГ-4000). Недостатком данной процедуры является то, что в результате трансформации гаплоидного штамма могут образоваться как диплоидные, так и полиплоидные протопласты (а затем и клоны клеток). Используя специальные приемы, слияние более чем двух протопластов можно свести к минимуму. Другой недостаток метода состоит в том, что колонии трансформантов располагаются в толще агара, что усложняет дальнейшие манипуляции с ними.