2. Генно-инженерные системы грам-положительных микроорганизмов родов Strptomyces, коринеформных бактерий.

Актиномицеты рода Streptomyces являются почвенными грамположительными бактериями, которые в отличие от большинства прокариотических микроорганизмов в своем жизненном цикле проходят несколько стадий дифференцировки. Типичный жизненный цикл стрептомицета на твердом субстрате начинается с прорастания споры, дающей начало полигеномному субстратному мицелию, на котором затем формируется воздушный мицелий, преобразующийся в конце цикла развития в цепочки спор. В глубинных культурах споруляция обычно не происходит. В этом случае по завершении вегетативного роста культура сохраняет биосинтетическую активность и способна продуцировать большие количества вторичных метаболитов.

Наиболее важными с практической точки зрения продуктами вторичного метаболизма стрептомицетов являются антибиотики. Так, до 70 % всех производимых промышленностью антибиотиков синтезируются именно бактериями этого рода. Стрептомицеты синтезируют антибиотики различной химической природы: аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, B-лактамы, олигопептиды и др. Индивидуальный штамм обычно продуцирует несколько антибиотиков, относящихся к разным классам.

Cтремление создать новые типы штаммов-продуцентов на основе бактерий рода Streptomyces стимулировало разработку для них генно-инженерной системы. Следует подчеркнуть, что стрептомицеты синтезируют широкий спектр внеклеточных ферментов. Поэтому по аналогии с бациллами могут быть созданы штаммы стрептомицетов, секретирующих из клеток целевые белки. Важной особенностью стрептомицетов является также то, что они не патогенны ни для человека, ни для животных. Известен лишь единственный вид (S. scabies), патогенный для растений.

Геном бактерий рода Streptomyces представлен одной молекулой кольцевой двухцепочечной ДНК размером около 104 тпн (в 2,5 раза протяженней, чем у Е. coli). Для стрептомицетов характерно очень высокое (70-73 %) содержание в ДНК GC-nap. (У бактерий рода Escherichia этот показатель составляет около 50 %, а у Bacillus — 32-62 %.) Многие штаммы стрептомицетов имеют естественную систему генетического обмена через конъюгацию, направляемую половыми факторами. Хотя механизм этого процесса пока полностью не ясен, проведенные исследования позволяют сделать заключение, что конъюгационная система Streptomyces генетически устроена намного проще, чем F-фактор Е. coli. К наиболее изученным в генетическом плане относятся штаммы S. сое-licolor А3(2) и S. lividans 66. Для них получено и охарактеризовано большое число различных мутантов.

Стрептомицеты не обладают физиологической компетентностью для генетической трансформации, но данное затруднение легко преодолевается при использовании протопластов клеток. Необходимо учитывать, что многие штаммы стрептомицетов несут гены системы рестрикции-модификации. Особенно это характерно для промышленных штаммов, отбираемых с учетом их приспособленности к культивированию в больших ферментерах. Одним из параметров такой приспособленности является устойчивость клеток к фаголизису, которая часто может обеспечиваться высоким уровнем рестриктазной активности.

Для стрептомицетов характерно явление, позволяющее методически просто обнаруживать штаммы, несущие конъюгативные плазмиды. Оказалось, что при попадании спор или регенерирующих протопластов плазмидосодержащего штамма на свежезасеянный газон бесплазмидных клеток формируются фенотипически выявляемые микроколонии — оспины. Оспины образуются в результате того, что в клетках реципиентного штамма (клетках газона), получивших в результате конъюгации плазмиду, замедляется процесс споруляции и микроколония плазмидосодержащего клона на газоне сплошного роста бесплазмидных клеток оказывается окруженной прозрачной кольцевой зоной. Данную реакцию ингибирования роста называют летальным зигозисом, и ее фенотипическое проявление обозначают Ltz+. Наличие признака Ltz+ позволило идентифицировать плазмиды у большого числа штаммов Streptomyces.

Первой изученной плазмидой стрептомицетов стала плазмида SCP2 штамма S. Coelicolor A3 (2), которую Д. Хопвуд с сотрудниками описали в 1975 г. Это половая низкокопийная плазмида размером 30 тпн. Спонтанно был выделен вариант данной плазмиды SCP2*, обеспечивающий значительно большую эффективность хромосомной рекомбинации и более интенсивное проявление клетками фенотипа Ltz+. С помощью рестрикционного анализа не удалось обнаружить различий в структуре ДНК SCP2 и SCP2*, кроме того, эти плазмиды имеют одинаковую копийность в клетках (1-5 копий на бактериальную хромосому). Физическое (рис. 11.3) и генетическое картирование SCP2* позволило сделать вывод о том, что гены, контролирующие репликацию плазмиды, перенос, хромосомную рекомбинацию и летальный зигозис, локализованы в левой половине карты, так как производные SCP2*, содержащие только наибольший Pstl- или BamHI-фрагмент, проявляют все эти свойства.

Рис. 11.3. Рестрикционные карты плазмид SCP2* и pIJ922. Для pIJ922 приведены сайты рестриктаз, пригодные для клонирования фрагментов ДНК

На основе SCP2* получен ряд векторных плазмид, содержащих разные гены устойчивости к антибиотикам, в том числе к тиострептону — tsr (см. рис. 11.3), неомицдну — aph, а также ген mel, направляющий синтез тирозиназы — фермента, превращающего тирозин в меланиновый пигмент. Последняя детерминанта обусловливает черную окраску колоний Streptomyces на среде, содержащей триптон и ионы меди. При инактивации гена mel за счет встройки чужеродных последовательностей колонии трансформантов оказываются бесцветными, что обеспечивает возможность прямого фенотипического отбора клонов, несущих гибридные плазмиды. Экспериментально показано, что векторные производные SCP2* способны трансформировать большое число разных штаммов Streptomyces.

Наряду с низкокопийными векторными плазмидами при решении ряда задач необходимо иметь высококопийные клонирующие векторы. Наибольшее число векторов такого типа создано на основе плазмиды pIJl01 (рис. 11.4) — конъюгативной половой плазмиды небольшого размера (8,9 тпн), имеющей широкий круг хозяев среди представителей рода Streptomyces и детерминирующей фенотип Ltz+. У S. Lividans число копий этой плазмиды варьирует в зависимости от штамма от 40 до 300 на бактериальную хромосому.

Рис. 11.4. Рестрикционные карты плазмиды pIJlOl и ее производных

На основе pIJlOl и ее делеционных производных in vitro сконструированы векторы, маркированные рядом детерминант лекарственной устойчивости. В качестве примера рассмотрим плазмиды рIJ350 и pIJ702 (см. рис. 11.4). рIJ350 обеспечивает устойчивость к тиострептону — антибиотику, к которому чувствительно большинство стрептомицетов. Она высококопийна, имеет широкий круг хозяев среди стрептомицетов и неконъюгативна. Для клонирования фрагментов ДНК может использоваться лишь сайт Pstl. Более удобный вектор (pIJ702) получен в лаборатории Д. Хопвуда (1983 г.) в результате встройки в рIJ350 фрагмента ДНК, содержащего ген mel S. antibioticus. Данная плазмида содержит уже два маркера, причем ген mel легко выявляется фенотипически. Более того, в составе гена теl имеются единичные участки узнавания рестриктаз Bg/II, Sstl и Sphl.

Для молекулярного клонирования в стрептомицетах также были разработаны векторы на основе умеренного актинофага фС31, обладающего широким кругом хозяев. Данный фаг по своей организации напоминает фаг Я. Геном фС31 имеет размер 41 тпн и представляет собой двухцепочечную линейную молекулу ДНК с липкими концами (cos). Фаг может лизогенизировать клетки стрептомицетов, интегрируя свой геном по участку att в бактериальную хромосому. В ДНК фС31 1 имеется непрерывная область размером 8 тпн, несущественная для литического развития фага. Построены рестрикционные карты ДНК фС31 и получены различные векторные производные.

Особый интерес векторная система фага фСЗ1 представляет для метода мутационного клонирования. Этот метод разработали К. Чейтер и К. Брутон в 1983 г., использовав в качестве вектора фаг фСЗ1, у которого в геноме делетирован участок att. Такой фаг способен интегрировать свою ДНК в бактериальную хромосому только за счет клеточной системы общей рекомбинации по областям гомологии. На основе векторного фага может быть создан банк генов любого штамма Streptomyces. Гибридными фагами инфицируют клетки и селектируют лизогенные клоны, имеющие нарушения определенного хромосомного гена. Мутация происходит в том случае, когда гибридный фаговый геном интегрируется в целевой ген за счет клонированного в его составе фрагмента хромосомной ДНК. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе генома клонируемые фрагменты. С помощью данного методического приема удается достаточно просто выделять различные гены бактерии-хозяина.

Коринеформные бактерии

В группу коринеформных бактерий объединяют разнообразные грамположительные бактерии, широко распространенные в природе. Многие непатогенные почвенные изоляты (Согупеbacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Arthrobacter sp.) используются в промышленности для производства глутаминовой кислоты, лизина и других аминокислот, нуклеотидов, а также в процессах конверсии стероидов. По стоимости микробиологической продукции производство аминокислот уступает только производству антибиотиков. Несмотря на большое практическое значение коринеформных бактерий, их генетика изучена пока слабо, хотя пути биосинтеза аминокислот и способы их регуляции исследованы основательно.

При селекции эффективных продуцентов аминокислот широко применяют аналоги этих соединений. Действуя как ретроингибиторы или корепрессоры, аналоги выключают синтез естественных метаболитов, однако не могут заменить их функционально. Поэтому на минимальной среде с антиметаболитом выживают и образуют колонии лишь те клетки, у которых нарушены механизмы негативной регуляции биосинтеза соответствующей аминокислоты и которые вследствие этого избыточно ее синтезируют. Следует отметить, что устойчивость к аналогу могут вызывать также мутации, которые просто блокируют его поступление в клетку. Поэтому обычно проводят несколько этапов селекции, используя различные аналоги или повышающиеся концентрации одного и того же аналога. В результате такой селекционной работы удается существенно увеличить продуктивность штаммов по целевому соединению. Однако при данном классическом подходе невозможно получить новые каталитические активности. Такую задачу можно успешно решить лишь методами генетической инженерии.

Принципиальное значение при разработке генно-инженерной системы любого организма имеют создание молекулярных клонирующих векторов и поиск методов генетической трансформации клеток.

На первых порах плазмидную трансформацию коринеформных бактерий осуществляли, используя протопласты клеток. В последующие годы была продемонстрирована возможность применения для этих целей метода электропорации.

Многочисленные попытки вводить разные плазмиды грамположительных и грамотрицательных бактерий не позволили выявить чужеродный репликон, который был бы способен функционировать в коринеформных бактериях, что указывает на узкую специфичность их репликационного ферментного комплекса. Создаваемые клонирующие векторы коринебактерий, как правило, являются челночными плазмидами типа Е. coli - С. glutamicum, В. subtilis - С. glutamicum, E. coli - В. lactofermentum и др. Один из первых подобных векторов сконструировали М. Ёшихама с соавторами (1985 г.) на основе клонирующего вектора В. subtilis pBDIO и небольшой криптической плазмиды С. Glutamicum pSRl (рис. 11.6). Аналогично получены идругие векторные плазмиды.

Рис. 11.6. Схема конструирования челночной векторной плазмиды pHY416

Изучение экспрессии генов антибиотикоустойчивости челночных плазмид в первых же работах показало, что в клетках С. glutamicum эффективно экспрессируются гены грамотрицательной бактерии Е. coli. Следовательно, коринебактерии по организации генов существенно отличаются от бактерий рода Bacillus, так как в последних большинство генов Е. coli не экспрессируются. Челночные плазмиды типа Е. coli - С. Glutamicum оказались очень удобными для извлечения индивидуальных генов С. glutamicum. С этой целью создают клонотеку гибридных плазмид, несущих фрагменты хромосомной ДНК коринебактерий, и данные плазмиды используют для комплементации ауксотрофных мутаций в Е. coli.

Селектированные таким образом гибридные плазмиды затем можно вводить в бактерию-донор и изучать экспрессию клонированного гена в гомологичном окружении. Повышенная доза гена обычно приводит к суперпродукции соответствующего фермента.

Другой бактерией, используемой для промышленного производства аминокислот, является Brevibacterium lactofermentum, продуцирующая глутаминовую кислоту. Для нее, как и для С. glutamicum, были созданы различные челночные плазмиды, и в их составе клонированы гены ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот. За счет эффекта дозы клонированных генов удалось повысить продуктивность некоторых промышленных штаммов.