Вариант 3.

Компетентные клетки составляют не более 5–10% всей популяции бактерий. Они отличаются от некомпетентных клеток по составу клеточной стенки, имеют сниженный поверхностный заряд и повышенную чувствительность к осмотическому шоку. Процесс формирования компетентного состояния у В. Subtilis контролируют не менее семи генов. Белки, обеспечивающие компетентность В. subtilis, участвуют в процессах связывания (адсорбции), проникновения и рекомбинации (интеграции) донорной ДНК. Вскоре после адсорбции в молекуле ДНК происходят двухцепочечные разрывы и она распадается на фрагменты размером около 14 тпн. После этого одна цепь фрагмента ДНК гидролизуется специфичной нуклеазой, а другая проникает в клетку, частично разрушаясь с концов в результате нуклеазной атаки. Геном представлен кольцевой двуцепочечной молекулой ДНК размером 4214814 п.н. и содержит 5279 генов, из которых 5163 кодируют белки, процент Г+Ц пар составляет 43,51 %, геном содержит по крайней мере два ori сайта.

Создаваемые клонирующие векторы коринебактерий, как правило, являются челночными плазмидами типа Е. coli – С. glutamicum, В. subtilis – С. glutamicum, E. coli – В. lactofermentum и др. Один из первых подобных векторов – pSRl. Аналогично получены идругие векторные плазмиды. Изучение экспрессии генов антибиотикоустойчивости челночных плазмид в первых же работах показало, что в клетках С. Glutamicum эффективно экспрессируются гены грамотрицательной бактерии Е. coli. Челночные плазмиды типа Е. coli – С. Glutamicum оказались очень удобными для извлечения индивидуальных генов С. glutamicum. С этой целью создают клонотеку гибридных плазмид, несущих фрагменты хромосомной ДНК коринебактерий, и данные плазмиды используют для комплементации ауксотрофных мутаций в Е. coli. Селектированные таким образом гибридные плазмиды затем можно вводить в бактерию-донор и изучать экспрессию клонированного гена в гомологичном окружении. Повышенная доза гена обычно приводит к суперпродукции соответствующего фермента. Другой бактерией, используемой для промышленного производства аминокислот, является Brevibacterium lactofermentum, продуцирующая глутаминовую кислоту. Для нее, как и для С. glutamicum, были созданы различные челночные плазмиды, и в их составе клонированы гены ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот. За счет эффекта дозы клонированных генов удалось повысить продуктивность некоторых промышленных штаммов.

Вариант 4.

Геном представлен кольцевой двуцепочечной молекулой ДНК размером 2488635 п.н. и содержит 2389 гена, из которых 2272 кодируют белки, процент пар Г+Ц составляет 87 %. У многих штаммов обнаружены плазмиды, плазмида pNG2, представленная кольцевой двуцепочечной молекулой ДНК размером 15100 п.н., содержащая 16 генов, все из которых являются белок-кодирующими, плазмида ответственна за резистентность к эритромицину, также известна кольцевая плазмида pNGA2 размером 4191 п.н. и кодирующая всего три гена.

Существует несколько моделей, описывающих процесс трансформации клеток В. Subtilis плазмидами. При использовании мономерных форм образование полноценной плазмиды если и происходит, то крайне редко, так как плазмидная ДНК, проникая в компетентную клетку, расщепляется в произвольной точке, а образующаяся одноцепочечная молекула гидролизуется с концов нуклеазами. Трансформация клеток бацилл мономерными плазмидами возможна также в том случае, если плазмида содержит протяженные повторяющиеся последовательности. Если повторы в плазмиде прямые, трансформация клеток ее мономерной формой происходит примерно по тому же механизму, что и трансформация мультимерными молекулами ДНК. Трансформация такими плазмидами сопровождается их распадом по повторам. Плазмида рВС16 из В. cereus способна реплицироваться и детерминировать устойчивость к тетрациклину в клетках В. subtilis. После гидролиза рВС 16 рестриктазой EcoRl и обработки ДНК-лигазой получена плазмида рВС16-1, реплицирующаяся в клетках В. Subtilis и сохранившая ген tet. Далее рВС16-1 была рекомбинирована in vitro no -EcoRI-участку с критической плазмидой В. subtilis pBS I. Однако, в В. subtilis гибридная плазмида, состоящая из двух репликонов, оказалась нестабильной и диссоциировала на pBS161 и pBS162. Плазмиду pBS161 гидролизовали рестриктазой Hindlll и фрагменты циклизовали с помощью ДНК-лигазы. После трансформации клеток B. Subtilis в устойчивых к тетрациклину клонах выявили новую плазмиду pBS 161-1, которая представляла собой циклизованный Hindlll-A-фрагмент pBS161. Полученная плазмида имеет единичные участки гидролиза рестриктазами EcoRl, Hindlll, Pstl, встройки по которым не повреждают репликатор и ген tet. Это позволяет применять ее в качестве клонирующего вектора. Недостаток pBS161-l – сложность отбора создаваемых на ее основе гибридных плазмид.