Вариант 2.

Важной особенностью стрептомицетов является также то, что они не патогенны ни для человека, ни для животных. Известен лишь единственный вид (S. scabies), патогенный для растений. Геном бактерий рода Streptomyces представлен одной молекулой кольцевой двухцепочечной ДНК размером около 104 тпн (в 2,5 раза протяженней, чем у Е. coli). Для стрептомицетов характерно очень высокое (70–73%) содержание в ДНК GC-nap. (У бактерий рода Escherichia этот показатель составляет около 50%, а у Bacillus — 32–62%.) Многие штаммы стрептомицетов имеют естественную систему генетического обмена через конъюгацию, направляемую половыми факторами. Конъюгационная система Streptomyces генетически устроена намного проще, чем F-фактор Е. coli. Стрептомицеты не обладают физиологической компетентностью для генетической трансформации, но данное затруднение легко преодолевается при использовании протопластов клеток. Штаммы стрептомицетов несут гены системы рестрикции-модификации. Одним из параметров такой приспособленности является устойчивость клеток к фаголизису, которая часто может обеспечиваться высоким уровнем рестриктазной активности. Для стрептомицетов характерно явление, позволяющее методически просто обнаруживать штаммы, несущие конъюгативные плазмиды. Оказалось, что при попадании спор или регенерирующих протопластов плазмидосодержащего штамма на свежезасеянный газон бесплазмидных клеток формируются фенотипически выявляемые микроколонии — оспины. Оспины образуются в результате того, что в клетках реципиентного штамма (клетках газона), получивших в результате конъюгации плазмиду, замедляется процесс споруляции и микроколония плазмидосодержащего клона на газоне сплошного роста бесплазмидных клеток оказывается окруженной прозрачной кольцевой зоной. Данную реакцию ингибирования роста называют летальным зигозисом, и ее фенотипическое проявление обозначают Ltz+. Наличие признака Ltz+ позволило идентифицировать плазмиды у большого числа штаммов Streptomyces.

На базе вектора YEp сконструирован вектор pBR45, содержащий маркеры LEU2 и URA3. В ген URA3 внедрили ген lacZ без семи начальных кодонов. Гибридный белок проявлял βгалактозидазную активность при синтезе белка в обоих типах клеток. Для секреции дрожжевыми векторами чужеродных белков, не имеющих собственной сигнальной последовательности, конструируют специальные векторы, которые кодируют такие последовательности. Так, был использован вектор YEpsec1, который содержит синтетический олигонуклеотид SS, кордирующий сигнальную последовательность из 18 аминокислот секретируемого токсина дрожжей. Наиболее распространенные векторы дрожжей являются производными известной плазмиды pBR322 и содержат ориджин репликации (ori), обеспечивающий высокую копийность плазмиды в клетках кишечной палочки, и селективные маркеры устойчивости к антибиотикам – ген bla, определяющий устойчивость к ампициллину, и иногда ген tet – ген резистентности к тетрациклину. Интегративные векторы YIp неспособны реплицироваться автономно, но с низкой частотой интегрируются в геном посредством гомологичной рекомбинации. Для векторов YIp обычно характерна однокопийная интеграция. С низкой частотой, однако, может происходить множественная интеграция, которая позволяет конструировать стабильные штаммы со сверхэкспрессией специфических генов. Плазмиды имеющие два дрожжевых сегмента, например, YFG1 и URA3. Штаммы, сконструированные с использованием плазмид YIp, нужно проверять с помощью ПЦР или другими методами для подтверждения сайта интеграции. Эписомные плазмидные векторы YEp могут автономно реплицироваться в клетках дрожжей благодаря присутствию сегмента 2 мкм плазмиды, в которой присутствуют последовательность ori и ген REP3. Плазмиды YEp относительно нестабильны. Центромерные плазмидные векторы YCp способны автономно реплицироваться и содержат центромерные последовательности CEN и автономно реплицирующиеся последовательности ARS. Копийность этих плазмид низка, обычно составляет от 1 до 3; во всяких рассуждениях плазмиды YCp чаще всего вообще рассматриваются как однокопийные.