Virusologiya

Вирусология

Законспектировать теоретический материал лабораторной работы в тетради, рисунок зарисовать.

Контрольные вопросы:

1.Какие методы заражения куриных эмбрионов вам известны?

2.Опишите метод заражения в аллантоисную полость?

3.Опишите метод заражения на хорионаллантоисную оболочку?

4.Опишите метод заражения в желточный мешок?

5.Опишите метод заражения в амниотическую полость?

6.Опишите метод заражения в тело зародыша?

7.Опишите метод заражения в кровеносные сосуды ХАО?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5 ВСКРЫТИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ

ВИРУССОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА

Цель: рассмотреть способы вскрытия куриных эмбрионов и получения вируссодержащего материала.

Признаки размножения вируса в курином эмбрионе

Выделят несколько показателей, свидетельствующих о размножении вирусов куриных эмбрионах:

1.Гибель эмбриона.

2.Патолого-анатомические изменения эмбриона. Так, например, при заражении эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими ХАО выглядит отечной, имеет кровоизлияния, узелки или оспины. При заражении инфекционным бронхитом кур зародыш проявляет феномен карликовости, шея − перекручена, тело – мумифицировано. При размножении

взародыше гепатита вируса: кожа гиперемирована, с кровоизлияниями, а печень − набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета. Некоторые вирусы (например, штамм В1 вируса ньюкаслской болезни), размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь с помощью реакции гемаглютинации (РГА). Явление гемагглютинации представляет собой соединение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии ге-магглютинирующего вируса. Образованием таких мостиков между многими эритроцитами и объясняется склеивание эритроцитов в хлопья. Образование хлопьев, видимых не-

Вирусология

вооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмытых эритроцитов на плоской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроцитов и вируса в пробирке хлопья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называемого зонтика.

Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала

При вскрытиях куриных эмбрионов необходимо учитывать, где содержится вируссодержащий материал. Наиболее удобно выделение вируса из аллантоисной жидкости, поскольку она представляет собой готовую суспензию вируса. Скорлупу перед вскрытием обрабатывают йодированным спиртом. Вскрытие осуществляют в стерильных условиях. Скорлупу срезают над воздушной камерой, удерживая яйцо под определенным углом. ХАО осматривают, приподнимая пинцетом, и устанавливают патологоанатомических изменений.

Для осмотра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а хорионаллантоисную оболочку отслаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в стерильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмотрена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.

Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша (рисунок 1). Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью. Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удаления аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом зародыша под его шеей (рисунок 2).

Вирусология

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе, а тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рисунок 3). Вируссодержащий материал хранят при температуре от минус 25°С.

Рисунок 3. – Извлечение тела зародыша

Ход работы

Ознакомиться со способами вскрытия куриных эмбрионов и получения вируссодержащего материала.

Законспектировать теоретический материал лабораторной работы в тетради, рисунки зарисовать.

Контрольные вопросы:

1.Какие признаки указывают на размножение вируса в курином эмбрионе?

2.Как осуществляется вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала?

Вирусология

Лабораторная работа №6 КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В ВИРУСОЛОГИИ И МЕТОДЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Цель: рассмотреть способы культивирования вирусов в культуры клеток.

Культура клеток ‒ это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся более 24 часов в условиях in vitro. Внедрение в вирусологическую практику культур клеток позволило познать сущность вирусов, установить закономерности взаимодействия вирусов с клеткой, понять этиологию вирусных болезней, а также способствовало созданию высокоэффективных противовирусных препаратов для их профилактики.

Теоретические и практические основы культивирования клеток in vitro были заложены в XIX веке. Так, например, английский физиолог Сидней Рингер разработал пропись солевых растворов, в которых удавалось сохранять бьющееся сердце лягушки, а Вильгельму Ру удалось длительно сохранять в солевом растворе нервные клетки куриного эмбриона. В 1907−1910 гг. Р. Харрисон опубликовал работу, в которой подробно изложил методологию получения культур клеток. Необходимо отметить, что методика культивирования клеток наиболее быстрое развитие получила с открытием антибиотиков.

Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека, или животного (взрослого или эмбриона). Однако наиболее лучшим материалом являются эмбриональные органы, поскольку они обладают более высокой потенцией роста. В основе получения культуры клеток лежит обработка кусочков тканей ферментами, вызывающими распад межклеточного пространства и высвобождение клеток. При этом в изолированном контейнере (чаще пробирках или матрасах) размножающиеся клетки формируют клеточный монослой, и такой тип культуры клеток называют однослойной культурой клеток. Отдельные типы клеток возможно культивировать во взвешенном состоянии − такой тип культуры клеток называют суспензионной культурой.

Различают две основные разновидности культур клеток (в зависимости от морфологии): эпителиоподобные и фибробластоподобные (рассмотреть рисунок 1 и описать клетки).

Вирусология

Рисунок 1. – Разновидности клеточных культур: эпителиоподобные (слева) и фибробластоподобные (справа)

В вирусологической практике применяют следующие типы культуры клеток:

1.Первичные культуры клеток – это культуры клетки, полу-

ченные непосредственно из живого организма. Их готовят перед применением. Получить первичную культуру возможно из различных органов и тканей человека и животных, однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Приготовление: клетки измельчают на кусочки и обрабатывают трипсином. Полученную смесь клеток разливают по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной средой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Скорость формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду заменяют по мере ее загрязнения продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность от 7 до 21 дня.

2.Перевиваемые культуры клеток − это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды.

Перевиваемые клетки можно получить из здоровых и опухолевых тканей как животных, так и человека. Наиболее широко используемой перевиваемой культуры клеток человеческого происхождения является культура HeLa, полученная в феврале 1951 года от больной раком шейки матки женщины по имени Henrietta Lacks, впоследствии умершей 8 месяцев спустя. Данная культура клеток до сих пор широко используется для изучения вирусов животных. Примеры других перевиваемых культур клеток: ВНК−21 (почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); Нер−2 (карцинома гортани человека); Hep −3 (лимфоидная карцинома

Вирусология

человека) и др.

3. Диплоидные культуры клеток представляют собой линии, в

которых 75% клеток имеют кариотип, идентичный таковым клеток, из которой она выведена. Используют для приготовления биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др. Эти клетки весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусоносительства и т.д. Работа с культурой клеток требует строгого соблюдения параметров культивирования, абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды и соответствующих питательных сред.

Культивирование клеток

Параметры культивирования клеток: температура (37 ºС), со-

держание газов, поддерживающих метаболизм клеток (5%) и показатель рН культуры (7.2−7.4.). Обычно создание и поддержание необходимых условий культивирования обеспечивается в специальных инкубаторах.

Подготовка посуды. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. В современной вирусологической практике используют посуду из стекла или из пластика. Посуда должна быть чистой, обезжиренной, не обладать токсическим действием, стерильной.

Солевые растворы. Для приготовления растворов необходимы высокоочищенные препараты, так как следы ряда примесей (свинец, ртуть и другие тяжелые металлы) токсичны для клеток. Солевые растворы готовят на бидистиллированной воде. Лучшими из них являются растворы Хенкса и Эрла.

Раствор Хенкса: На 1 л бидистиллированной воды берут NaCl − 8,0 г, КСl − 4,0 г, MgSО4 · 7Н2О − 2,0 г, СаСl2 − 1,4 г, КН2РО4 − 0,6 г,

глюкозы − 10 г, 0,2%−го фенолрота − 4,0 мл, Na2HPО4 − 0,6 г.

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды добавляют NaCl − 6,8 г, КСl − 0,4 г, СаСl2 − 0,2 г, MgSО4 − 0,1 г, NaH2PО4 − 0,125 г, NaHCО3 − 2,2 г, глюкозы − 1,0 г.

Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%−ный раствор бикарбоната натрия NaHCО3 и 3%−ный раствор уксусной кислоты СН3СООН. Эти растворы готовят на бидистиллированной воде, стерилизуют кипячением и хранят в холодильнике при 4°С не более месяца.

Ферменты. Используют следующие протеолитические ферменты: трипсин, панкреатин, папаин и др. Наиболее часто используют

Вирусология

трипсин в виде 0,25%−ного раствора на фосфатном буфере. При пересеве перевиваемых клеток с целью отделения их от стекла используют версен (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).

Питательные среды. В питательной среде должен присутствовать необходимый набор из неорганических ионов, аминокислот и витаминов. Считается, что наиболее существенным из всех компонентов является наличие глюкозы и L-глютамина. Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды − это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.).

Полусинтетические питательные среды представляют собой естественные среды, подверженные первичной ферментативной обработке. К таким средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Искусственные питательные среды представляют собой среды, содержащие все необходимые компоненты. Так, например, среда 199 содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др.

В зависимости от назначения среды подразделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в первой фазе культивирования клеток, когда необходимо стимулировать клетки на максимально ускоренный рост и размножение. Они богаты питательными веществами, что способствует активному размножению клеток – обычно это достигается добавлением к среде нормальной сыворотки крови в количестве до 10%. В большинстве случаях с этой целью используют сыворотки крови теленка или его плода, так как она в большой степени обеспечивает размножение клеток и практически не ингибирует вирус. Сыворотку получают из крови здоровых животных, полученных из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. После получения сыворотка крови инактивируется при 56ºС в течение 30 минут и подвергается стерилизации методом фильтрации. Хранят сыворотку крови при температуре 2‒4ºС на срок до 6 месяцев. Перед использованием среды с добавленной в нее сывороткой крови необходимо предварительно провести ее тестирование для исключения ингибиторности в отношении стандартного вируса.

Вирусология

Поддерживающие среды применяют во второй фазе культивирования клеток после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток. В поддерживающих средах обычно снижают содержание сыворотки до 2% или полностью ее исключают. Также в состав питательных сред могут входить антибиотики для уничтожения микрофлоры: пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (50 ЕД/мл), тетрациклин (100 ЕД/мл).

Ход работы

Ознакомиться со способами культивирования вирусов в культуры клеток.

Законспектировать теоретический материал лабораторной работы в тетради.

Контрольные вопросы:

1.Что такое культуры клеток. Какие разновидности культур клеток вы знаете? Чем они отличаются?

2.Перечислить и описать типы клеточных структур?

3.Культивирование клеток и приготовление питательных сред?

Лабораторная работа №7 ТИТР БАКТЕРИОФАГА, СПОСОБЫ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

ПОЛУЧЕНИЕ ФАГОВЫХ ЛИЗАТОВ

Цель: рассмотреть методы титрования бактериофагов и получения фаговых лизатов.

Титр бактериофага − это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в работе с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, который был предложен А. Грациа в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получаемых результатов и с успехом используется также для выделения бактериофагов.

Сущность метода титр бактериофага состоит в следующем: суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5%-го питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя в классическом методе Грациа использовался водный («голодный») 0,6%-й агар. В настоящее время для этих целей чаще всего применяют 0,7%-й питательный агар. При инкубации в течение 6−18 ч бактерии

Вирусология

размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-го питательного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концентрация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бактериальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в результате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает находящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование негативной колонии для фагов Т- группы вызвано только одной частицей бактериофага, и, следовательно, число негативных колоний служит количественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.

Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логарифмической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем получение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц и бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой системы «фаг − бактерия» подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50−100 негативных колоний.

Для титрования бактериофага может быть использован также однослойный метод, состоящий в том, что на поверхность чашки с питательным агаром вносят суспензии бактерий и бактериофага, после чего смесь распределяют стеклянным шпателем. Однако этот метод уступает в точности методу агаровых слоев и поэтому не нашел широкого применения.

Техника титрования и культивирования бактериофагов. Для определения титра бактериофага последовательно разводят исходную фаговую суспензию в буферном растворе либо в бульоне (шаг разведения 10-1). Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из каждого разведения суспензии делают «высев» фага на газон чувствительных бактерий Е. coli В. Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48−50°С «мягкого агара», после чего в каждую пробирку добавляют 0,1 мл культуры чувствительного микроорганизма (Е. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое перемешивают, вращая пробирку между ладонями и избегая образования пузырей. Затем быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5%-й) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же разведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат с температурой 37°С, оптимальной для развития чувствительных бактерий. Учет ре-

Вирусология

зультатов производят через 18−20 ч инкубирования. Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсчету колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле (1):

(1)

где N − количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала; n − среднее количество негативных колоний на чашку;

D − номер разведения; V − объем высеваемой пробы, мл

В том случае, когда необходимо определить множественность инфекции, параллельно проводят определение титра жизнеспособных клеток бактерий Е. coli В в 1 мл питательного бульона. Для этого делают разведение исходной суспензии бактериальных клеток до 10−6 и высевают ее (0,1 мл) параллельно на 2 чашки. После инкубирования при температуре 37 °С в течение 24 ч подсчитывают количество образовавшихся колоний на чашке Петри и определяют титр клеток.

Фаголизат – это суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для получения фаголизата можно использовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды.

Фаголизат получают путем размножения фага на клетках чувствительной культуры. В бульонную культуру бактерий E.coli В вносят 1−2 мл фаговой суспензии либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне. После соответствующего периода инкубирования и просветления суспензии фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним из следующих способов: фильтрованием через мембранный фильтр, центрифугированием для осаждения клеток (6 тыс. об/мин, 10 мин), обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение одной минуты, инкубированием в течение одного часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде.

18−24-часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (Е. coli В) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10 и культивируют с аэрированием при оптимальных условиях (37 °С) до логарифмической фазы роста в течение 2,5−3 ч (до плотности 2−108 клеток/мл). После этого в бактериальную культуру добавляют суспензию фага с таким расчетом, что-