Virusologiya

Вирусология

но сохраняет способность стимулировать у животных специфические факторы иммунитета.

Для инактивации вирусов используют физические и химические методы. Из физических методов наиболее распространенными являются γ-лучи, УФ-лучи, воздействие температуры, реже ультразвука, фотодинамическое воздействие некоторых красителей (метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин и др.). Наиболее уязвимыми мишенями для γ-лучей являются пуриновые и пиримидиновые основания. Белковая оболочка под воздействием радиации повреждается незначительно. Этот метод дает возможность одновременно надежно инактивировать и стерилизовать готовый препарат.

Впрактике создания инактивированных вакцин наиболее широкое применение получили химические инактиваторы, такие как формальдегид (присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот), β-пропиолактон, этиленамины, гидроксиламин (инактивирующее действие определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины рН) и др. Реагенты, которые используют для инактивации вирусов, являются мутагенами, поэтому инактиватор должен либо подвергнуться самораспаду (β-пропиолактон, гидроксиламин), либо переведен в неактивную форму (нейтрализован), а продукты нейтрализации – остаться безопасными.

Для повышения иммуногенной активности вакцины в ее состав вводят адъюванты – вещества разнообразной химической природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к различным антигенам.

Вкачестве адъювантов используют: гидроксид алюминия, аэросил, минеральные масла, ДЭАЭ-декстан, сапонин. Кроме того, используют синтезированные вещества – мурамилдипептид, полианионы, поликатионы и др. Механизмы действия адъювантов разнообразны и до конца не изучены. Одни из них вызывают воспалительную реакцию, другие способствуют депонированию антигенов и замедляют их гидролиз, третьи способствуют усилению поглощения антигенов макрофагами и антиген-представляющими клетками.

К адъювантам предъявляют следующие требования: они должны быть нетоксичными в используемых дозах, не вызывать побочных реакций в организме, сами не обладать антигенной активностью, должны стимулировать развитие длительного гуморального и

Вирусология

клеточного иммунитета.

Инактивированные вакцины отличаются большей стабильностью свойств, они безопаснее. Такие вакцины используют пре-

имущественно с профилактической целью. Однако эти вакцины имеют некоторые недостатки:

1)технология их изготовления гораздо сложнее, что связано с необходимостью получения большого количества вируссодержащего материала, очистки, концентрации антигена, инактивации вирусного генома и включения в состав вакцины адъювантов;

2)необходимо проводить прививки многократно и в значительных дозах;

3)они индуцируют менее напряженный и длительный иммунитет, чем при использовании живых вакцин;

4)применять их возможно только парентерально;

5)они слабее стимулируют Т-систему иммунитета и местный иммунный ответ, поэтому резистентность слизистых оболочек верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта бывает менее выражена, чем после применения живых вакцин;

6)способны иногда вызывать аллергическое состояние после повторной вакцинации.

Примеры инактивированных вакцин: вакцина против полиомиелита, гриппа.

Помимо традиционных цельновирионных вакцин (живых, инактивированных) разработаны методы создания вакцин новых поколений: субъединичных, синтетических, получаемых методами генной инженерии. Совершенствование вакцин шло в направлении снижения количества балластных компонентов, снижения реактогенности и повышения иммуногенности препарата.

5. Суъединичные вакцины

В вакцинах, приготовленных из цельных вирионов, лишь поверхностные протективные антигены, составляющие обычно около 10% вирусных белков, вызывают развитие вирусспецифического иммунитета. Остальные белки и липиды лишь усиливают реактогенность и вызывают развитие аллергических реакций. Поэтому вполне закономерно получение субъединичных вакцин, содержащих протективные антигены. Субъединичные вакцины лишены этих недостатков. Их готовят следующим образом. Очищенные препараты вируса разрушают детергентами (тритон х-100, твины 20−80, додецилсульфат натрия и

Вирусология

др.), ферментами, органическими растворителями липидов и т.д. Затем выделяют поверхностные протективные антигены путем ультрацентрифугирования, хроматографии на колонках. Очищенные препараты стерилизуют и концентрируют. Полученные таким путем субъединичные вакцины не содержат геномов возбудителей и балластных антигенов, обладают минимальной реактогенностью, однако иммуногенные свойства их обычно слабее, чем у цельновирионных вакцин.

Технологический процесс получения субъединичных вакцин сложный и требует дорогостоящего специального оборудования, поэтому экономически они не всегда выгодны. Высокая стоимость очищенного антигенного материала сдерживает их широкое применение, хотя преимущество их неоспоримо. Отсутствие побочных реакций, неограниченные возможности для ассоциации антигенов, длительное сохранение в минимальных объемах и полнейшая безопасность в связи с отсутствием в препаратах вирусных геномов свидетельствуют о том, что будущее за субъединичными вакцинами.

Примеры инактивированных вакцин: вакцина против гриппа, герпеса, гепатита В, ящура.

6. Синтетические вакцины

Синтетические вакцины создают путем биоорганического синтеза антигенных детерминант протективных вирусных белков. Получение таких вакцин возможно при полной расшифровке структуры (последовательности аминокислот) этих антигенных детерминант. Синтетические вакцины – это препараты, содержащие искусственно синтезированные короткие пептиды, имитирующие небольшие участки протективных антигенов вируса, способные вызвать специфический иммунный ответ организма и защитить его от конкретного заболевания. Для получения таких вакцин используют автоматические синтезаторы. Однако синтетические пептиды оказались слабыми антигенами, и для усиления иммуногенности они нуждаются в соединении с белкомносителем или синтетическим биополимером (мурамилпептид, сополимеры Д-гаутамина и др.).

Проблема, связанная с синтетическими пептидами, состоит в том, что многие антигенные вирусные детерминанты представляют собой не непрерывную последовательность аминокислот, а конформационные кислотные участки, собранные вместе благодаря пространственной организации белка. Для иммунного ответа конформа-

Вирусология

ция является очень важной. Циклизированные пептиды показали большую иммуногенность, чем их линейные аналоги.

Возможность использования синтетических пептидов для индукции иммунитета у животных впервые была показана на примере ящура. Это стало возможным после того, как было установлено, что за индукцию вируснейтрализующих антител вируса ящура ответственен белок VP-1. Позднее был синтезирован пептид, содержащий аминокислотные последовательности VP-1 (141−160), который связали с гемоцианином и адъювантом Фрейнда. Вакцину испытали на морских свинках, свиньях и крупном рогатом скоте. Вакцина защитила животных от заболевания при заражении их вирулентным штаммом вируса. Однако антительный ответ был в 10−100 раз ниже, чем после иммунизации цельными вирионами. Указанная вакцина не нашла широкого практического применения.

У синтетических вакцин нет недостатков, характерных для живых вакцин (реверсия патогенных свойств, остаточная вирулентность, неполная инактивация и т.п.). Синтетические вакцины отличаются высокой степенью стандартности, обладают слабой реактогенностью, они безопасны, с помощью таких вакцин можно избежать развития аутоиммунных процессов при иммунизации, а при использовании доминантных пептидов можно получить вакцины против возбудителей с высокой степенью изменчивости.

ВОЗ одобрила рекомендации по разработке и контролю синтетических пептидных вакцин (1997). Однако, синтетические пептиды обладают слабой иммуногенностью. Для их стабилизации, доставки к иммунокомпетентным клеткам и стимуляции иммунного ответа необходим носитель или какой-либо другой адъювант (иммуностимулирующий комплекс, микросферы, липосомы и пр.).

Получены обнадеживающие результаты применения синтетических вакцин против гриппа, гепатита В, полиомелита и др.

7. Антиидиотипические вакцины

Антиидиотипические вакцины – аналоги антител против вирусных антигенов, которые способны индуцировать гуморальный и клеточный иммунитет. Вакцины на основе антиидиотипических антител безопасны, так как идиотипы являются естественными эндогенными регуляторами иммунного ответа.

Вакцины содержат продукты генов гистосовместимости. Каждой инфекции соответствует свой набор антигенов гистосовместимости,

Вирусология

отвечающий за высокий уровень иммунного ответа. Отсутствие на клетках таких антигенов является одной из основных генетических причин слабой иммунной реакции. Введение в организм молекул гистосовместимости, несущих пептиды, соответствующие эпитопам инфекционных агентов, будет способствовать усилению иммунитета.

Антиидиотические антитела получены для индукции иммунного ответа к вирусам гриппа, диареи крупного рогатого скота и др.

8. Генно-инженерные вакцины

Генная инженерия – это экспериментальная наука, изучающая закономерности конструирования in vitro и поведение в реципиентной клетке функционально активных молекул рекомбинантной ДНК. Объектом исследования генной инженерии являются гены – отрезки ДНК, кодирующие синтез тех или иных белков.

В геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого направлена вакцина.

Рекомбинантная технология совершила прорыв в создании принципиально новых вакцин. Принцип создания генно-инженерных вакцин заключается в том, что в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. В качестве вакцин используются сами модифицированные микроорганизмы или протективный антиген, образующийся при их культивировании в условиях in vitro. В первом случае иммунный ответ направлен не только против продуктов встроенного гена, но и на носитель вектора. Примером рекомбинантной вакцины, состоящей из готового антигена, является вакцина против гепатита В, а примером векторных вакцин, антигены которых образуются in vivo, является антирабическая вакцина. Она получена на основе осповакцины и нашла широкое применение в профилактике бешенства среди диких животных с помощью приманки, содержащей эту вакцину.

Для создания векторных живых вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необходимый предварительно клонированный ген. Вирус, носитель вектора, активно размножается, а продукт встроенного гена обеспечивает формирование иммунитета. Вектор может содержать несколько встроенных генов, отвечающих за экспрессию соответствующих чуже-

Вирусология

родных антигенов. Экспериментальные векторные вакцины на основе вируса осповакцины получены к ветряной оспе, гриппу А, гепатитам А

иВ, простому герпесу. К сожалению, вакцины испытаны преимущественно на животных, которые устойчивы к большинству из этих инфекций.

Рекомбинантный продукт не всегда имеет ту же структуру, что и естественный антиген. Иммуногенность такого продукта может быть сниженной. Естественные вирусные антигены в клетках эукариотов подвергаются гликозилированию, что повышает иммуногенность таких антигенов. В бактериях гликозилирование отсутствует или оно происходит не так, как в клетках высших эукариотов. У низших эукариотов (грибов) посттрансляционные процессы занимают среднее положение.

Иммуногенность вакцин составляет основу ее эффективности. Как правило, корпускулярные вакцины (живые, убитые) обеспечивают необходимую иммуногенность, а в остальных случаях часто приходится использовать дополнительные методы повышения иммуногенности вакцин.

Сточки зрения молекулярной и клеточной иммунологии вакцина должна удовлетворять следующим требованиям:

-активировать вспомогательные клетки (макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса), участвующие в процессинге и презентации антигена;

-содержать эпитопы для Т- и В-клеток, обеспечивающие необходимое соотношение гуморального и клеточного иммунитета;

-легко подвергаться процессированию, ее эпитопы должны обладать способностью взаимодействовать с антигенами гистосовместимости класса I и (или) II;

-индуцировать образование регуляторных клеток (Т-хелперов, В-

иТ- супрессоров), эффекторных клеток (киллеров, Т-эффекторов ПЧЗТ, антителобразующих клеток) и клеток иммунологической памяти.

Таким образом, можно заключить, что целью любой прививки является доставка в человеческий организм вакцины − ослабленного или убитого возбудителя болезни, или похожего на него вещества. В ответ на появление вакцины здоровый организм начинает вырабатывать антитела, которые «охотятся» на возбудителя, и тем самым не дают заразиться. Некоторые вакцины влияют не только на гуморальный, но и на клеточный иммунитет. Чаще всего иммунная система запоминает вакцинный антиген и при повторном попадании возбудителя

Вирусология

в организм быстро мобилизует свои силы для его нейтрализации. Эти механизмы лежат в основе невосприимчивости ко многим заболеваниям (иммунитета). В настоящее время происходит переход на создание рекомбинантных вакцин, т.е. таких препаратов, где действующее начало − чистый единичный белок − получается в результате генноинженерных манипуляций.

Вакцины применяются для предупреждения вирусных заболеваний. Уже имеются вакцины против некоторых из этих возбудителей, кроме того, ведутся работы по созданию вакцин для защиты от остальных вирусов. С помощью вакцинации на земле ликвидирована натуральная оспа. Значительно уменьшилось число заболеваний корью среди детей (раньше от нее умирало до 30 % малышей, заболевших в возрасте до 3-х лет). Современные вакцины против полиомиелита, кори, дифтерии, краснухи, свинки, гепатитов А и В практически полностью ликвидируют эти заболевания. Сегодня в общей медицинской и ветеринарной практике применяется более 50 вакцин. Искоренить некоторые инфекции и охватить вакцинацией всех детей в мире при существующих вакцинах невозможно. Нужны новые вакцины или их модификации, которые позволили бы существенно упростить календарь прививок. Международная программа вакцинации детей объединяет необходимые для этого усилия. В идеале хотелось бы получить вакцины, которые назначались бы внутрь в первые месяцы жизни, обеспечивали бы пожизненный иммунитет после одной-двух доз, были бы менее реактогенны и более термостабильны, чем существующие. Для решения этих глобальных задач требуются десятилетия, но некоторые достижения уже налицо (в частности, разработка комбинированных вакцин, упрощающих календарь прививок).

Тема 11. СОВРЕМЕННЫЕ РАЗРАБОТКИ В ОБЛАСТИ БОРЬБЫ С НЕИЗЛЕЧИМЫМИ ВИРУСНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

План:

1.Вирус иммунодефицита человека.

2.Онковирусы.

1. Вирус иммунодефицита человека ВИЧ-инфекция – инфекционное заболевание человека, вызы-

ваемое вирусами иммунодефицита человека и характеризующееся длительным бессимптомным периодом, лимфоденопатией, пораже-

Вирусология

нием иммунной и нервной систем, наличием оппортунистических и СПИД-ассоциированных заболеваний, с пандемическим распространением и 100% летальностью.

Как известно, ВИЧ принадлежит к семейству Ретровирусы, в связи с чем представляют уникальную группу РНК-содержащих вирусов, обладающих ферментом обратной транскриптазой. Центральной стадией жизненного цикла всех ретровирусов является синтез на матрице вирусной геномной РНК комплементарной ей ДНК (кДНК) с последующим встраиванием кДНК в геном клетки-хозяина.

Вприроде ретровирусы распространены повсеместно. Круг их хозяев весьма широк и включает многие виды беспозвоночных и большинство видов позвоночных животных.

Официальная история возникновения и развития глобальной пандемии ВИЧ-инфекции начинается с 5 июня 1981 г. после сообщения Центра по контролю и профилактике заболеваний США о выявлении в Лос-Анжелесе у 5 гомосексуалистов пневмоцистной пневмонии – тяжелой оппортунистической инфекции, возникающей у лиц с иммунодефицитом. Спустя некоторое время среди гомосексуалистов была зарегистрирована высокая частота саркомы Капоши – редкой сосудистой опухоли кожи, также развивающейся у лиц с клеточным иммунодефицитом. Впоследствии было установлено, что эти заболевания и сопровождающий их иммунодефицит с повышенной частотой возникают среди потребителей внутривенных наркотиков и у лиц с частыми гемотрансфузиями (пациентов с гемофилией).

В1982 г. данное состояние обозначено как СПИД – синдром приобретенного иммунного дефицита.

Вмае 1983 г. группа французских ученых под руководством Ф. Барре-Синусси и Л. Монтанье сообщила о выделении от пациента с лимфоаденопатией и иммунодефицитом ретровируса LAV

(lymphadenopathy-associated virus) – наиболее вероятного возбудителя СПИД. Обнаруженный вирус был передан в США в лабораторию Р. Галло для дополнительного изучения.

Вконце 1983 г. научная группа Ф. Вонг-Стаал, руководимая Р. Галло, объявила о выделении собственного варианта ретровируса – возбудителя СПИД. В дальнейших исследованиях было установлено, что геномы обоих вариантов вирусов идентичны.

В1986 г. возбудитель СПИД получил свое окончательное наименование – «вирус иммунодефицита человека или ВИЧ». В этом

Вирусология

же году в Западной Африке Ф. Клавель с соавторы выделили новый вид вируса иммунодефицита человека – ВИЧ-2.

В 2008 г. за открытие ВИЧ Франсуазе Барре-Синусси и Люку Монтанье присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.

Теории происхождения ВИЧ:

Искусственно создан в конце 70-х годов ХХ века посредством методов генной инженерии.

Антропогенное происхождение:

ВИЧ – типичный ретровирус, существовавший у людей с древних времен и эволюционировавший вместе с человеком;

ВИЧ циркулировал в глухих уголках Центральной Африки, затем через о. Гаити попал в США и быстро распространился на все континенты.

Зоонозное происхождение:

генетические рекомбинации вируса лейкоза человека и животных (ретровируса типа С) с вирусом опухоли молочной железы мышей (ретровирус типа В) или с вирусом обезьяньего СПИД (ретровирус типа Д);

мутанты ВИЧ зелёной мартышки трансформировались и обрели нового хозяина – человека.

Вирус иммунодефицита человека относится к роду Lentivirus. Установлено 2 вида вирусов – ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Внутри вида данные вирусы образуют различные генетические группы. Это связано с нестабильностью генома ВИЧ.

ВИЧ-1 подразделяется на группы М, O, N, P. Более 90% всех случаев инфекции вызывается вирусами группы М (от англ. main – главная, основная). Генетические группы делятся на многочисленные подтипы.

В группе М установлено свыше 10 вирусных подтипов (А−К). Подтипы способны рекомбинировать друг с другом с образованием циркулирующих рекомбинантных форм ВИЧ.

ВИЧ-2 разделяется на 9 генетических групп (A−I).

Вследствие активных мутаций в ходе ВИЧ-инфекции из первичного вируса постоянно образуются его новые генетические эволюцию вирусов.

Геномы ВИЧ-1 и ВИЧ-2 обладают лишь частичной гомологией между собой (около 40−60%). Однако для каждого из них установлен близкородственный вирус иммунодефицита обезьян (для ВИЧ-1 – ви-

Вирусология

рус иммунодефицита шимпанзе, для ВИЧ-2 – вирус обезьянмангабеев). Поэтому считается, что ВИЧ-1 и ВИЧ-2 эволюционировали из соответствующих видов вирусов иммунодефицита обезьян.

ВИЧ-1 имеет пандемическое распространение и является основным возбудителем ВИЧ-инфекции, поэтому далее мы будем разбирать свойства этого вируса, называемого просто ВИЧ.

ВИЧ-2 эндемичен для Западной и Центральной Африки, в других странах был выявлен в единичных случаях. Вызываемая этим ВИЧинфекция имеет более длительное и доброкачественное течение.

Вирион ВИЧ имеет сферическую форму диаметром 100−280 нм. Он окружен внешней липидной двухслойной оболочкойсуперкапсидом (сложный вирус). На поверхности вирионов имеются гликопротеиновые шипы, выполняющие рецепторную функцию. Каждый из них представлен гликопротеином gр160, который нарезается клеточной протеазой с образованием 2-х белков – gp41 и gp120. Белок gp41 погружен в липидную оболочку; находящийся снаружи белок gp120 является внешней частью рецептора.

Под липидной оболочкой расположен сферический слой матриксного белка p17.

Внутри его находится сердцевина вируса (капсид), образованная белком p24 и белком p6. Нуклеокапсид имеет форму усеченного конуса. Он содержит вирусный геном и ферменты репликации ВИЧ.

Капсидные и суперкапсидные структурные белки ВИЧ являются вирусными антигенами.

Геном ВИЧ (как и всех ретровирусов) представлен 2-мя копиями однонитевой несегментированной положительной (+) РHK. Молекулы РНК образуют димер, соединенный водородными связями на одном из концов. С молекулами РНК тесно связан нуклеокапсидный белок p6.

Вирусный геном содержит 9 генов, из них 3 кодируют структурные белки и 6 – регуляторные.

Структурный ген gag (англ. group specific antigen) кодирует внутренние белки капсида вируса.

Структурный ген env (англ. envelope – оболочка) отвечает за синтез наружных гликопротеинов gр41 и gр120. Ген pol (polymerase) кодирует ферменты ВИЧ – обратную транскриптазу (p66), протеазу (p32) и интегразу (p11).

У ВИЧ также имеются регуляторные гены, кодирующие синтез одноименных регуляторных белков: