Ваіріант 1

1. Задачі медичної мікробіології, етапи розвитку. Вдосконалення методів лабораторної діагностики інфекційних хвороб

Мікробіологія (грец. micros — малий + bios — життя + logos — учення, слово, поняття) — комплекс біологічних наук, що вивчають морфологію, фізіологію, генетику, екологію та еволюцію мікроорганізмів.

До завдань мікробіології входять: 1) вивчення біо­логії патогенних і нормальних для людини мікробів; 2) дослідження ролі та значення мікробів в етіології та патогенезі інфекційних хвороб; 3) розроблення й використання методів мікробіологічної діагностики, етіотропної терапії та специфічної профі­лактики інфекційних захворювань людини.

У розвитку мікробіології виділяють 4 етапи:

І – морфологічний (А. Левенгук);

II – фізіологічний (Луї Пастер, Роберт Кох та ін.);

III – імунологічний (І. І. Мечников, П. Ерліх та ін.);

IV – молекулярно-генетичний (сучасний);

Сучасні методи мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань.

Успіхи в лікуванні та профілактиці інфекційних хвороб значною мірою залежать від своєчасної діагностики. Мікробіологія пропонує такі сучасні методи діагностики:

*мікроскопічний – ґрунтується на виявленні збудника в патологічному матеріалі та його ідентифікації (визначенні виду). За допомогою мікроскопа вивчають його морфологічні (форму, розмір, взаємне розміщення

клітин, рухливість, наявність спори та капсули) і тинкторіальні властивості (здатність забарвлюватися барвниками);

*мікробіологічний – посів патологічного матеріалу на живильні середовища, виділення чистої культури та її ідентифікація на основі вивчення культуральних і біохімічних властивостей мікроорганізмів; нині розроблено автоматичні системи, які дозволяють протягом кількох годин визначити вид збудника, вивчити його антибіотикограму;

*біологічний – уведення патологічного матеріалу лабораторним тваринам із метою моделювання в них інфекційного захворювання, виділення чистої культури збудника з подальшою ідентифікацією, виявлення токсинів;

*серологічний – виявлення в крові специфічних антитіл і антигенів;

*алергічний метод – виявлення підвищеної чутливості, макроорганізму до конкретного збудника або продуктів його життєдіяльності. Використовують для діагностики туберкульозу (реакція Манту), бруцельозу (реакція Бюрне) та ін.;

*молекулярно-генетичний – виявлення фрагментів нуклеїнових кислот мікроорганізмів у патологічному матеріалі. Використовують молекулярні та генні ДНК- і РНК-зонди в поєднанні з ланцюговою полімеразною реакцією (ЛПР). За допомогою цього методу можна ідентифікувати будь-який об'єкт.

2. Генна інженерія та її практичне використання в медичній мікробіології

Генна інженерія – сукупність експериментальних методів перенесення генетичного матеріалу з однієї клітини в іншу з метою конструювання молекул ДНК з заданою комбінацією генів і створення біологічних об'єктів з корисними властивостями

Етапи генно-інженерних досліджень:

1.Вибір і вилучення із організму клітин-донорів, що мають корисні властивості, генетичного матеріалу.

2.Фрагментація отриманої ДНК з метою одержання окремих комбінацій генів

3.Введення отриманих фрагментів у вектори (плазміди або бактеріофаги)

4.Введення векторів з рекомбінантною ДНК в клітини мікроорганізмів (трансформація або трансфекція)

5.Аналіз мікробної популяції і виділення штаму рекомбінанта

6.Експлуатація одержаного штаму продуцента:

- мікробіологічний синтез корисних речовин;

- клонуванння рекомбінантних генів для їх наступного закріплення у обраному геномі

Метод генетичної інженерії належить до перспективних при отриманні багатьох білкових біологічних речовин, що являють цінність для медицини. Цим методом отримані: інтерферони, інтерлейкіни, інсулін, гормон росту, тканинний активатор плазміногена, вакцина проти гепатиту В, моноклональні антитіла для попередження відторгнення при пересадки нпрки, діагностичні препарати для виявлення ВІЛ і інші.

За допомогою генної інженерії створюються препарати другого покоління, тобто аналоги природних речовин, що мають більшу ефективність дії.

3. Механізм імунної відповіді організму. Фази імунної відповіді. Імунологічна пам'ять,ім.. толерантність.

Первинна імунна відповідь (АГ потрапляє вперше):

1.Індуктивна фаза (24-96 годин)

• поглинання та процесінг АГ

• активація Т-хелперів

• активація В-лімфоцитів, їх проліферація

• утворення плазматичних клітин

2.Продуктивна фаза (14 діб)

• синтез Ig M (початок на 4-5 добу, максимум на 7-12)

• синтез Ig G (початок на 7 добу, максимум на 14)

• кількість Ig M i G однакова

• формування Т- і В-лімфоцитів пам’яті

Вторинна імунна відповідь (АГ потрапляє повторно):

1.Індуктивна фаза (5-6 годин)

• кінцева проліферація Т- і В-лімфоцитів пам’яті

2.Продуктивна фаза (14 діб)

• одномоментний синтез Ig M і Ig G

• синтез Ig G в більших титрах (максимум на 3-5 добу)

Імунологічна пам'ять. В імунізованому орг, а також в орг. , що перніс інф захвор,але потім втратив здатність зберігати антитіла, під впливом спец і не спец подразників підвищ титр імунологлобулінів в сироватці крові. Кліт пам’яті – це частина довго живучих В і Т-лімф, стимульованих цим антигеном, які після 2-3 поділів переходять у стан спокою.Перебуваючи в орг ці лімф можуть розпізнавати антиген який сенсибілізував і давати імунну відповідь.

Ім толерантність- це відсутність імунної відповіді орг. на певний антиген. Відносно інших антигенів такий орг. може виробляти антитіла і відповідати клітинними імунними р-ми. Ім тол виникає в разі контакту орг. З цим антигеном в ембр періоді(період адаптації). Він може тривати і після народження якщо в орг. є антиген до якого виникла толер.

Види толер:

1) природна - може виникнути як до типових антигенів, так і до ауто антигенів, алергенів, пухл і трансп антигенів.

2) індукована - детермінуєтьсяь деякими лік засобами,які пригнічують вироблення антитіл.

Відповідальні за розвиток ім. толер Т і В-супресори.Антигени,які спричиняють ім. тол,дістали назву толерогенів,ними найчастіше можуть бути сироваткові білки.Толерантний орг. Вважає «своїм» чужорідний матеріал і не відповідає на нього ім. р-ми.

Ім тол може бути втрачена при видаленні АГ, що є в орг., а також при введенні ім. сиров проти антигенів якими була індукована толерантність.

Варіант 2

1. Відкриття Пастера та їх роль в розвитку медичної науки

Дженнер провів вакцинацію, але суті її він не зрозумів. Це вдалося французькому вченому Луї Пастеру (1822–1895). З іменем Л. Пастера пов'язаний II період розвитку мікробіології – фізіологічний. Пастер є основоположником наукової мікробіології. Він довів неможливість самозародження життя, запропонував методи стерилізації {повного знищення мікроорганізмів) та пастеризацію (більш м'яку стерилізацію), а також науково обґрунтував роль мікроорганізмів у виникненні захворювань. Л. Пастер довів, що бродіння та гниття спричинюють мікроорганізми, що дозволило іншим ученим, зокрема Лістеру та Пирогову, розробити методи асептики та методи асептики та антисептики. Л. Пастер відкрив анаероби, обґрунтував явище атенуації (ослаблення патологічних властивостей збудника), отримав вакцину проти сибірки та сказу. Л. Пастер зібрав навколо себе блискучу плеяду вчених. Серед них були і наші співвітчизники: 1.1. Мечников, О. М. Безредка, М. Ф. Гамалія, І. Г. Савченко та ін. У цю "золоту" пору мікробіології поряд з іменем Л. Пастера стало ім'я німецького вченого Роберта Коха (1843– 1910) – майстра прикладнихдосліджень. Він зробив неоціненний внесок у мікробіологію:

• удосконалив мікробіологічну техніку, застосував імерсійні об'єктиви,

• мікрофотографію;

• використав анілінові барвники;

• запропонував методи виділення чистої культури та щільні живильні середовища;

• відкрив збудників туберкульозу (паличку Коха) і холери; довів, що збудником сибірки є В. апігпасіз;

• обґрунтував теорію та практику дезінфекції (знищення патогенних мікроорганізмів).

2. Роль мутацій і рекомбінацій у виникненні атипових і лікарсько-стійких форм бактерій.

Мутації – зміни в первинній структурі ДНК клітини, які супроводжуються стійкою стрибкоподібною зміною певної біологічної ознаки і стабільно успадковуються наступними поколіннями.

Генетичні рекомбінації – зміни в генотипі бактерій, які зумовлені передачею фрагменту геному однієї клітини (донор) до іншої (реципієнт), і супроводжуються появою нових ознак у рекомбінанта

Еволюційні зміни ознак, що детермінуються одним геном, можуть виникнути в результаті поєднання мутаційного процесу і рекомбінації. Це поєднання грає найбільшу роль в еволюції бактерій а ткож у виникненні лікарсько-стійких форм бактерій.

Ці процеси сліпі відносно адаптивної цінності рекомбінантів, що утворюються. Він механічно створює як непридатні, так і корисні в адаптивному сенсі типи.

Існує два типи лікарської стійкості бактерій : природна, або природна, і придбана.

Природна лікарська стійкість є видовою ознакою. Вона властива усім представникам цього виду і не залежить від первинного контакту (контактів) з цим антибіотиком, в її основі немає ніяких специфічних механізмів. Набута лікарська резистентність виникає у окремих представників цього виду бактерій тільки в результаті зміни її генома. Можливі два варіанти генетичних змін. Один з них пов'язаний з мутаціями в тих або інших генах бактерійної хромосоми, внаслідок яких продукт гена, що атакується, перестає бути мішенню для цього антибіотика. Це відбувається або внаслідок зміни структури білку, або тому, що він стає недоступним для антибіотика.

У іншому випадку бактерії стають стійкими до антибіотика або навіть відразу до декількох антибіотиків завдяки придбанню додаткових генів, носіями яких є R -плазмиды. Вирішальну роль в поширенні лікарської стійкості, у тому числі множинною, грають R -плазмиды завдяки здатності їх до самопереносу.

Експериментально було доведено, що мутації викликаються дією чинника середовища (наприклад, антибіотика), до якого вони дозволяють адаптуватися. Для перевірки цієї гіпотези був розроблений флуктуаційний тест і метод реплік.

Флуктуаційний тест полягає в тому, що невеликі порції початкової культури бактерій розсіюють в пробірки з рідким середовищем, а після декількох циклів ділень додають в пробірки антибіотик. Потім (без наступних ділень) на чашки Петрі з твердим середовищем висівають стійких до антибіотика бактерій, що вижили. Тест показав. що число стійких колоній з різних пробірок дуже мінливо - в більшості випадків воно невелике (чи нульове), а в деяких випадках дуже високе. Це означає, що мутації, що викликали стійкість до антибіотика, виникали у випадкові моменти часу як до, так і після його дії.

Метод реплік полягає в тому, що з початкової чашки Петрі, де на твердому середовищі ростуть колонії бактерій, робиться відбиток на ворсисту тканину, а потім з тканини бактерії переносяться на декілька інших чашок, де малюнок їх розташування виявляється тим же, що на початковій чашці. Після дії антибіотиком на усіх чашках виживають колонії, розташовані в одних і тих же точках. Висіваючи такі колонії на нові чашки, можна показати, що усі бактерії усередині колонії мають стійкість.

3. Клітинний та тканинний механізм захисту.

Механічний захист організму зумовлений такими факторами захисту організму як бар*єрна фу-я шкіри, слизових оболонок, лімфатичних вузлів бактерицидні речовини рідин організма(слина…), видільна ф-я, температурна ре-я….. чужорідні тіла і речовини знешкоджуються в основному механічними або фізико-хімічними ділянками.

Захисні функ_ї шкіри, слизових оболонок, лімфатичних вузлів.

Шкіра - реалізується за доп зв'язаних між собою гормональних і клітинних . Гормони шкіри активізують Т-лімфоцити які руйнують гетерогенні організми (бактерії, віруси). Кисле середовище поту має бактерицидну дію На багато мікроорганізмів.

Слизові оболонки - є непроникними для різних мікроорганізмів і хар бактерицидними властивостями їх секретів. В слині, молоці, тканинах і органах є лізоцим і секреторний імуноглобулін А. Лізоцин знищує бактерії при відсутності його в слизових оболонок відбувається безпосереднє ураження слиз оболонки.

Клітинний та тканинний захист відбувається за допомогою виділення інгібіторів які пригнічують чужорідні мікроорганізми. Гіалуронова кислота запобігає проникненню збудників у тканини і органи, такі ж властивості має шлунковий сік.

Лімфатичні вузли - захищають організм після долання бактеріями бар8єру захисту шкіри та слизових оболонок, у них затримуються і знешкоджуються патогенні бактерії, реакція характер. Вивільненням з тканин речовин(лейкотоксини, гістамін ), під впивом яких активуються лейкоцити та створ захисний вал який не дає розповсюджуватись бактеріям у тканинах та крові.

Запалення - розвивається у лімфо вузлах та згубно діє на збудників інфекційних хвороб, воно зумовлює підвищення температури тіла, виникнення ацидозу та гіпоксії що згубно діють на мікроорганізми

Варіант 3

1. Роботи Коха та їх вплив на прогрес мікробіології

Німецький лікар і бактеріолог Генріх Герман Роберт Кох народився в Клаусталь-Целлерфельді 11 грудня 1843 р. Кох знайшов, що в околицях Вольштейна поширена сибірська виразка, ендемічне захворювання, що викликається бактерією Bacillus anthracis і поширюється серед великої рогатої худоби й овець, уражає легені, викликає карбункули шкіри і зміни лімфовузлів. Незабаром Кох почав вивчати за допомогою мікроскопа збудника, що ймовірно викликав сибірську виразку. Провівши серію ретельних, методичних експериментів, Кох установив, що єдиною причиною сибірської виразки була бактерія Bacillus anthracis. Він довів також, що епідеміологічні особливості сибірської виразки, тобто взаємозв'язок між різними факторами, що визначають частоту і географічний розподіл інфекційного захворювання, обумовлені циклом розвитку цієї бактерії. Дослідження Коха Bacillus-anthracis уперше довели бактеріальне походження захворювання. У 1881 р. Кох опублікував роботу «Методи вивчення патогенних організмів» ("Methods for the Study of Pathogenic Organisms"), у якій описав спосіб вирощування мікробів у твердих середовищах. Цей спосіб мав важливе значення для ізолювання і вивчення чистих бактеріальних культур. Найбільшого тріумфу Кох досяг 24 березня 1882 р., коли він оголосив про те, що зумів виділити бактерію, що викликає туберкульоз. У той час це захворювання було одним з головних причин смертності. У публікаціях Коха із проблем туберкульозу вперше були позначені принципи, що потім стали називатися постулатами Коха.

Вивчення Кохом туберкульозу було перервано, коли він за завданням німецького уряду в складі наукової експедиції виїхав у Єгипет і Індію з метою спробувати визначити причину захворювання холерою. Працюючи в Індії, Кох оголосив, що він виділив мікроб, що викликає це захворювання. Відкриття Коха зробили його одним з тих особ, хто визначає напрямки розвитку охорони здоров'я, і зокрема відповідальним за координацію досліджень і практичних заходів у боротьбі з такими інфекційними захворюваннями, як черевний тиф, малярія, чума великої рогатої худоби, сонна хвороба .

| 2. Бактеріологічний метод дослідження. Принципи виділення чистих культур бактерій та їх ідентифікації

Методи виділення чистих культур. Виділення окремих видів бактерій і отримання чистої культури є основою бактеріологічної роботи, оскільки на практиці найчастіше доводиться мати справу з матеріалом, що містить суміш мікробів. Встановлення ж виду мікроба і вивчення усіх його властивостей можливе тільки тоді, коли бактерії отримані в чистому, ізольованому вигляді, тобто у чистій культурі. Основним завданням при дослідженні матеріалу, містячого суміш мікробів, являється отримання окремих колоний (скупчення мікробів одного виду, що виросли з одного зародка) по можливості усіх мікробів, що знаходяться в досліджуваному матеріалі. Простий спосіб – механічне відокремлення мікробів на поверхні щільної поживного середовища. Для цієї мети найчастіше застосовується агар, що розливається в так звані чашки Петрі.

Виділення чистих культур методом розсівання на чашки. Посів шпателем (метод Дригальского). Простим спо¬обом роз'єднання мікробів являється послідовне розтирання матеріалу скляним шпателем або петлею по поверхні агару на декількох чашках Петрі з поживним середовищем.

Агар в чашках готують заздалегідь наступним чином: стерильний агар, що знаходиться в колбах або флаконах, розплавляють на водяній лазні. Колбу з розплавленим агаром беруть в праву руку, а лівою виймають пробку. Обжи¬гают шийка колби і великим і вказівним пальцямі лівої руки підводять кришку чашки лише настількидо, щоб в щілину могло пройти шийку колби з середовищем. Вводять шийку під кришку чашки (не торкаючись її країв), наливають в чашку 10-15 мл поживного середовища, швидко виводять шийку колби з чашки і закривають її кришку. Негайно ж обпалюють край шийки колби і пробку і закривають колбу. Якщо середовище не розподілилося рівномірно по дну чашки, то, обережно погойдуючи чашку, середовище розподіляють рівним шаром завтовшки приблизно 0,5 см Доки середовище не захолоне, чашки не можна пересувати або переносити. Застигле середовище підсушують в термостаті або в закритих чашках протягом 1-2 годин або у відкритих чашках протягом 30 хвилин. У останньому випадку відкриті чашки поміщають дном вгору на полицях термостата, покритих стерильним папером.

Перший день: посів досліджуваного матері¬яскраво-червона. Посів виробляється на трьох пронумерованих чашках Петрі (I, II, III) з поживним середовищем. Для посіву заготовляються скляні шпателі, загорнуті в папір і простерилізовані. Можна зробити шпатель з пастерівської піпетки, загнувши під кутом її кінець в.пламе¬ні пальники.

Другий день: вивчення колоній і виділені чистих культур. Через добу засіяні чашки виймають з термостата і вивчають отримані посіви. На чашці 1, де було багато матеріалу, вийшло суцільне зростання бактерій і окремих колоній не видно. На чашці II і особливо на чашці III колонії розподілилися, тому легко доступні дослідженню.

Передусім вивчають колонії макроскопічно, неозброєним оком. Переглядають чашку (не від¬крывая) з боку дна у світлі, що проходить, тримаючи її на рівні очей на відстані 20-30 см Виявляють, що посів суміші мікробів дав зростання неоднорідних колоній. Від¬мечают величину колоній (велика, дрібна, точкова), форму (правильна кругла, неправильна, плоска, віз¬вышающаяся над поверхнею середовища), колір (безбарвна, забарвлена), консистенцію (щільна, така, що кришиться, мяг¬кая), характер поверхні (гладка, зморшкувата, блес-тящая, тьмяна, волога, суха, слизова оболонка і т. д.).

Під мікроскопом різко виявляється будова колоній : характер країв (рівні, фестончасті, зазублені), характер поверхні (гладка, шорстка), структура (гомогенна, зерниста, однорідна або така, що розрізняється в центрі і по периферії).

Кожному виду мікробів властивий певний харак¬тер колоній. Нерідко характер колоній має диагности¬ческое значення для визначення збудників хвороби.

3. З частини кожної з намічених колоній роблять маз- I ки, забарвлюють їх по Граму.

Третій день: перевірка чистоти культури і вивчення властивостей мікроба. Через добу про¬бирки з посівами виймають з термостата і переконуються, що в кожній з них отриманий посів однорідної культури. Перевіряється чистота культури і вивчається морфологія бактерій в мазаннях, забарвлених по Граму. Посів петлею. Виділення чистих культур з суміші мик¬робов можна зробити посівом петлею штрихом.

Рахунок колоній. Для визначення кількості колоній, що виросли, а отже, міри забрудненості матеріалу застосовують або прямий їх підрахунок через лупу, або у випадках великої кількості колоній, що виросли, - за допомогою спеціальних камер. Камерами для підрахунку колоній є скляні пластинки, укріплені на підставках і розділені на ряд квадратів площею 1 cmz. Деякі з цих квад¬ратов у свою чергу разде¬лены на 9 малих квадратів.

Виділення чистих культур анаеробів

Перший день. 1. Накопичення матеріалу. Иссле¬дуемый матеріал (наприклад, землю, гній) засівають пасті¬ровской піпеткою на середовище Китта - Тароцци, прокип'ячений¬ную протягом 20 хвилин перед посівом и'остуженную. Після посіву матеріалу середовище нагрівають 15 хвилин при 80° для знищення вегетативної флори; спори анаеробів п.^і цьому не гинуть. Пробірки з посівом ставлять в термостат. "

Другий день*. Через добу середовище виявляється помутнівши¬ший (зростання мікробів), іноді в ній видно бульбашки газу. Роблять мазання, забарвлюють їх по Граму і виявляють великі спорові і неспорові грампозитивні па¬лочки. Мікроскопічна картина дає тільки ориентиро¬вочное уявлення про мікробну флору досліджуваного ма-териала.