сложные методы окраски

Метод Грама

Метод Бурри-Гинса

Цель применения

Для отличия одних видов бактерий от других (грамположительных от грамотрицательных), что является важным таксономическим признаком

Для выявления капсул у чистых культур капсульных бактерий

Реактивы:

Красящие растворы

1. Карболовый генцианвиолет или пропитанная им фильтровальная бумажка

2. Водный раствор фуксина или пропитанная им фильтровальная бумажка

1. Тушь

2. Разведённый (1:3) карболовый фуксин Циля

Протрава

Раствор Люголя – на 300 мл дист воды 1,0 г йода и 2,0 г KI

Дифференцирующее вещество

Этиловый спирт

Способ фиксации, состав фиксатора

В пламени горелки

В пламени горелки

Этапы окраски

1. На фиксированный мазок поместить фильтр.бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить её водой, выдержать 3 минуты

2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить р-р Люголя на 1 минуту.

3. Слить р-р Люголя, провести дифференциацию, погрузив препарат несколько раз в стаканчик со спиртом (пока не перестанут отходить фиолетовые струйки)

4. Тщательно промыть препарат водой

5. Дополнительно подкрасить препарат с помощью красящей бумажки, пропитанной р-ром карболового фуксина, в течение 3 минут.

6. Промыть водой, высушить.

1. На предметное стекло нанести рядом каплю туши и каплю воды, в которой суспензировать внесённую петлёй капсульную культуру

2. Обе капли соединить в одну и размазать её тонким слоем с помощью второго предметного стекла

3. Высохший на воздухе мазок осторожно фиксировать в пламени горелки

4. Докрасить препарат разведённым карболовым фуксином Циля в течение 2-3 мин, после чего промыть водой и высушить.

Сущность метода

При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствором Люголя образуется комплексное соединение краски с йодом, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных (они остаются фиолетовыми) и удаляются из грамотрицательных (при дополнительной окраске фуксином приобретают красный цвет). Способность бактерий удерживать комплекс генцианвиолета с йодом зависит, главным образом, от строения клеточной стенки, имеющей существенные различия у грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Фуксин окрашивает тела бактерий в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными.

Результат: описание микроскопической картины

В поле зрения видны стафилококки сине-фиолетового цвета – грамположительные – и расположенные между ними кишечные палочки, имеющие красный цвет, т.е. грамотрицательные.

В поле зрения видны бациллы красного цвета, окруженные белыми ореолами капсул, которые хорошо видны на серовато-коричневом тушевом фоне.

Рисунок

Метод Циля-Нельсона

Метод Пешкова

Цель применения

Для дифференцирования кислотоустойчивых бактерий от некислотоустойчивых, к которым относятся подавляющее число микроорганизмов.

Для выявления клеточной стенки

Реактивы:

Красящие растворы

1. Карболовый фуксон

2. Метиленовый синий

1. водный фуксин

Протрава

Подогревание препарата с краской

10% водный раствор танина

Дифференцирующее вещество

5% H2SO4

Способ фиксации, состав фиксатора

В пламени горелки

Жидкость Карнуа (смесь этилового спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6:3:1)

Этапы окраски

1. Окрасить мазок карболовым фуксином при подогревании (три раза до появления паров – примерно 3 минуты)

2. Промыть водой

3. Обесцветить препарат 5% H2SO4

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок контрастной краской – метиленовым синим (5 минут)

6. Промыть водой. Высушить.

1. Приготовленный и высушенный препарат из бактериальнйо культуры зафиксировать в жидкости Карнуа в течение 15 минут

2. Промыть водой

3. Держать в 10% водном растворе танина 6-8 мин

4. Промыть и окрасить водным фуксином 30-60 сек

5. Промыть водой, высушить с помощью фильтровальной бумаги.

Сущность метода

Кислотоустойчивость зависит от наличия в клеточной стенке липидов, воска и особенно миколовой кислоты. Кислотоустойчивые бактерии требуют интенсивной окраски (конц. фуксином Циля при нагревании), они прочно удерживают краситель, не обесцвечиваются серной кислотой и остаются рубиново-красными. Некислотоустойчивые при дифференцировке серной кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовым синим.

Результат: описание микроскопической картины

В поле зрения видны небольшие палочки рубиново-красного цвета (Mycobacterium tuberculosis) и окрасившиеся в дополнительный синий цвет некислотоустойчивые стафилококки.

В поле зрения видны крупные стрептобактерии светло-розового цвета, они окаймлены клеточной стенкой красного цвета.

Рисунок

Метод Романовского-Гимзы

Метод Нейссера

Метод Ожешке

Цель применения

Для выявления нуклеоида бактерий.

Для выявления цитоплазматических включений валютина

Для окраски спор бактерий

Реактивы:

Красящие растворы

1. краска Романовского-Гимзы (азур, эозин, метиленовый синий)

1. уксуснокислая синька

2. везувин

1. Карболовый фуксон

2. Метиленовый синий

Протрава

Кислотный гидролиз в р-ре соляной к-ты при нагревании

Р-р Люголя

0,5% р-р HCl при нагревании

Дифференцирующее вещество

Способ фиксации, состав фиксатора

Жидкость Карнуа

В пламени горелки

Не фиксируют

Этапы окраски

1. Готовят мазок из чистой культуры бактерий

2. Фиксируют в жидкости Карнуа

3. Проводят кислотный гидролиз в р-ре соляной к-ты при нагревании

4. Мазок окрашивают краской Романовского-Гимзы в течение 40-60 мин

5. После каждого этапа мазок промывают дист. водой

1. Мазок окрашивают уксусной синькой (1мин)

2. Промывают водой

3. Докрашивают везувином 20-30 сек

4. Промывают водой

1. На нефиксированный мазок 0,5% раствор HCl и подогревают 2 мин.

2. Промывают, высушивают и фиксируют

3. Докрашивают по методу Циля – Нильсена

Сущность метода

Краситель окрашивает ацидофильные компоненты клетки в различные оттенки красного, а базофильные - в цвета от пурпурного до фиолетового.

Основан на кислотоустойсивости бактерий.

Результат: описание микроскопической картины

В поле зрения видны бактерии с розовой цитоплазмой, в которой видны один или несколько компактных нуклеоидов красновато-фиолетового цвета, имеющих разную форму (округлую, овальную, палочковидную)

В поле зрения видны бактерии, тела которогых светло-коричневого цвета, зёрна валютина, расположенные на обоих концах бактерий, окрашены в сине-чёрный цвет.

В поле зрения видны рубиново-красные споры, вегетативные клетки голубого цвета

Рисунок