Лабораторная диагностика криптоспоридиоза

Диагноз на криптоспоридиоз устанавливают на основании лабораторных исследований фекалий (прижизненно) и патологического материала (посмертно) с учетом эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных.

Для исследования в лабораторию направляют:

свежие пробы фекалий массой около 10 г из прямой кишки, взятые от 10-20 подозреваемых в заболевании животных, пробы исследуют в день отбора;

пробы патматериала от трупов - соскобы и мазки-отпечатки из пораженных мест кишечника или участки тонкого кишечника, которые необходимо исследовать не позднее 6 ч после гибели животного.

Исследование фекалий.

Приготовление мазка из свежих фекалий. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю фекалий, разбавляют каплей физиологического раствора, распределяют тонким слоем (без нажима!). Полученный мазок высушивают при комнатной температуре.

Применение флотационных методов. Пробу фекалий массой 3 г помещают в стакан объемом 50 мл, заливают небольшим количеством насыщенного раствора хлорида натрия (400 г на 1 литр горячей воды, плотность раствора 1,18 г/мл) или сульфата цинка (400 г на 1 л воды, плотность раствора 1,24 г/мл) или смесью Павласека (хлорид цинка – 220 г, хлорид натрия – 210 г, вода – 800 мл). Тщательно размешивают палочкой, добавляют раствор до краев стакана, фильтруют через сито и отстаивают в течение 15-20 мин. Затем металлической петлей снимают 15-20 капель с поверхностной пленки, переносят на предметное стекло, делают тонкий мазок и высушивают на воздухе.

Применение центрифугирования в сочетании с флотацией. Пробу фекалий массой 3 г помещают в стакан емкостью 50 мл, добавляют 15 мл воды, размешивают, фильтруют через металлическое сито, переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 1-2 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют один из флотационных растворов, указанных выше, перемешивают и снова центрифугируют при том же режиме. Металлической петлей снимают 15-20 капель с поверхностной пленки, переносят на предметное стекло, делают тонкий мазок и высушивают на воздухе.

Фиксация мазков. На высушенный мазок наносят несколько капель этилового (метилового) спирта и фиксируют в течение 10-15 минут до полного испарения спирта. Затем мазок окрашивают одним из следующих способов.

Окраска мазков по Цилю-Нильсену. Для приготовления карболового фуксина Циля в ступку вносят фуксин основной – 2г, добавляют 2-3 капли глицерина, растирают, тщательно перемешивают при постепенном добавлении спирта этилового 96°- 12 мл, карболовой кислоты – 5 г и воды дистиллированной – 100мл. Раствор сливают в склянку с плотной пробкой, помещают на сутки в термостат при температуре 37°С и фильтруют через бумажный фильтр.

Зафиксированные мазки окрашивают в течение 20 мин в растворе карболового фуксина, промывают в проточной воде, слегка высушивают и наносят на стекло 7-10 % раствор серной кислоты на 30-60 секунд для обесцвечивания. Затем промывают в проточной воде и докрашивают мазок 5% раствором малахитового зеленого в течение 1-2 минут.

Окраска мазков сафранином по Кюстеру. Готовят отдельно 3% раствор сафранина и 5,6% раствор КОН в дистиллированной воде. Перед применением готовят рабочий раствор: берут 5 капель свежеприготовленного раствора сафранина и смешивают с 1,5 мл раствора КОН.

Фиксированный мазок окрашивают рабочим раствором сафранина в течение 5 мин, промывают водой, обесцвечивают 0,5% раствором серной кислоты в течение 15 секунд, промывают водой, докрашивают 5% раствором малахитового зеленого на 10% этиловом спирте в течение 10-15 секунд, промывают водой, высушивают на воздухе.

Окраска мазков по Романовскому-Гимзе. Рабочий раствор краски готовят из расчета 1-3 капли готовой краски на 1 мл воды (рН=7,0-7,2). На один препарат используют 3-4 мл разведенной краски.

Окрашивают фиксированные мазки в течение 20-30 мин, после чего их промывают дистиллированной водой и высушивают.

Оценка результатов окраски. Высушенные мазки просматривают под большим увеличением микроскопа, с использованием иммерсионного объектива.

Результаты окраски:

- по Цилю-Нильсену – кислотоустойчивые ооцисты криптоспоридий округлой формы , 4-5 мкм, ярко-красного цвета различных оттенков; они хорошо различимы на общем зеленом фоне мазка.

- по Кюстеру – ооцисты окрашиваются в бледно-розовый цвет.

- по Романовскому-Гимзе – округлые ооцисты не окрашиваются или окрашиваются слабо, внутри них по периферии заметны спорозоиты удлиненной формы, слегка изогнутые, бледно-голубого цвета с красной гранулой.

Оценка интенсивности инвазии в среднем по 10 полям зрения микроскопа:

+ - низкая (1-3 ооцисты);

++ - средняя (до 25 ооцист);

+++ - высокая (более 25 ооцист).

Исследование нативных препаратов фекалий. Применяется метод И. Павласека (1990) с применением глицерина (1). В каплю фекалий добавляют несколько капель глицерина, при этом ооцисты криптоспоридий приобретают слегка розоватый цвет и становятся хорошо различимы. В ооцистах четко выявляются спорозоиты. Другие простейшие и частицы не обладают свойством менять свой цвет под влиянием глицерина. Следует отметить, что такая окраска ооцист криптоспоридий может исчезнуть через 30-40 мин после приготовления нативного препарата. В связи с этим, необходимо исследовать только свежеприготовленные препараты. Исследование проводят под увеличением микроскопа 40х10.

Количественный метод диагностики криптоспоридиоза (13). Методика основана на способности эфира, будучи добавленным во взвесь фекалий, просветлять ее, захватывая частицы детрита и жира, поднимать их на поверхность при центрифугировании. К пробе фекалий (1 мл) добавляют 5 мл 2% раствора кальцинированной соды и тщательно перемешивают, затем смесь фильтруют через металлическое сито в центрифужную пробирку, добавляют воду, доводя объем взвеси до 10 мл. Взвесь центрифугируют в течение 3 мин при 2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 6-7 мл 2% раствора кальцинированной соды и 1,5-2 мл этилового эфира. Пробирку закрывают пробкой, осторожно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 250-500 об/мин. После центрифугирования образовавшуюся в пробирке надосадочную жидкость отсасывают пипеткой до метки 1 мл. Осадок тщательно перемешивают и пипеткой из гемометра Сали быстро набирают 0,01 мл взвеси, выдувают на предметное стекло и готовят мазок. Полученный мазок высушивают, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Подсчет ооцист криптоспоридий ведут по всей поверхности мазка под большим увеличением микроскопа, с использованием иммерсионного объектива. Полученное количество ооцист умножают на 1000 и получают количество ооцист в 1 г фекалий. Для удобства подсчета ооцист криптоспоридий мы рекомендуем применять сетку Акбаева (12).

Посмертная диагностика.

Посмертный диагноз на криптоспоридиоз представляет определенные сложности: в связи с мелкими размерами ооцист, их внешней схожестью на мазках-отпечатках с каплями жира, эритроцитами и др., а также быстрым аутолизом. Обязательное условие – недопущение замораживания и оттаивания проб патматериала. Мазки-отпечатки и соскобы фиксируют этанолом и окрашивают по Цилю-Нильсену, затем просматривают под большим увеличением микроскопа, с использованием иммерсионного объектива (5; 13).

Дифференциальный диагноз.

В исследуемых мазках ооцисты криптоспоридий следует отличать от других возбудителей, вызывающих энтериты молодняка. Ооцисты эймерий в мазках – различной формы, значительно крупнее криптоспоридий, внутри бывают различимы 4 спороцисты, содержащие по 2 спорозоита. Яйцо гельминта – крупное, овальное, круглое или бочонковидное, с оболочкой сложного строения (1).

В связи с достаточно неспецифичными клиническими проявлениями энтерита криптоспоридиозной этиологии, его следует отличать от энтеритов инфекционной природы, определять ведущую роль возбудителей в их возникновении. Л. А. Небайкиной (2001) (11) предложен способ ориентировочного выявления ведущего возбудителя энтерита в окрашенных по Грамму мазках-отпечатках со слизистой оболочки кишечника телят (таблица 1).

Таблица 1.