Вопрос 12

Отбор патматериала, консервирование, составление сопроводительного документа, доставка материала.

В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза зависит, прежде всего, от соблюдения требований и правил отбора, транспортировки, хранения патологического материала, правильности его подготовки к исследованию и выбора методов и методик исследования.

Для проведения лабораторных исследований от больных, павших или вынужденно убитых животных отбирают патологический материал с учётом патогенеза предполагаемой болезни (входные ворота, пути диссеминации в организме, органы-мишени репродукции вируса, пути выделения и клинические признаки).

Патологическим материалом следует считать материал, полученный от больных или павших животных, в котором предположительно находится возбудитель (вирус), который вызвал заболевание, или антитела, как результат иммунного ответа.

От больных животных, подозрительных в заражении вирусом, отбирают различные виды патологического материала:

• смывы, соскобы берут ватно-марлевым тампоном или жёстким одноразовым зондом со слизистых оболочек носа, конъюнктивы глаз, ротовой полости, задней стенки глотки, половых органов, прямой кишки, клоаки у птиц (например, при подозрении на вирусные пневмоэнтериты КРС, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, грипп птиц и др.) и помещают во флакон с транспортной средой (физиологический раствор, рН 7,0-7,2) с антибиотиками.

• поражённые участки кожи и слизистых оболочек (например, при подозрении на оспу – стенку папул или корочки; на ящур – стенку афт; на кожную форму чумы плотоядных - стенку папул или пустул);

• фекалии непосредственно из прямой кишки (например, при подозрении на ротавирусную или коронавирусную инфекции и др.);

• кровь цельная для выделения вируса (например, при подозрении на лейкоз КРС и др.);

• кровь для получения парных проб сыворотки крови для обнаружения и определения титра антител (первую пробу берут в острый период болезни (в начале болезни), вторую – через две недели в период выздоровления), которые исследуют в лаборатории одномоментно после доставки второй пробы.

От трупов, подозрительных в заражении вирусом, отбирают кусочки различного патологического материала весом не более 5-10 грамм:

• паренхиматозных органов (печень, селезёнка, почки);

• региональных лимфоузлов;

• изменённых органов и тканей;

• органов и тканей, в которых можно обнаружить вирус (например, при инфекционном ринотрахеите КРС – абортплоды, плодные оболочки; при болезни Ауэски и ньюкаслской болезни – головной мозг; при бешенстве – голова целиком; при классической и африканской чуме свиней – лёгкие и т.д.).

Патологический материал отбирают с учётом следующих правил: от больных животных в острый период болезни на фоне выраженных клинических симптомов, от павших и вынужденно убитых: не позднее одного - двух часов с момента гибели или убоя («правило времени»); из тех органов, где развивался патологический процесс, с учётом тропизма вируса («правило места»). При отборе должны быть соблюдены правила асептики и антисептики (используют одноразовый или стерильный инструментарий, контейнеры с этикетками, на которых указывают вид материала и вид или инвентарный номер животного, растворы антибиотиков широкого спектра действия и противогрибковых препаратов); доставляют в лабораторию с нарочным и сопроводительным письмом не позднее 4-х часов после взятия в термосе со льдом или хладагентом, а также можно использовать консервирующие растворы (например, 50% раствор глицерина на физ.растворе) для кусочков органов и тканей. Патматериал, доставленный в лабораторию, условно считают первичным, т.е. полученным непосредственно от больных или павших животных подозрительных на вирусную болезнь.

Пробы рекомендуется как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедле­ние процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечива­ют низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, надо помес­тить в термос с охлаждающей смесью. В качестве охлаж­дающей смеси можно взять смесь равных частей сухого льда (твердой углекислоты) и этилового спирта (температура минус 71°С держится несколько дней). Можно использовать смесь, со­стоящую из трех массовых частей льда или снега и одной массо­вой части поваренной соли. В последнем случае удается полу­чить температуру минус 15°С - минус 20°С. Вместо заморажива­ния можно использовать для консервирования химические сред­ства (менее эффективно). Лучшим из последних считается смесь равных объемов стерильных глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор), в которую и помещается патматериал. Обычно эту смесь используют для консервирования кусочков паренхиматозных органов и тканей. Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведенном виде. Употребление глицерина делает невозможным исследование патологического материала ме­тодом иммунофлюоресценции. Поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направлять мазки-отпечатки, приготов­ленные и фиксированные на предметном стекле, для исследова­ния в люминесцентном микроскопе.

Для гистологических исследо­ваний кусочки органов чаще консервируют в 10%-ном растворе фор­малина.

Патматериал должен быть снабжен надежной и четкой эти­кеткой, недопустимо делать надписи карандашом по стеклу. На пробирке или флакончике достаточно надежна этикетка из лей­копластыря, на которой написано простым (графитным) каран­дашом, какой материал и от какого животного получен. На тер­мос с пробами патматериала навешивают бирку из картона или фанеры, на которой указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос должен быть опечатан. Взятый матери­ал с сопроводительным документом, содержащим полную ин­формацию о животном, от которого взяты пробы, эпизоотологические данные хозяйства, предположительный диагноз и меры, принятые для ликвидации болезни (лечение, вакцинации и т. д.), а также дату и фамилию врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лаборатор­ных исследований. Доставленные в лабораторию пробы реко­мендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных жи­вотных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование от­кладывается, материал необходимо хранить при температуре минус 40°С - минус 70°С. Большинство вирусов быстро разру­шается в крови, спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носоглотки, а вирус парагриппа крупного рогатого скота и респираторно-синцитиальный вирус быстро погибают при за­мораживании, поэтому успех выделения их зависит от быстроты исследований. Если не известно, что исследуемое ин­фекционное заболевание было вызвано вирусом, часть материала отдают для бактериологического и микологи­ческого исследований.