Литература / Albert_Izbiratelnaya_toxichnost_Tom_2_1989

SELECTIVE

TOXICIТY

Thephysico-chemicalbasisof therapy

SEVENTH EDITION

ADRIEN ALBERT

D.Sc. (Lond.), Ph.D. Medicine (Lond.), Fellow ofthe Australian Academy ofScience

Proftssoт Emtritus, DtJIOrtmmlrifChnnist,y, Austтalian National Univmi9, Canhtrra;

Rtstarch Pт(![tssor, Department(!/ Phaтmacological Scitntts, School(!/ Medicint,

State Univmi!, rifNew Yor~,Sto111Brook,

Chapman and Hall

А.АЛЬБЕРТ

ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ

токсичность

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТЕРАПИИ

В 1 ТОМАХ

том 2

Перевод с английского

канд. хим. наук

М. д. ДУМПИС, М. &. rдНИНОА

Под редакцией

проф. В. д. ФИЛОВд

МОСКВА« МЕДИЦИНА» 1989

ББК 52.8

А56

Удк 615.2/.3.065

Издание рекомендовано для перевода чл.-кор. АМН СССР

lлакиным К. мl, зав. каф. фармакологни ММСИ им. Н. А. Семашко

Альберт А.

А56 Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии. Пер. с англ. В 2 томах. Т. 2. -М.: Медицина, 1989,

432 с.: ил.

ISБN 5-225-01518-2. ISBN 412-26010-7

В монографии рассмотрены современные вопросы избирательной ток­ сичности различных веществ. Во 2-м томе описано токсическое действие антиметаболитов, ферментов, витаминов и др. Рассмотрены вопросы

ионизации и ионизирующего действия отдельных веществ. Представле­

ны известные и новые лекарственные вещества, влияющие на иммунные процессы и используемые в онкологии, психиатрии, кардиологии, анесте­

зиологии и др. Освещено повреждающее и стабилизирующее действие

биологически активных веществ.

Для практических врачей, фармакологов, токсикологов, биохимиков

и химиков.

Издательство «Медицина», Москва, 1989

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 9. Антиметаболиты: аналоги коферментов и субстратов фермен-

11.5.Различные механизмы биологического действия хелатиру-

ющих агентов (введение) . . . . . . . . . 166

11.6.Уменьшение токсического действия металла в результате

11.7.Уменьшение токсического действия металлов хелатообра-

11.9.Вещества, биологическое действие которых отчасти обус-

АД

АДФ

АМФ

АТФ

АХ

АХЭ

воз

ГАМК

ГТФ

ГЭБ

дмдк

ДНК

ДГФК

ДГФР

ИТФ

комт

лг

МАИР

МАО

м. Д.

МДП

МКА

МСР

МТР

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

-дезоксирибонуклеи­

-дигидрофолиевая кис­

-минимальная концент-

гические различия

ЭР

никотинамидаденин­

динуклеотид восста­

новленный

никотинамидаденин­

динуклеотидфосфат

восстановленный необратимый ингиби­

тор активного центра

ферментов

относительная молеку­

лярная масса

пара-аминобензойная

кислота

пептилдипептидаза

протонный магнитный

резонанс

рибонуклеиновая кис­

лота

-Л9-тетрагидроканна-

бинол

-тиреотропный гормон

-уридинтрифосфат

-ферментативно-

активируемый необра­ тимый ингибитор

флавинадениндинук­

леотид

Продовольственная и

сельскохозяйственная организация Объеди­ ненных Наций

фолликулостимули­ рующий гормон

центральная нервная

система

цитидинтрифосфат

электронный парамаг­ нитный резонанс

-этилендиаминтетра­ уксусная кислота

эндоплазматическиА

Глава9

АНТИМЕТАБОЛИТЫ: АНАЛОГИ КОФЕРМЕНТОВ И СУБСТРАТОВ ФЕРМЕНТОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ

В главе 2 (том 1) были рассмотрены примеры того, как

незначительные изменения химической структуры избирательно действующих токсических агентов приводят к радикальным из­ менениям их биологической активности. В настоящей главе мы подробно рассмотрим один из случаев высокой специфичности,

а именно соответствие между нормальным субстратом (или

коферментом) фермент а и агентом, ингибирующим этот фер­ мент. В предыдущих изданиях мы называли эти агенты «анало­ гами метаболитов», но с тех пор слово «метаболит» приобрело более широкое значение.

С точки зрения биохимика «метаболиты» - это полупродук­

ты метаболизма, такие как пируват-ион, жирные кислоты, кис­

лород и нуклеотиды. Тем не менее многие фармакологи исполь­

зуют это слово для обозначения продуктов распада ксенобио­

тиков (инородных веществ). В настоящей книге под «антимета­

болитами» мы будем иметь в виду аналоги коферментов и суб­ стратов ферментов, обладающие антагонистическим действием.

Такие вещества называют также «ингибиторами метаболитов».

9.0. Ферменты

Благодаря процессам роста и деления клетка находится в состоянии непрерывной химической активности. В большинстве

случаев эта активность принимает форму химической реакции

между ферментом и субстратом, при этом ферменты остаются

неизменными, а субстраты превращаются в другие вещества в

результате разрыва или образования ковалентных связей. Даже

органические коферменты в процессе функционирования подвер­

гаются подобным изменениям, например никотинамидаденинди­

нуклеотид сначала присоединяет, а затем отщепляет атом

водорода от атома углерода в положении 4. Аналогично дифос­

фотиамин сначала присоединяет ацетильную группу в положе­ ние 2, а затем теряет ее.

Некоторые из коферментов («кофакторов») представляют

собой неорганические катионы, большинство же является про­

стыми органическими молекулами. Однако многие ферменты не нуждаются в коферментах. Органические коферменты синтези-

руются либо в данном организме, либо в другом, а затем попадают в первый с пищей. Белковая часть фермента, содер­

жащая кофермент, называется апоферментом. К субстратам

относится либо сама пища, либо простые молекулы, образую­ щиеся из нее под действием разрушающих или синтезирующих

ферментов. Известно более 2000 разных ферментов. Многие из

них получены в чистом виде с помощью электрофореза или еще более эффективным методом - афинной хроматографией

[Dixon, Webb, 1979]. Число ферментов значительно возрастает, если включить в их ряд еще и изоферменты (разд. 4.2). Неко­

торые ферменты представлены в клетках лишь несколькими молекулами, другие вообще отсутствуют, но в нужный момент их синтез начинается благодаря наличию соответствующей ин­ формации, заключенной в ДНК. В то же время известны и

такие ферменты, которые составляют по крайней мере 50% су­

хого веса клетки, примером может служить миозин (аденозин­

трифосфатаза) в мышечных клетках.

До недавних пор очистка ферментов обычными методами

занимала много времени, а выход чистого фермента был неве­

лик. Появление афинной хроматографии позволило резко уско­

рить этот процесс и повысить его эффективность. При этом специфический ингибитор данного фермента связывается кова­

лентно с полимерным адсорбентом с помощью подвижного

мостика, например группы СН2СН2. Связанный фермент с инги­

битором накапливается в колонке, с которой затем его легко

синтезировали как в растворе, используя классические методы

Для установления структуры ферментов наиболее успешно

применяют метод рентгеноструктурного анализа. Самые точные результаты были получены с использованием аппаратуры с вы­

соким разрешением (до ~0,2 нм), несмотря на то, что это дос­

таточно дорого и занимает немало времени даже при наличии

самой современной компьютерной техники. Этим методом уда­

лось установить строение примерно 100 ферментов.

9.0.1. Конформационная адаптация фермента к субстрату

Для того чтобы подчеркнуть способность субстратов и ко­

ферментов изменить конформацию ферментов (и наоборот),

К.oshland (1964) ввел термин «наведенное соответствие». Резуль­

таты рентгеноструктурного анализа самих ферментов в сравне­

нии с данными, полученными для комплекса фермента с мед­ ленно реагирующим субстратом или коферментом, подтвердили эту гипотезу. Так, например, было установлено, что апофермент

лактатдегидрогеназы значительно деформируется в присутствии

своего кофермента НАД; кроме того, этот фермент, плотно

скрученный, в нормальном состоянии был распрямлен с по­

мощью апофермента [Adams et al., 1970]. Еще раньше отмеча­

лось, что при образовании связей с активными центрами лизо­ цима конформация остатка ацетилглюкозамина переходит из

формы «кресла» в форму «полукресла» [Blake et al., 1967].

В настоящее время известно, что активные центры фермента обычно состоят из двух или более аминокислотных остатков, расположенных в разных участках полипептидной цепи фермен­ та. Например, для действия содержащегося в яичном белке фермента лизоцима на его субстрат в стенке бактериальных клеток (муреин, см. рис. 5.3, т. 1) необходимо, чтобы сблизи­ лись остатки 35 и 52 (глутаминовая и аспарагиновая кислоты

соответственно) из разных ветвей фермента [Phillips, 1966]. Тре­

для большинства ферментов.

С помощью рентгеноструктурного анализа было показано,

что дрожжевая гексокиназа состоит из двух долей, образую­

щих полость, в которую и попадает субстрат - глюкоза. При этом происходит смещение полипептидного остова фермента на 0,8 нм: две доли фермента смыкаются вокруг субстрата так,

что снаружи остается лишь гидроксиметильная группа у атома

С6 глюкозы [Steitz, Shoham, Bennett, 1981].

Уплотнение структуры фермента при взаимодействии с суб­

стратом часто происходит и при связывании его с ингибиторами.

Так, например, дигидрофолатредуктаза (разд. 9.3). - рецептор таких лекарственных веществ, как метотрексат (4.7), триме­ топрим (4.9) и хлоридин (4.8), легко гидролизуется протеолити­

ческими ферментами в отсутствие этих препаратов [Burchall, 1966; Hakala, 1966]. Следующие примеры конформационной

адаптации (наведенного соответствия), каждый из которых

обладает совершенно индивидуальным механизмом, позволяют

показать единую природу этого явления (рис. 12.2). Рибонук­

леаза образует компактную структуру, гидрофильную снаружи

и липофильную внутри, со щелью для захвата субстрата. В ак­

тивном центре His-12 и His-119 располагаются рядом [Kartha, Bel\o, Harker, 1967]. Размеры сложенной молекулы рибонуклеа­

зы примерно 3Х3Х3,8 нм (ОММ 15000). При насыщении суб­

стратом, например цитидинфосфатом, один остаток гистидина

образует связь с фосфатной группой, а другой - с сахаром. Аналогична третичная структура а-химотрипсина: в активном центре Ser-195 и His-57 из разных ветвей фермента располо­

жены поблизости друг от друга [Matthews et al., 1967]. Гидрок­

сильная группа серина участвует в алкоголизе пептидной свя­ зи, приводящем к образованию сложного эфира, который затем

подвергается гидролизу, катализируемому имидазольным цик­

лом гистидинового остатка.

Результаты рентгеноструктурного анализа с использованием ингибиторов фермента показали, что активный центр карбоан­

гидразы че:~овека расположен в полости глубиной 1,2 нм, на

дне которои находится атом цинка, окруженный тремя гисти­

диновыми остатками (His-94, His-96 и His-119) и одной молеку­ лой воды. В активном центре происходит связывание углерода

0,2 нм) было изучено строение карбоксипептидазы А, важного

фермента поджелудочной железы, гидролизующего только пеп­

тиды с гидрофобными боковыми цепями. Было обнаружено, что

глубокой липофильной полостью. Он связан с тремя аминокис­

лотными остатками His-69, His-196 и G\u-72. Фермент состоит

из 307 аминокислотных ферментов и имеет ОММ 34 500. Срав­

нение «контурных карт» фермента в присутствии и в отсутствие

субстрата (глицилтирозина), припятствующего гидролизу, пока­

зало, что фенильная группа попадает в глубокую полость, вы­

нуждая карбонильный атом кислорода пептида (субстрата)

расположиться напротив атома цинка, теряющего при этом мо­

лекулу координационной воды. Свободная карбоксильная груп­

па субстрата образует ионную связь с Arg-145, что вызывает

смещение аргинина на 0,2 нм и соответственно разрыв близле­

жащих водородных связей. Эти изменения приводят к повороту свободной гидроксильной группы Tir-248 на 120 °С. При этом она входит в небольшое углубление, расположенное рядом с

пептидной связью субстрата, и, вероятно, выступает в роли

общего кислотного катализатора, участвующего в протониро­ вании уходящей группы. Атакующим нуклеофилом в этом слу­

чае является, по-видимому, карбоксильная группа остатка

Glu-270 [Lipscomb et а\., 1969; Lipscomb, 1970; Breslow, Wernick.

1977]. Все эти изменения представлены на стереодиаграмме

(рис. 9.1). Структуру гликопротеина - нейраминидазы вируса

гриппа - установили с помощью рентгеноструктурного анализа

[Varghese, Laver, Co\man, 1983].

Точная информация об активных центрах ферментов, полу­

чаемая с помощью рентгеноструктурного анализа, сделала бес­

смысленными умозрительные схемы, до недавнего времени час­

то встречавшиеся в литературе по энзимологии. С достаточной

уверен~остью можно полагать, что это же в скором времени произоидет и со схемами строения рецепторов лекарственных

веществ (см., например, рис. 12.3).

9.0.2. Секвенирование

Последовательность аминокислот в молекуле фермента ред­

ко удается установить полностью с помощью рентгеноструктур­

ного анализа. Быстрее и точнее это можно сделать путем сек-

Рис. 9.1. Стереодиаграмма активного участка карбоксипептидазы А. Субстрат

(не показан) связан с цинком (Zп2+) и тремя аминокислотными остатками: His-69, Glu-72 и His-196. Остаток Glu-270, участвующий в последней стадии

гидролиза, изображен в положении, которое он занимает, перед тем как оста-

ток Arg-145 сдвигает его на 0,2 нм [Lipsomb, 1970].

венирования. Хотя оно и не позволяет получить информацию непосредственно об активных центрах ферментов, тем не менее это удается в тех случаях, когда реагент может образовывать

ковалентную связь с одной из групп активного центра. В каче­

стве субстратов для изучения протеолитических ферментов час­

то используют органические фосфаты (разд. 13.3). Так, диизо­

пропилфторфосфат (13.26) взаимодействует с химотрипсином

как псевдосубстрат и, фосфорилируя активный центр, делает невозможной реакцию с истинным субстратом. Было установле­ но, что в каждой молекуле фермента одна молекула ингибитора

взаимодействует с одним активным центром. В результате

гидролитического расщепления фермента, обработанного диизо­

пропилфторфосфатом, образуется диизопропилфосфосерин. Это

позволяет сделать вывод о том, что остаток серина играет важ­

ную роль в активном центре данного фермента [Shaffer, Мау,

Summerson, 1954]. Подобный анализ продуктов расщепления показал, что в активных центрах химотрипсина (каждая его

молекула содержит 230 аминокислот, 28 из которых являются

остатками серина) и трипсина расположена последовательность

Дополнительную информацию об активных центрах фермен­

тов получают с помощью молекулярных зондов (разд. 2.4).

9.0.3. Кинетика ферментативных реакций

Жизненно важная роль ферментов в метаболизме заключа­

ется в том, что они ускоряют бесчисленное множество химиче­

ских реакций, протекающих в клетке. Ферменты снижают энер-

гетический барьер и тем самым повышают скорость протекания реакции. Например, с помощью фермента каталазы энергия

активации реакции разложения перекиси водорода (Н2О2 --+ -+- Н20+ О) снижается с 18 до 2 ккал/моль, а скорость реак­ ции увеличивается в 1,6Х 1011 раза.

Высокая каталитическая активность ферментов основана на

общих принципах физической и органической химии: а) моле­

кула субстрата взаимодействует с ферментом с изменением

конформации одного из них или обоих, при этом образуется

переходное состояние, более энергетически выгодное по срав­

нению с субстратом; б) затем фермент может инициировать раз­

рыв ковалентной связи вследствие близости реагирующих групп; в) этому способствует электрическое поле, поддерживающееся в очень малом объеме в необычно безводной среде, т. е. с низ­ кой диэлектрической постоянной и г) боковые цепи аминокис­

лотных остатков, расположенные в полости вокруг активного

центра, могут образовывать короткоживущие связи, способст­

вующие протеканию реакции. В бимолекулярных реакциях на

ферменте создается значительно более высокая концентрация

субстратов, чем в растворе, при этом они находятся ближе друг к другу и лучше ориентированы. Ферменты обладают двумя типами специфичности: 1) разной степенью сродства к субстра­ там и 2) разной скоростью реакции для различных субстратов после связывания. Эти типы называются специфичностью свя­

зывания и кинетической специфичностью и проявляются незави­

симо друг от друга [Koshland, Neet, 1968].

Первым выделенным комплексом субстрата с ферментом

был комплекс О-аланин, оксидаза О-аминокислоты и кофактор

ФАД (флавинадениндинуклеотид). Этот комплекс представляет

собой гексагональные кристаллы пурпурного цвета, стабильные в отсутствие воздуха. Исследования методом ЭПР показал11, что в этих кристаллах кофактор присутствует в свободноради­

кальной моногидроформе FAOH [Yagi, 1965].

9.0.4.Простые модели ферментов

Все известные ферменты - это белки. Однако для изучения механизмов их действия и установления природы их высокой специфичности в отношении и продуктов и субстратов были созданы модельные соединения небелковой природы. Основой

для них послужил гистидин, встречающийся в активных цент­

рах многих ферментов. Наиболее важной функциональной груп­

пой гистидина является имидазольное кольцо (9.1), величина

РКа которого близка 7. Это позволяет ему выступать в роли как

донора протона, так и его акцептора. Имидазол и особенно

4' - (имидазол-4-ил) масляная кислота (9.2) значительно уско­

ряют гидролиз сложных эфиров по механизму обычного кислот­ l!О-основного катализа [Bruice, Benkovic, 1966].

По свойствам наиболее близки ферментам циклодекстрины (циклоамилазы), получаемые при расщеплении крахмала [Cra-

mer, 1956]. Циклодекстрины действуют как эффективные эсте­

разы, субстратами которых служат фенилацетат и его произ­

водные. По данным рентгеноструктурного анализа молекулы

циклодекстринов представляют собой тор из шести остатков

а-О-глюкозы в обычной конформации. Гидроксильные группы

образуют короны вокруг верхней и нижней части тора, внутрен­

нии диаметр которого составляет около 0,5 нм. При гидролизе

карбонильная группа ацетата («гость») приближается к вторич­

ным гидроксильным группам циклодекстрина («хозяин»): чем

теснее этот контакт, тем быстрее проходит гидролиз. Сложный

эфир («гость») ацилирует одну из гидроксильных групп «хо­

зяина», высвобождая при этом фенол. Затем в результате реак­

ции внутримолекулярного катализа происходит регенерация цпклодекстрина в неацилированную форму. Процесс при этом

может повторяться неограниченно. Этот цикл реакций напоми­

нает ферментативные превращения еще и тем, что он подчиня­

ется кинетике Михаэлиса -Ментен (разд. 9.1) и легко ингиби­

руется нормальными субстратами [Bender, Komiyama, 1978].

Ковалентным присоединением двух имидазольных групп к

циклодекстрину можно получить искусственную рибонуклеазу.

имеющую достаточно высокую специфичность в отношении как

субстрата, так и продукта [Breslow, 1983]. Присоединяя кова­

лентно к циклодекстрину пиридоксамин, можно получить син­

тетическую трансаминазу. Эти модельные соединения вызывают

ускорение соответствующих реакций в 200 раз, однако в бли­

жайшем будущем можно надеяться на значительно большее

увеличение скорости [Breslow, 1983].

Исследования этих модельных соединений и данные рентге­

ноструктурного анализа природных ферментов показали, что

для гидролиза необходимы сближение нуклеофильной группы

(аниона глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или

имидазола) с электрофильным центроматомом углерода кар­

бонила амидной группы и одновременный подход протона к

атому азота этой же группы. На циклодекстриновых моделях

было установлено, что ферментативноподобная активность мо­ жет быть свойственна веществам с ОММ несколько ниже 1000,

имеющим простую структуру и симметрию. Более подробные

сведения о моделях ферментов можно получить из работ Jencks ( 1969) и Bender, Komiyama ( J978). В литературе есть данные

осинтезе микроцикла, ускоряющего ацетилирование аминокис­

лот в 1011 раз [Cram, 1983].

Действие ферментов в значительной степени зависит от ми­

целл амфифильных молекул, катализирующих многие химиче­

ские реакции и нередко рассматриваемых как очень простые

модели ферментов (определение понятий «амфифильный» и «мицелла» приведено в разд. 14.О). Расположение гидрофобных

(внутри) и гидрофильных (снаружи) групп в мицелле напоми­

нает расположение этих групп в молекуле фермента. Подобно ферментам мицеллы денатурируют нагреванием или действием мочевины; как и ферменты, они обладают избирательностью

по отношению к субстратам [Jencks, 1969]. Реакции, сопровож­

дающиеся высвобождением анионов, такие как гидролиз слож­

ных эфиров, катализируются катионными мицеллами, например мицеллами цетилтриметиламмоний бромида ( 14, 16) [Menger, Portnoy, 1967]. Субстрат концентрируется в мицелле. При этом образуются ван-дер-ваальсовы связи, о чем свидетельствует

повышение эффективности катализа при увеличении размеров молекул субстрата. Заряженные группы мицеллы создают заряд в среде, окружающей субстрат (это окружение может стабили­ зировать переходное состояние субстрата); предполагается, что фактически они и являются катализаторами. Низкая ди­

электрическая постоянная остальной части мицеллы может

приводить к дестабилизации любого заряда на субстрате, его

переходном состоянии и продуктах.

Эффективность мицеллярного катализа иллюстрирует доде­

цилсульфат натрия, ускоряющий связывание ионов Cu2+ пор­

9.0.5. Биологическая регуляция ферментов

Ферменты, функционально связанные друг с другом в соот­

ветствии с последовательностью метаболических процессов, либо

образуют частицы, либо встраиваются в мембраны. В этих сис­

темах ферменты соединяются химически, термодинамически или

чисто физически. При этом продукт первой ферментативной:

реакции является субстратом второго фермента и т. д. Такие последовательности ферментов часто регулируются аллостери­ ческим эффектом, суть которого заключается в следующем: у ферментов, катализирующих начальные реакции в цепи мета­

болических превращений, может быть второй рецептор (на не­ котором расстоянии от активного центра), способный реагиро­ вать с природным ингибитором (часто это продукт фермента­ тивной реакции в одной из поздних стадий метаболических превращений). В результате этого взаимодействия молекула фермента претерпевает конформационные изменения, благодаря которым нормальный субстрат не может связаться с активным нснтром. Подобный механизм обратной связи играет важную

15

роль в саморегуляции метаболических процессов в клетке [Monod, Chaпgeux, JасоЬ, 1963]. Показано, что присутствие природ­

ных пуринов в живой клетке может ингибировать их синтез до

тех пор, пока их концентрация не упадет ниже нормального

уровня. Подобный контроль с обратной связью был продемон­

стрирован также на примере синтетических и природных пири­

мидинов [Bresnick, Hitchings, 1961]. Схема регуляции синтеза

катехоламинов по механизму обратной связи приведена на

рис. 9.2. Подробнее об аллостерической регуляции см. Cohen

( 1980).

9.0.6. Ферменты и лекарственные вещества

Ценность многих лекарственных веществ избирательного

действия заключается в их способности ингибировать опреде­ ленный фермент. Однако в каждом конкретном случае необхо­ димо убедиться в том, что: а) фермент в контактной клетке ингибируется также эффективно, как и в изолированном состоя­ нии in vitro; б) концентрации агента, необходимые для ингиби­ рования фермента, не превышают обычно используемые для

фармакологического действия на клетку [Hunter, Lo,vry, 1956].

Основываясь на этих стандартных требованиях, удалось по­

казать, что в основе биологического действия органических

фосфатов, а также уретанов, лежит их способность ингибиро­

вать АХЭ, а действие оксимов, являющихся антидотами, заклю­

чается в том, что они снимают такое ингибирование (разд. 13.3).

Большинство широко используемых и представляющих поэтому

наибольший интерес агентов, способных подавлять действие ферментов, обнаруживают близкое сходство с субстратом или

коферментом как по структуре, так и по характеру распределе­

ния электронов в молекуле. Такие вещества называются анти­ метаболитами.

О ферментах см. Williams (1969); Dixon и Webb (1979);

Boyer ( 1970-1983). В разделе 4.2 обсуждаются изоферменты и

изофункциональные ферменты. Классификацию ферментов см.

вIпternational Union of Biochemistry ( 1978).

9.1.Антиметаболиты: определение, происхождение

имеханизм действия

Биологические эффекты метаболитов (субстратов или ко­

ферментов), находящихся в незначительных количествах в клет­

ке или ткани, могут быть подавлены действием их аналогов, называемых ан т и м е та б о л и та ми. В молекуле каждого из

таких аналогов имеется участок, подобный участку метаболита, обеспечивающему взаимодействие аналога с ферментным бел­

ком. Для того чтобы аналог был эффективным, он должен

иметь сходство с метаболитом не только в размерах, но и в рас­ пределении электронов, так как активные центры ферментов,

как правило, высокополярны. Антагонизм между аналогом и

метаболитом обусловлен тем, что антиметаболит занимает и блокирует активные участки фермента, обычно используемые

метаболитом (разд. 9.2).

Хотя метаболит может быть превращен в аналог изменением

действие, но не приобретет антагонистического. Так разнообраз­

ные модификации структуры тиамина путем присоединения

дополнительной или отщепления имеющейся метильной группы

снижают его активность как витамина, но не делают его анта­

гонистом (глава 2). В целом, потеря или приобретение метиль­ ной группы молекулой метаболита - слишком большое измене­ ние, чтобы он стал антагонистом, по крайней мере в случае

небольших молекул, в которых измененный участок обычно на­

ходится внутри или очень близко к активному участку фермен­ та. Целесообразнее сохранять стерические свойства метаболита

(чтобы обеспечить связь с ферментом), но варьировать его

электронные свойства (чтобы сделать новое вещество не под­ ходящим для фермента в качестве субстрата).

Некоторые антагонисты имеют такую простую химическую

природу, что их способность выступать в роли аналогов ме­ таболитов часто остается незамеченной. Например, одни неорга­

нические катионы конкурируют с другими (разд. 9.2 и 11.0).

Даже ион водорода (по утверждению Митчелла' один из наи­ более важных метаболитов) участвует в конкуренции с органи­

ческими и неорганическими катионами (разд. 10.3.1) [Mitchell, 1979]. Этиловый спирт, входящий в состав алкогольных напит­

ков, действует частично за счет конкуренции с водой (по край­

ней мере при распределении). Он может также снимать токси­

ческое действие метилового спирта, вытесняя его с окисляющего

фермента [Rбе, 1955].

Известен ряд примеров конкуренции между простыми анио­ нами. Так, перхлорат- и тиоцианат-анионы ингибируют накоп­ ление йодид-иона в щитовидной железе без сколько-нибудь заметного нарушения окислительного включения йодид-иона в

тироксин [Stanbury, Wyngaarden, 1952]. Таким же образом спо­

собность бактерий Nitrobacter окислять нитриты в нитраты ин­ гибируется цианатили перхлорат-анионами: эффект последних

легко снимается простой отмывкой [Lees, Simpson, 1957].

1 В соответствии с хемиосмотической концепцией Митчелла градиент про­

тонов является единственной причиной перемещения электронов при синтезе

АТФ.

Некоторые физиологические процессы регулируются парами

метаболитов-аналогов. К последним, например, относятся по­

.лиеновые половые гормоны водорослей [Kuhn, 1940] и половые

гормоны млекопитающих. Из двух простагландинов, содержа­

щихся в легких человека, PGE 2 расслабляет, а PGF2a сокращает мускулатуру бронхов. Таким же образом простагландин D1 ин­

гибирует увеличение проницаемости сосудов, вызываемое в

коже крыс простагландинами Е1, Е2 и D2 [Flower, Юngston,

1975]. Другая пара химически сходных регуляторов - это простациклин и тромбоксан у человека. Простациклин - наибо­ лее сильный ингибитор агрегации тромбоцитов и мощный вазодилататор, в то время как тромбоксан обладает противопо­

.ложными свойствами. Однако оба вещества образуются из од­

ного и того же предшественника - простагландина эндоперок­

сида (разд. 4.7).

Известно лишь несколько примеров антагонистов, созданных

изменением расположения групп у асимметрического атома

углерода. Одним из таких антагонистов является О-гистидин,

ингибирующий фермент гистидазу, которая в норме размыкает

имидазольное кольцо L-гистидина [Edlbacher, Baur, Becker, 1940]. Этот метод резко эффективен в применении к небольшим

молекулам, вероятно, потому, что пространственное соответствие

субстрата - метаболита, необходимое для адсорбции его фер­

ментом, слишком резко нарушается при перемещении замести­

телей. Гораздо чаще обнаруживается, что если (+)-изомер

оказывает сильное физиологическое действие, то (-)-изомер

обладает такого же рода действием, но значительно более сла­

бым. Другими словами, он редко является антагонистом.

По этой причине активность смеси двух оптических антиподов

(или рацемата) обычно близка среднеарифметическому актив­ ности их обоих (например, в случае тироксина, атропина и DL-норадреналина). Применение неприродных оптических изо­

меров для создания лекарственных полипептидов оказалось по­

лезным для защиты последних от действия желудочного сока

пациента (см. аналоги энкефалина в разд. 12.8).

Надежный метод создания антагонистов для большой моле­

кулы заключается в использовании малой молекулы, сходной с повторяющимся фрагментом структуры большой молекулы.

Так, крахмал гидролизуется ферментом амилазой до мальтозы,

представляющей собой ангидродимер глюкозы. Этот фермент

активно ингибируется глюкозой, хотя и не образуется при

гидролизе. Галактоза - стереоизомер глюкозы - менее сильный

ингибитор амилазы, а фруктоза - изомер глюкозы, но не стерео­

изомер, вообще не оказывает ингибирующего действия [Wohl,

Glimm, 1910].

Антагонистами небольших по размеру молекул могут быть

их ближайшие гомологи, например малоновая кислота (9.3) -

ингибитор окисления яптарной кислоты (9А) сукцинатдегидро­

геназой [Quastel, Wooldridge, 1927].

18

Другой путь создания антагонистов-аналогов - это замена

атомов в цикле, входящем в молекулу метаболита. Так, пири­

тиамин (9.5), получаемый заменой атома серы в молекуле тиамина (2.1) этиленовой группой, вызывает характерный симп­

том недостаточности тиамина у мышей [Woolley, 1950]. Замена

тиазольного кольца пиридиновым кажется логичной вследствие

их изостерности (по аналогии с тиофеном и бензолом) [Hartough, 1952]. Показано, что пиритиамин вытесняет тиамин с

фермента, обычно фосфорилирующего его с образованием тиаминпирофосфата - кофермента пируватдегидрогеназы. К со­

жалению, пиритиамин не оправдал надежд в качестве лекарст­

венного препарата, однако модификация его структуры привела

к получению ампролиума (9.37), успешно используемого для

лечения протозойных болезней птиц.

Целесообразен и противоположный путь - замена этилено­ вого фрагмента серой, например превращения фенилаланина

в тиенилаланин - сильный антагонист этой аминокислоты у

микроорганизмов [Dittmer, 1949]. Подобная замена бензольного

кольца тиофеновым эффективна и во многих других случаях.

Например, а-тиенилалкиламины похожи на соответствующие

фенилалкиламины по гипертензивной активности, а аминоалки­ ловые эфиры тиофен-2-карбоновой кислоты обладают сходным с соответствующими эфирами бензойных кислот местноанесте­

зирующим действием [Hartough, 1952].

Один из лучших общих методов создания антагонистов -

замещение одной электроноакцепторной группы другой. Так,

карбоксильная группа (-СООН) может быть замещена груп­

пами -СОСН3, -SO 2OH или -SO 2NH 2. Однако при заменах такого рода необходимо сохранять степень ионизации основной

группы, если таковая имеется в молекуле. Так, например, ами­

ногруппа в анионе пара-аминобензойной кислоты (ПАБ, 9.7) не ионизирована и, следовательно, замещение карбоксилатной

группы сульфогруппой неприемлема, так как основная амино­

группа в присутствии последней превратилась бы в протониро­

ванную аммониевую группу и новое вещество отличалось бы от

2* 19

Т а б л и ц а 9.1. Ваи-дер-ваальсовы радиусы некоторых заместителей в аита­ rоиистах метаболитов [Speakman, 1968]

оо, 14

исходного слишком резко, чтобы быть эффективным антимета­

болитом. Эксперименты свидетельствуют о правильности этого предположения. С другой стороны сульфаниламидный анион (9.8) оказался неплохим антагонистом аниона ПАБ (9.7)

{разд. 9.3).

Эффективные антагонисты были получены заменой водоро­

да фтором (присутствие которого в этих антагонистах приводит

к обратимой блокаде метаболизирующих ферментов ЭР), напри­

мер, синтетические антагонисты андрогенов и кортикостероидов

[Gilman, Goodman, Gilman, 1980], противораковый препарат­

фторурацил (4.0.2) и фунгицид - флуцитозин (4.23). Ряд по­ добных препаратов применяют в медицине, но замена лимонной

кислоты на фторлимонную недопустима из-за высокой токсич­ ности последней (разд. 13.5).

Нередко целесообразна замена метильной группы хлором.

Примером могут служить антагонисты рибофлавина [Kuhn, Weygand, Moller, 1942]. Данные табл. 9.1 подтверждают пра­

вильность предположения о том, что такие изменения стериче­ ски оправданы, и позволяют понять, почему замещение атома

водорода на атом хлора или метильную группу обычно не при­

водит к получению эффективных антагонистов. Общим требо­

ванием при конструировании аналогов этого типа является их

сходство с субстратом настолько, чтобы фермент, ошибаясь,

использовал эти чужеродные молекулы вместо субстрата. В то

же время антагонисты должны в достаточной степени отличать­

ся от метаболита, чтобы, связавшись с ферментом, не вступать

в химическую реакцию, которой в норме подвергается субстрат

под действием фермента. Если же он в нее все-таки вступает,

то образующийся продукт не должен взаимодействовать с фер­

ментами, участвующими в дальнейшей цепи биохимических

превращений нормального субстрата.

Антагонисты можно получить удалением из молекулы мета­

болита некоторых небольших групп, подвергающихся ковалент­

ным превращениям в процессе нормального метаболизма. Так,

дезоксипиридоксин [ (9.6), R = СН3] вызывает у человека симп­

томы витаминной недостаточности пиридоксина, которые легко снимаются при введении последнего [ (9.6) R = СН20Н] [Mueller,

Vilter, 1950]. Дезоксипиридоксин становится биологически ак­

тивным в организме только после фосфорилирования с образо­

ванием производного, конкурирующего с пиридоксальфосфа­

том - коферментом декарбоксилазы аминокислоты.

Очевидно, антагонист может быть найден для молекулы лю­ бой величины. Например, ацетилирование тиреотропного гормо­

на (ТТГ) - белка, содержащегося в гипофизе, приводит к об­ разованию аналога, который накапливается в щитовидной железе и понижает гипертиреоидизм, блокируя действие ТТГ [Sonenberg, Money, 1957]. Небольшие химические изменения

других полипептидных гормонов гипофиза, таких как окситоцин

и вазопрессин, обусловливают образование антагонистов соот­

тоцина пеницилламином получают сильный антагонист этого

гормона.

В природе существует немало примеров антагонизма на по­

липептидном уровне. Полипептид контрикал (ОММ 6512), обна­

руживаемый в тканях млекопитающих в больших количествах,

подавляет гипотензивный кинин (калликреин) поджелудочной

железы и протеолитическое действие ферментов трипсина и плазмина. Он был с успехом использован при лечении панкреа­

титов [Trapnell, 1977]. Меланостатин и соматостатин - поли­ пептиды, содержащиеся в гипоталамусе, ингибируют выделение

передней долей гипофиза меланоцитстимулирующего гормона

(полипептида) и соматотропина (гормона роста, белка) соответ­

ственно.

После того как Woods обнаружил антиметаболитную приро­

ду действия сульфаниламидов на бактерии (разд. 9.3.1), нача­

лось широкое исследование других антагонистов, которые мог­

ли бы стать полезными лекарственными препаратами. Это ока­

залось неожиданно трудной задачей, поскольку полезные и

вредные клетки участвуют во многих общих биологических

процессах. В течение некоторого периода времени успех огра­

ничивался открытием лекарственных веществ, относящихся к

группе антагонистов фолиевой кислоты. Затем были обнаруже­ ны (и случайно, и целенаправленно) многие другие антагонисты

метаболитов, нашедшие применение в клинической практике

(разд. 9.4).

Сегодня трудно рассчитывать на создание эффективных ан­ тагонистов тех или иных метаболитов, если нет строгих данных

сравнительной биохимии, указывающих на участие этих мета­

болитов в биохимических процессах, протекающих только во вредной клетке. Из бесчисленного множества агентов, синтези­

рованных за этот долгий период и не обладающих избиратель­

ным действием, многие были использованы в биохимии в каче­ стве специфических блокаторов различных метаболических

процессов in vitro. Об антагонистах метаболитов см. Hochster,

Quast~l [1963-1973].