Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110

полиакриламидном геле в присутствии денатурирую щ их вещ еств: додец илсульф ата натрия или м очевины (SDS-PAGE); разделенные б елки могут визуализироваться после окраш ивания и сравниваться с эталонным и об разц ам и;

2)разделенныеб елкипереносятся сгеля путем налож ения (б лотинга) на нитроц еллю лозный ф ильтр и ф иксирую тся на нем ; во многих случаях, но не всегда, припереносесохраняю тся количественныесоотнош ения б елков;

3)на ф ильтры наносятся детектирую щ ие полиили моноклональные

антитела, содерж ащ ие радиоизотопную или ф ерментную метку; для об наруж ения связавш ихся антител применяю т такж е антивидовую меченую сыворотку, иным и словам и, на заклю чительном этане б лотинг аналогичен твердоф азным имм унологическим тестам .

С ледуетим еть ввиду, что вданной постановке имм уноб лотинга б елки находятся вденатурированном состоянии, ипоэтом ум огутнераспознаваться антителам и, спец иф ическим и по отнош ению к нативном у б елку. И мм уноб лотинг достаточно ш ироко используется висследованиях строения вирусовгепатитов, вчастности, для установления антигенногородствам еж ду отдельным и ш там мам и. В ысокая разреш аю щ ая способ ность имм уноб лотинга позволяетполучать хорош иерезультаты ивдиагностическойпрактике, когда треб уется идентиф иц ировать вирусвтканях илиэкскретах б ольного.

В описанных видах б лотингадля переносаД Н К, РН Киб елковчерез гель кмем б ранепом им о капиллярных сил (влаж ный перенос) использую ттакж е электроф орез и вакуум (полусухой и сухой перенос). П ри вестерн б лотинге, какправилоиспользую тсухойперенос.

проц едуругиб ридизац ии, выявлениеианализ еерезультатов.

С пособ ы выделения и подготовки анализируем ого об разц а нуклеиновых кислоти б елковкгиб ридизац ии м ногооб разны и определяю тся помим о ц ели

иконкретнойзадачиисследователя спец иф икойизучаемогооб ъекта.

Если м еткой является радиоактивный изотоп, то результатгиб ридизац ии выявляю т а вт ора ди огра фи ей под световым м икроскопом после проявления

прозрачной ф отоэм ульсии. В случаеиспользования ф луоресц ентно м еченых зондов см отрят свечение хром осом под лю минесц ентным м икроскопом . С ущ ествую тдвемодиф икац ии ф луоресц ентной гиб ридизац ии in situ: п ряма я флуоресц ент на я in situ ги бри ди за ц и я (direct fluorescence in situ hybridization

и ли DFISH) и неп ряма я – FISH. В последнем вариантеф луорохром ы несетне сам зонд, а б елок, имею щ ий высокоесродство крепортерной группе зонда. Г иб ридизац ия in situ позволяет устанавливать локализац ию вопределенном районе хромосом ы того или иного ма ркера . В качестве последнего м огут

42

выступать отдельный ген или его часть, некодирую щ ая б елокнуклеотидная последовательность, нетранскриб ируем ые повторяю щ иеся последовательности различной длины, м об ильные генетические элементы и т.д.

Ч асто использую т м етод дот -ги бри ди за ц и и (от англ. dot – точка). Э тот м етод применяется, когданеоб ходим о установить ф актналичия определенной нуклеотидной последовательности в исследуемых об разц ах и оц енить ее

количество. И з подходящ ейтканиисследуемогоорганизм авыделяю тсумм арную Д Н К. О б разц ы Д Н Кнаносятнамикропористую (нитроц еллю лозную или нейлоновую ) м емб рану, денатурирую т и имм об илизую т об лучением ультраф иолетом , послечегоинкуб ирую тф ильтр см еченым зондом . П риэтом на один ф ильтр м огутб ыть нанесены десятки об разц овнуклеиновых кислот, выделенных из разных б иологических об ъектов.

В некоторых случаях, когда треб уется б олее детальная инф орм ац ия о располож ении выявляемой последовательности вгеном е, применяется другая м одиф икац ия м етода м олекулярной гиб ридизац ии – блот -ги бри ди за ц и я (от англ. to blot – промакать ф ильтровальной б ум агой). В этом случае расщ епляю т об разец Д Н К на ф рагменты подходящ им и рестриктазам и и

имм об илизую т перенесенные и денатурированные ф рагменты об лучением ультраф иолетом и инкуб ирую тсм еченым зондом . П ослеотмывания ф ильтра от несвязавш егося зонда выявляю т результат гиб ридизац ии. С пособ выявления определяется тем , какую им енно репортерную группунесетзонд. Е сли взондесодерж ится радиоактивная м етка, ф ильтр втем нотенакрываю т рентгеновской пленкой, а по прош ествии определенного врем ени (от нескольких часов до нескольких суток) ее проявляю т и по засвеченным полосам определяю твф рагментах какой длины находится ком плементарная зонду нуклеотидная последовательность. Е сли зонд несет ф луоресц ентную

метку, ф ильтр ф отограф ирую твультраф иолетовом свете.

Внекоторых случаях иском ая нуклеотидная последовательность

присутствует в недостаточном для об наруж ения количестве. С одерж ание отдельных уникальных последовательностей в геном е м ож ет б ыть не-

нуклеотидного материала с помощ ью полимеразной ц епной реакц ии (П ЦР). П оследняя возмож на, еслиизвестнапервичная структура хотя б ы неб ольш ого участка(порядкасотнинуклеотидов) анализируем ойД Н К-миш ени.

4.3 Зо н ды , испо льз уемы ев гибр идиз ац ии

С ущ ествует несколько м етодом получения зондов для проведения гиб ридизац ии. С реди методовнерадиоактивного мечения полинуклеотидных зондовнаиб ольш ее распространение получили хорош о отраб отанные ранее

43

для радиоактивного мечения проц едуры удлинения затравки, ник-трансляц ии, илиполим еразнойц епнойреакц ии. В сеэтиспособ ы основаны наспособ ности

которой синтезируется зонд, после чего вреакц ионную смесь доб авляю т Д Н К-полим еразу и наб ор всех четырех дезоксириб онуклеозидтриф осф атов (дН Т Ф ), один из которых несетметку. И спользуя олигонуклеотид вкачестве

количество последовательностей Д Н К, заклю ченных м еж ду затравками. П ри повторении проц едуры денатурац ии, гиб ридизац ии и полим еризац ии получа- ю т четыре копии, а за 30 ц икловм ож но получить несколько м иллионов меченых полинуклеотидов, используем ых вкачествезондов.

называемойни к-т ра нсляц и ей (отангл. nick – разрез). В Д Н Квносятнекоторое количество одноц епочечных разрывовпутем об раб отки ф ерментом Д Н Казой. О б разую щ иеся вм естах разрезовсвоб одные3'-О Н конц ы использую тся Д Н К- полим еразой для их наращ ивания. Ф ерм ент двигается, удаляя дН М Ф с 5'- конц а стоящ его рядом ф рагм ента Д Н К. П ри этом он вклю чает врастущ ую ц епочку меченые нуклеотиды, идентичные только что отщ епленным немеченым . В результатеполучаю тмеченыеполинуклеотиды, которыем огут служ ить зондами для выявления Д Н К, первичная структура которой неизвестна.

В том случае, когдануж нополучить б ольш оеколичествонерадиоактивно меченого зонда, наприм ер, для проведения массовой диагностики, приб егаю т кхим ическим , а неф ерментативным способ ам вклю чения м етки. В Д Н К- или

45

ходеполим еразной реакц ии. И дигоксигенин и б иотин являю тся га п т ена ми , то есть антигенным и детерм инантам и, с которым и спец иф ично и прочно связываю тся соответствую щ ие антитела, конъю гированные с ф ерм ентом , об разую щ им окраш енныйпродукт, илискаким -либ оф луорохром ом .

Флуо ро хро мы . В отличиеотб иотинаидигоксигенинафлуорохромы сам и по себ е являю тся сигнальным и соединениям и. О ни способ ны излучать свет определенной длины волны при возб уж дении их б олее коротковолновым светом . Т ак, флуоресц еи н, один из наиб олее распространенных красителей, при возб уж дении ультраф иолетом с длиной волны 485 нм имеет м аксим ум испускания ввидим ой об ласти – 515 нм и светится зеленым . Т отф акт, что

гиб ридизац ией in situ. Э то невозм ож но проделать срадиоактивно меченым и

катализировать об разованиеб ольш ого числа м олекул окраш енного продукта. Ш ироко применяю т, например, п ерокси да зуи щ елочную фосфа т а зу. П ервый ф ерментвприсутствииперекисиводородаокисляетнекоторыеаром атические соединения до нерастворим ых вводе тем ноокраш енных продуктов. В торой способ ен деф осф орилировать органические соединения, которые при этом превращ аю тся вокисленныекислородом сильноокраш енныепродукты. Е сли эти ф ерм енты конъю гированы ссинтетическим и олигонуклеотидам и, то они выступаю т непосредственно как нерадиоактивные м етки. О днако их чащ е

Е сли нуж на количественная оц енка об разовавш егося продукта, то проводят

вварианте хеми люми несц енц и и . С уб страт щ елочной ф осф атазы адамантил- 1,2-диокситанф осф атпоследеф осф орилирования распадается сиспусканием

46

последовательностисб ольш ей точностью , скоростью и надеж ностью , чем их радиоактивном еченыеаналоги. П рикартированиихром осом , когдадетальное пространственное разреш ение является необ ходим ым треб ованием , зонды, несущ иеб иотин, дигоксигенин или ф луорохром ы, вгиб ридизац ии in situ не м огут б ыть заменены на м еченные радиоактивным и изотопам и. М ассовая диагностика инф екц ионных заб олеваний человека, ж ивотных и растений сегодня не об ходится б ез нерадиоактивных тест-систем , вклю чаю щ их Д Н К- или РН К-зонды. О писание диагностики некоторых наследственных патологий, выявляемых спомощ ью м етода м олекулярной гиб ридизац ии ещ е до рож дения реб енка на основе анализа геном а вклетках ам ниотической ж идкости, мож етсоставить м атериал отдельнойстатьи.