Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110

Рисунок3. Э лектроф орез нуклеиновых кислотвполиакрилам идном геле ввертикальнойкам ере.

Мет одги бри ди за ц и онныхзондов

И спользование гиб ридизац ии с внутренним и Д Н К-зондам и позволяет в рядеслучаевзначительноповысить чувствительность испец иф ичность детек-

автом атизац ии для анализа б ольш ого количества об разц ови использования

13

нейтрализац ии посторонних прим есей для получения препарата с чистотой, пригоднойдля постановкиреакц ииамплиф икац ии.

П ри использовании вкачестве м атриц ы для П ЦР Д Н К, необ ходим о

различных ж ивых об ъектов. И ногдаб ываетдостаточнопрокипятить об разец в течение 5 - 10 м инут, однако в б ольш инстве случаев треб ую тся б олее трудоем кием етоды.

Больш инство классических методик основаны на ф ерментативный протеолизе клетокс последую щ ей депротеинизац ией (изб авление б елков) и переосаж дением Д Н К спиртом . О днако это м етод довольно трудоем ок и предполагает раб оту с таким и агрессивным и и им ею щ им и резкий запах вещ ествам и, какф енол ихлороф орм .

О дним из популярных внастоящ ее врем я является метод выделения Д Н К, основанный на использовании для лизиса клетоксильного хаотропного агента - гуанидина тиоц ионата (GuSCN) и последую щ ей сорб ц ии Д Н К на носителе (стеклянные б усы, диатомовая зем ля, стеклянное«м олоко» и т.д.). П ослеотмывоквпроб еостается Д Н К, сорб ированная наносителе, скоторого

данныйметод нелиш еннедостатков, такдаж енеб ольш иеколичества GuSCN могутингиб ировать П ЦР.

Д ругая группа м етодовпроб оподготовки основана на использовании ионооб м енников, которые, в отличие от стекла, сорб ирую т не Д Н К, а, наоб орот, примеси, меш аю щ ие реакц ии. Как правило, эта технология вклю чаетдвестадии: кипячениеоб разц а, врезультатечего клеточныестенки разруш аю тся, а нуклеиновыекислоты выходятвраствор; исорб ц ия прим есей на ионооб м еннике. М етод отличается простотой использования. В некоторых случаях необ ходим о введение дополнительных стадий об раб отки об разц а, посколькукипячениеневсегдаспособ ноэкстрагировать Д Н Киз клеток.

В случае, когда необ ходим о использовать РН К, м етодика подготовки материала претерпеваетнекоторыеизменения. В данном случаенеоб ходим о б олеетщ ательно следить за соб лю дением стерильности всех компонентови материалов, используем ых при выделении. Т акого рода м ероприятия связаны

значительной еедеградац ии. С терильность м атериала – главноеусловиепри выделении РН К, посколькуна поверхности рукчеловека находится б ольш ое количество РН Каз – ф ерментовразруш аю щ их РН К. П оэтом у растворы и используемыематериалы необ ходим оавтоклавировать перед использованием .

М етоды выделения сум марной РН К из клеток ж ивых организм ов сходны сметодам и, используем ым идля экстракц ииД Н К. О днаковпоследнее

14

врем я появились методе даю щ ие возм ож ность получать чистую мРН К б ез прим еси. Э ти м етоды какправило основаны на использовании различных ионооб менных см ол сковалентно связанным и поли-Т последовательностям и. И спользование таких ионоб м енниковпозволяет чистые препараты, где нет прим есейпосторонних вещ еств, ноизб авиться отдругих видовРН К.

П ослеполучения качественного препарата сум марной РН Кпроводится об ратная транскрипц ия. В основеэтого м етода леж итспособ ность ф ерм ента

принц ип ком плим ентарности. П риэтом вреакц иииспользуется несум марная РН К смеси, а только м РН К, что об условлено особ енностью ф ермента, способ ного узнавать м РН К по ее поли-А хвосту. Д ля иниц иац ии реакц ии синтезирования Д Н К ревертазе, необ ходим о наличие всмеси спец иальной затравки – олиго-дТ праймера. П рисоединяясь кполи-А хвосту м РН К, он об еспец иваетвозмож ность присоединения ф ерм ентасматриц ейипостроения

Эф ф ективность проц есса об ратной транскрипц ии невысока – около 10

%.О днако открываетдополнительныевозм ож ности визучении метаб олизм а нуклеиновых кислот клетки. П озволяет определить интрон-экзонный состав исследуемого об разц а, определить степень экспрессируем ости определенного генаим ногоедругое.

1.4 Опт имиз ац ия П ЦР-р еакц ии

К онц ент ра ц и я Ма гни я

Магний - необ ходимый коф актор для Д Н К-полимераз и конц ентрац ия

магния. Конц ентрац ия Д Н К-м атриц ы, агентоввоб разц е(например, Э Д Т А или

необ ходим ого своб одного магния, Taq полимераза неспособ на осущ ествлять реакц ию . И зб ытоксвоб одного м агния ум еньш аетспец иф ичность ф ерм ента и м ож ет увеличить уровень неспец иф ического продукта вреакц ии. П оэтом у,

Д Н К-полим еразы, м енее зависит от конц ентрац ии м агния, но оптимальная конц ентрац ия находится об ычно вдиапазоне2 - 6 м M, для раб оты Taq Д Н К- полимеразаоптим альнойявляется конц ентрац ия 1 - 3 мМ .

Н а основепроведенных исследованийпо подб оруконц ентрац иимагния для увеличения спец иф ичности реакц ии, показано, что при увеличении конц ентрац ии м агния вреакц ионной смеси происходит увеличение доли неспец иф ическогопродукта.

К онц ент ра ц и я фермент а

15

Реком ендуется использование1 - 1.25 единиц ы Taq Д Н К-полим еразы в

производительности амплиф икац ии необ ходимо проводить дополнительные ш аги, чтоб ы очистить Д Н К-м атриц у, для этого м ож но использовать извлечениеф енол/хлороф орм ом илиосаж дения этанола.

Количество м атриц ы, треб уемой для успеш ной амплиф икац ии зависит от слож ности об разц а Д Н К. Реакц ии со слиш ком маленьким количеством Д Н Кб удутиметь низковыход, втоврем я каквреакц иисослиш ком б ольш им количеством Д Н К-матриц ы мож нополучить неувеличениепродуктареакц ии, анаоб орот, сниж ениевыходаам плиф икац ии.

множ ество различных механизм ов. Э ти реактивы не б удут увеличивать все П ЦР реакц ии, их необ ходимо подб ирать опытным путем для каж дого случая.

Некоторыеиз таких вещ ествприведены ниж е.

Доб авление б етаина, дим етилсульф оксида и ф ормам ида м ож ет б ыть полезно при использовании «грязных» м атриц им атриц , которыеф орм ирую т вторичные структуры. Г рязные матриц ы м огут б ыть неэф ф ективны из-за

слаб ого разделения двух ц епей Д Н К или тенденц ии ф ормировать меж м олекулярные вторичные структуры, которые конкурирую т с отж игом

при об ычных условиях, дадутб олеевысокий проц ентвыхода П ЦР-продукта прииспользованиисоответствую щ их усиливаю щ их реагентов.

В некоторых случаях стаб илизирую щ ие агенты, такие как б ычий сывороточный альб ум ин (0.1 м г/мл), ж елатин (0.1 - 1.0 %) и неионогенные детергенты (0 - 0.5 %) м огут такж е усиливать ам плиф икац ию Д Н К. Э ти доб авкимогутувеличить стаб ильность полимеразы Д Н Киум еньш ить потерю реактивовиз-заадсорб ц иинастенкипроб ирки.

рассм атриваемыйскореекакказусныйзначительноеуменьш ениеколичества ц иклов реакц ии (до 25 - 30 ц иклов). Н о даж е при таком подходе риск получения лож нополож ительных илож ноотриц ательных результатоввелик.

В се реактивы рекомендуется хранить разлитым и на отдельные порц ии (аликвоты).

П ом им о стандартной реакц ии амплиф икац ии Д Н К, впоследнее врем я стали ш ироко использоваться и другие методы на основе полим еразной ц епной реакц ии, которые дали возм ож ность не только получать огромные количества необ ходим ой нуклеотидной последовательности, но и

17

1.6 П ЦРв р еальн о мвр емен и (Real Time PCR)

Д ля б олееточнойоц енкиколичестваД Н К-м иш енивреакц ионнойсм еси предприним аю тся спец иальные подходы, известные под об щ им названием полуколичественного П ЦР-анализа или П ЦР вреальном времени (РТ -П ЦР). П риставка «полу» имеетпринц ипиальное значение из-за условной точности результатовэтогоанализа.

К таким подходам следует отнести использование спец иального приб орного об еспечения всочетании с препаратам и спец иф ической Д Н К с

моделиам плиф икаторовкоторыепозволяю тследить закинетикойнакопления

1.П рим енениеин т ер калир ующ их флуо р есц ен т н ы х аген т о в,

флуоресц енц ия которых значительновозрастаетприсвязываниис

двуц епочечнойД Н К;

2.И спользованиемечен ы х флуо р есц ен т н ы ми аген т ами

олиго н уклео т идн ы х пр о б, ком плиментарных участкуП ЦР-продукта.

В качестве интеркалирую щ его красителя наиб олее часто использую т

SYBR Green. В технологиях TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler

использую тмеченыеолигонуклеотидныепроб ы.

SYBR Green об еспечиваетсам ый простой и самый эконом ичный способ для П ЦР вреальном времени. SYBR Green связывает двуц епочечной Д Н К, и

состоят в том , что это является недорогим , удоб ным , и чувствительным . Н еудоб ство - то, что SYBR Green связывается слю б ой двуц епочечной Д Н Кв реакц ии, вклю чая прайм ер-дим ер и другие неспец иф ические продукты реакц ии. Д ля отдельных П ЦР реакц ий разраб отанны праймеры SYBR Green которыем огутраб отать хорош овприсутствиинеспец иф ическогоф она.

TaqMan П ЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полим еразы. В реакц ионную смесь доб авляю т Д Н К-проб ы, м еченные на 5'- конц е ф луоресц ентным красителем , а на 3'-конц е - ф осф атной группой и гасителем ф луоресц енц ии. П роб ы ком плиментарны участкуам плиф иц ируем ой об ласти. Г аситель поглощ аетиспускаемоеф луоресц ентной м еткой излучение,

ф луоресц ентная м етка отделяется от гасителя, и ее свечение мож ет б ыть

18

детектировано. Т аким об разом , увеличение ф луоресц енц ии б удет прям о пропорц иональноколичествунараб отанногоП ЦР-продукта.

Рисунок4. П ринц ип TaqMan. А – зонд связансматриц ей, свечения нет; Б – отрывзондаотматриц ы подействием полим еразы, свечения ф лю ороф ора.

Molecular Beacons отличается от TaqMan тем , что конц ы проб ы (на

ком плим ентарности проб ы сматриц ей находится впетле. П ри гиб ридизац ии проб ы сматриц ейвторичная структура разруш ается, ф луоресц ентная метка и туш итель расходятся вразные стороны, и ф луоресц енц ия от метки мож ет б ыть детектирована.

20

1.7 Амплификац ия РН К

В озмож ность использования РН К в качестве миш ени для П ЦР сущ ественно расш иряет спектр прим енения этого метода. П ри выявлении РН К необ ходим о впервую очередь перевести ее вф орм у Д Н К. Д ля этого использую т ф ерм ент об ратную транскриптазу, который выделяю т из двух различных вирусов: Аvian myeloblastosis virus иMoloney murine leukemia virus.

И спользованиеэтих ф ерментовсвязано снекоторым и трудностям и. П реж де всего, они термолаб ильны и поэтом у м огут б ыть использованы при тем пературе не выш е 42°С . Т аккакпри такой тем пературе м олекулы РН К легко об разую т вторичные структуры, то эф ф ективность реакц ии заметно сниж ается ипоразным оц енкам приб лизительноравна5 %. Д анную проб лем у

м икроорганизм а Thermus Thermophilus (Tth Д Н К-полимераза), проявляю щ ую

Д ля проведения реакц ии об ратной трансрипц ии вреакц ионной смеси такж е, какивП ЦР, долж ны присутствовать праймеры вкачествезатравкии см есь 4-х дН Т Ф как«строительныйм атериал» исоответствую щ ую б уф ерную систем у. П осле проведения реакц ии об ратной транскрипц ии полученные м олекулы кД Н Км огутслуж ить м иш енью для проведения П ЦР.

1.8 П р имен ен иеП ЦР

Результаты, достигаемые с помощ ью П ЦР, позволили этом у методу занять ведущ ее м есто в м олекулярной б иологии как по популярности использования внаучных исследованиях ф ундаментального характера, таки

выявлять иидентиф иц ировать даж еоднонуклеотидныеизменения вструктуре

В озм ож ности, залож енныевметодеП ЦР, позволяю тдостигать максимальной спец иф ичности анализа, т.е. способ ности выявлять Д Н К конкретного