Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110

21

инф екц ионного агента вприсутствии Д Н К других м икроорганизм ови Д Н К

культивируем ых, некультивируемых ф орм микроорганизмов, поскольку этот метод позволяет изб еж ать слож ностей, связанных с выращ иванием таких микроорганизмоввлаб ораторных условиях. П рим енение П ЦР-диагностики такж е крайнеэф ф ективно вотнош ении возб удителей с высокой антигенной изм енчивостью ивнутриклеточных паразитов. С ледуетотметить, чтометодом П ЦР возмож но выявлениевозб удителей нетолько вклиническом м атериале,

применения методаП ЦР вклиническойдиагностикеимедиц инскойпрактике.

-высокая производительность;

-возм ож ность проведения реакц ии ам плиф икац ии и детекц ии водном приб оре, что сущ ественно сниж ает риск контаминац ии ампликонам и и значительносокращ аетрискош иб киоператора;

-возм ож ность количественной оц енки исходной Д Н К матриц ы (анализ экспрессигенов, хромосом ных транслокац ий, трансгенныйанализ);

-возмож ность анализаточечных м утац ий;

-регистрац ия иучетданных вэлектронном ф орм ате.

22

К ЛОН И РОВ АН И Е Д Н К

М етодом клонирования ф рагм енты Д Н К лю б ого вида, полученные с пом ощ ью рестриктаз, мож но ввести вплазмиду или вб актериоф аг, получив таким об разом , вектор молекулярного клонирования, а затем разм нож ить эти генетическиеэлем енты вклетках б актерииилидрож ж ей, увеличивая их число вм иллионы раз.

В страиваниеф рагментаД Н Квплазм идуосущ ествляется in vitro,а затем рекомби на нт на я ДНК вводится вклетки б актерии-хозяина. Н аиб олеечасто в

внесения внееД Н Киз культуральной среды. В молекулярной б иологии этот термин об означает стаб ильное изм енение генотипа и ф енотипа клетки. К онъюга ц и я об означает прямой перенос Д Н К из одной клетки (донора) в другую клетку (рец ипиент) через особ ый б елковый мостик (канал), возникаю щ ий м еж дуклеткам и. У Е. coli этотпереносзаним аетприм ерно 90

Т ра нсдукц и я происходит с участием б актериоф агов, которые вводят вД Н К

рекомб инантный ф аговый геном мож но клонировать непосредственно (в чаш ках П етри) на газоне клеток-хозяев, где об разую тся ф аговые б ляш ки. Затем их мож но ввести в клетки б актерий в виде изолированной Д Н К (трансф екц ия) либ о ввидереконструированных ф аговых частиц (инф екц ия). П роц едура получения рекомб инантных Д Н Ки их клонирования основана на

соб ственный переносиз одной клетки вдругую (F-плазмиды), другиенесут гены устойчивости кантиб иотикам (R-плазмиды) или спец иф ическиенаб оры генов, ответственных за утилизац ию необ ычных м етаб олитов (плазм иды деградац ии). Е сть плазм иды, вкоторых необ наруж ены гены, выполняю щ ие какие-то определенные ф ункц ии (критические плазмиды; от англ, cryptic -

23

скрытый, латентный). Разм еры плазмид варьирую тотменее 1 до б олее 500 т.п.н. Каж дая из них содерж ит сайт начала репликац ии (ori), б ез которого репликац ия плазмиды вклетке-хозяинеб ылаб ы невозмож на.

Н екоторые плазм иды представлены вклетке 10 - 100 копиям и; они называю тся высококопийным и. Н изкокопийные плазмиды присутствую т в клеткевчисле1 - 4 копий. Н а долю плазмиднойД Н Коб ычно приходится 0.1

– 5.0 % сум марной клеточной Д Н К. Е сли двеили б олееплазм иды нем огут сосущ ествовать водной и той ж еклетке, то говорят, что они принадлеж атк одной группе несовм естим ости. П лазм иды, относящ иеся кразным группам

об наруж енодо8 - 10 разных плазмид, приэтом каж дая из них выполняласвои ф ункц ии, б ылапредставленахарактерным для неечислом копийиотносилась к своей соб ственной группе несовм естим ости. О дни плазм иды несут спец иф ичный сайтиниц иац ии репликац ии и могутреплиц ироваться только в

в качестве вектора для переноса клонируем ой Д Н К. Н о довольно часто

Пла змидны й вект о р pBR322

Плазмидный вектор pBR322 один из универсальных векторов. О б ычно

об означение плазмидного вектора вклю чает строчную б укву p (от англ, plasmid) и ещ енесколько б укв, им ею щ их отнош ениекописанию вектора или кистории его создания. Т ак, б уквы BR воб означении плазмиды pBR322 указываю тна авторство . Боливара и Р. Родригеса, сконструировавш их эту

тетрац иклину(Tet), a такж еуникальныесайты для BamHI, HindIII иSalI вгене Т еt, один PstI-сайт в гене Аmр, один сайт для EcoRI, находящ ийся за пределам и кодирую щ их последовательностей, и сигнал начала репликац ии, об еспечиваю щ ий репликац ию исклю чительно в E. coli. П лазмида

24

реплиц ируется с об разованием б ольш ого числа копий, в другие б актериальныеклеткипереносится струдом .

Рисунок7. С хем а строения плазмидного вектора pBR322. ori – точка начала репликац ии, стрелкойоб означенонаправлениерепликац ии; Amp иTet

– гены устойчивостиуам пиц иллинуитетрац иклину.

единственном сайте, располож енном водном из геновустойчивости ктом у или другом у антиб иотику, то об разуется линейная м олекула с липким и конц ам и. Т акиемолекулы смеш иваю тсдонорной Д Н К, содерж ащ ей нуж ный генипредварительнооб раб отаннойтакойж ерестриктазой. П осколькулипкие

ф ага Т 4 вприсутствии АТ Р, врезультатечего об разуется м нож ество разных ком б инац ий ф рагментов, а такж е неж елательные продукты, в частности

сш ить конц ы деф осф орилированнойлинейнойплазмиднойД Н К. Ч токасается

ф осф одиэф ирным исвязям и, об разовавш им ися спомощ ью Д Н К-лигазы м еж ду деф осф орилированной плазм идной Д Н Ки рестриц ированной донорной Д Н К. П осле репликац ии втрансф орм ированной клетке одноц епочечные разрывы устраняю тся системойлигирования клетки-хозяина.

25

Рисунок 8. А) об разованием липких конц оврестриктазой EcoRI. Б) С хем аоб разования гиб риднойплазмиды.

Т ра нсфо рма цияи о т б о р

Т еперь необ ходим о ввести реком б инантную Д Н К в клетку-хозяина. Э тот проц есс называется трансф ормац ией. Д ля его осущ ествления использую тспец иально разраб отанныеприем ы, например подвергаю тклетки высокотем пературном увоздействию иоб раб атываю тих хлористым кальц ием (С аС 12), О днако эф ф ективность трансф орм ац ии все ж е остается невысокой, об ычно трансф ормируется неб олееодной клетки из тысячи. Т аким об разом ,

ф осф атазой, вдругих - неплазм идная Д Н Килиш ь внекоторых - плазмида со встроенным ф рагментом чуж ероднойД Н К(гиб ридная плазмида).

Как м ы уж е говорили, внехромосом ная Д Н К, не содерж ащ ая точки началарепликац ии, нем ож етреплиц ироваться вб актериальнойклетке. Т аким об разом , проникновениевклеткуэкзогенной Д Н К, ещ енеозначает, что она б удет поддерж иваться в хозяйской клетке. Д алее, для сохранения реком б инантной Д Н К вклетке-хозяиневпервоначальном виденеоб ходим о, чтоб ы вклеткеотсутствовали гены, кодирую щ иесинтез рестриктаз, которые могутпривести кеедеградац ии, и чтоб ы клетка им ела ф енотип RecA– (такие клетки неспособ ны коб щ ей реком б инац ии, такчто экзогенная Д Н Кнеб удет

реком б инантную Д Н К. С пособ идентиф икац иидолж енб ыть какм ож но б олее простым , посколькуприходится проверять огром ноечисло клеток. В систем е

26

pBR322, в которой чуж еродная Д Н К встраивается в сайт В а mHI, спец иф ическая идентиф икац ия состоитиз двух этапов. С начала клетки после трансф орм ац иивысеваю тнапитательную среду, содерж ащ ую ам пиц иллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, вкоторых присутствует интактный ген Аmр — или всоставе интактной плазм иды pBR322, или в составегиб риднойплазм иды; нетрансф орм ированныеклеткичувствительны к

pBR322, несутгенTet иустойчивы каккампиц иллину, такиктетрац иклину. Н а втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки,

выросш ие на среде с ампиц иллином , переносят на среду с тетрац иклином м етодом перепечатки. Клетки, об разую щ ие колонии на чаш ках с тетрац иклином , содерж ат интактную плазм иду pBR322, поскольку, какм ы уж еговорили, ониустойчивы икам пиц иллину, иктетрац иклину. Клетки, не выросш иена чаш ках стетрац иклином , чувствительны кэтом у антиб иотику,

которые оказались чувствительны к тетрац иклину, и из каж дой колонии получаю т индивидуальные клеточные клоны или об ъединяю т все колонии, устойчивые к ампиц иллину и чувствительные к тетрац иклину, и культивирую тих вм есте. Д алеемож но провести дополнительный скрининг и идентиф иц ировать теклетки, которыенесутгиб ридную плазмидуpBR322 со спец иф ическойвставкой. П рисутствиесайтовHindIII иSalI в генеTet исайта

порядке, т. е. сначала высеваю тклетки на средустетрац иклином , а затем - с ам пиц иллином .

27

Рисунок9. Клонирование Д Н К вб актериальную клетку и наращ ивание массы культуры.

Д ругие п ла змидны е вект о ры

И дея использовать pBR322 каквектор для клонирования б ыла вполне удачной, но эта плазм ида содерж ит лиш ь несколько сайтоврестрикц ии, а отб ор трансф ормированных клетокзаним ает много времени. Э то привело к необ ходимости разраб отки альтернативных систем клонирования. Н апример, плазмида pBluescript SK (+/-) длиной 3 т.п.н. содерж ит: ген устойчивости к ампиц иллину; регулируемый сегм ентгена β-галактозидазы (lacZ') лактозного

репликац ииплазмиды pUC 19.

П ри отб оре трансф орм ированных клетокруководствую тся следую щ им и

тиогалактопиранозида (И П Т Г ), который является индуктором lac-оперона, то

28

продукт гена lad не см ож ет связаться с промоторно-операторной об ластью гена lacZ', и какследствие б удут происходить транскрипц ия и трансляц ия плазм идного ф рагм ента гена lacZ'. П родукт этого ф рагмента свяж ется с

ф ункц иональной β-галактозидазы, и если всредеприсутствуетеесуб страт5- б ром -4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), то он б удет гидролизоваться под действием этого ф ерм ента с об разованием продукта

Рисунок10. С хем а строения плазм идного вектоар pBluescript. LacZ – ген, кодирую щ ийф ерм ентß-галактозидазу.

использую т об разовавш ийся продукт для трансф орм ац ии клеток, которые м огутсинтезировать тучасть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с

гиб ридную плазмиду, об разую тнатойж есамойсредеб елыеколонии.

29

С Е К В Е Н И РОВ АН И Е Д Н К

В аж ность определения нуклеотидных последовательностей Д Н К уж е давно не вызывала никаких сомнений. В озмож ность получения б лагодаря разраб отанным м етодам секвенирования Д Н Кпринц ипиальноновых сведений в виде генетических текстов, ранее недоступных, оказала значительное влияниена дальнейш ееразвитиенетолькосамойм олекулярнойб иологии, но иоб щ ейб иологииидругих см еж ных об ластейзнаний.

Классическием етоды секвенирования Д Н К хим ической деградац ией и

треб ую т разделения м еченых ф рагм ентовД Н К, отличаю щ ихся но длине на один нуклеотид, в полиакрилам идном гель-электроф орезе высокого разреш ения. В сесоставляю щ иепроц ессасеквенирования Д Н Коб оих м етодов значительноразличается иподвергается постояннойм одиф икац ии.

3.1 М ет о дпо лимер аз н о го ко пир о ван ия (мет о дС эн гер а)

структура которого изучается. П ри этом об язательным является выполнение

осущ ествлять четырераза, каж дыйраз останавливая егопоочереднонакаком - либ о одном из четырех моном ё рных звеньев(A, Г , Ц или Т ). О пределение длины каж дой копии позволяетустановить полож ениеданного мономерного

чать инф орм ац ию о полож ении определенного моном ерного звена вц епи полинуклеотидапрямопослеф ракц ионирования.

тативного синтеза вкачестве нуклеозидного компонента олигонуклеотидазатравки. Т акой олигонуклеотид во всех копиях, об разую щ ихся врезультате достраивания его ф ерм ентативным путем , остается постоянным 5'-конц евым

30

затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и вклю чая полную копию изучаемого полинуклеотида. В идеалесмесь долж навклю чать всевозм ож ные

последовательности. Н апрактикеразличныекомпоненты смесиприсутствую т вразных количествах. Е сли такую см есь далееподвергнуть электроф орезу в полиакрилам идном гелевопределенных условиях, когда скорость движ ения

Рисунок 11. И спользование ф ерментативного синтеза олиго(поли)дезоксириб онуклеотидовдля определения первичной структуры Д Н К.

И нкуб ац ионную см есь 32Р-м еченных олигонуклеотидов различной длины ввиде комплексовс матричным полинуклеотидом подвергаю т гель- ф ильтрац ии для удаления дезоксириб онуклеозид-5'-триф осф атови аликвоты реакц ионнойсмесиреинкуб ирую тсД Н К-полимеразойвразличных условиях.